一種共光路幹涉相位顯微一次成像系統及方法與流程

2023-06-10 13:31:36 2

本發明屬於生物細胞成像技術研究領域，具體涉及一種共光路幹涉相位顯微一次成像系統及方法。

背景技術：

在觀測的生物樣品中，如活細胞，可以當成是透明的來處理，並且這些細胞通常表現為相位物體。為了能夠清楚的觀測到這些相位物體，通常的做法是將相位信息轉換為強度分布，這也就導致了相位顯微成像的出現。在最近的十幾年中，由於各種應用定量相位顯微成像的技術被不斷提出，這就為研究類似於生物細胞的相位物體的組織結構和動力學行為提供了極為重要的研究手段，而相位顯微成像技術基本上是應用光的幹涉原理來工作，所以也可以稱此類技術為幹涉相位顯微成像技術。這些技術包括離軸幹涉、同軸幹涉和輕微離軸幹涉。

對相位物體的光學檢測技術主要基於幹涉原理。幹涉顯微從結構上可劃分為：物光與參考光分離的幹涉顯微和物光與參考光共路的幹涉顯微。物、參分離的幹涉顯微方法主要有：Michelson幹涉顯微；Linnik幹涉顯微和Mach-Zehnder幹涉顯微等。Michelson幹涉顯微的基本原理是，入射光透過顯微物鏡到分光鏡被分成兩束光，一束為投射到參考鏡的參考光，另一束為透射到樣本表面的物光，兩束光經過反射，並在顯微物鏡的視場上發生幹涉。該結構的特點是，物光與參考光經過同一個顯微物鏡，兩束光不會由於物鏡的差異而產生光程差。但是，顯微物鏡與樣本之間加入了分光鏡，這樣就使顯微物鏡的工作距離比另兩種裝置更長，進而限制了物鏡的放大倍數，同樣也限制了數值孔徑的大小，這就直接導致了儀器的橫向解析度降低。Linnik幹涉顯微的基本結構是它的物光和參考光分別有一個顯微物鏡，光線透過顯微物鏡就直接到樣品表面，因為其與樣品表面之間沒有其它光學元件，所以該裝置的放大倍數可以很大，工作距離可以很短，並且能夠達到0.5μm的橫向解析度。但是該裝置物光和參考光的顯微物鏡的差異會產生額外的光程差，這將影響真實的觀測結果。Mach-Zehnder幹涉顯微的基本結構是該裝置只使用了一個顯微物鏡，參考鏡則放置在主光路中，這樣就使得物光光路和參考光路的工作條件非常接近，結構設計上也更加緊湊，同時可以排除許多幹擾因素。基於這些主要顯微成像原理，國內外科學家進行了拓展研究，如：專利技術CN 102914258 A基於正交雙光柵的同步移相干涉顯微檢測裝置及檢測方法，該技術利用平行雙光柵將正交偏振的物光和參考光分束，結合偏振調製通過一次曝光獲得兩幅相移幹涉圖。雖然該方法可以實現實時測量，但由於採用離軸光路不能充分利用CCD的功能，且物參光間若存在夾角將會使數據處理的工作變得複雜；又如專利CN 103115582 A基於受激輻射的麥可遜螢光幹涉顯微測量裝置，該發明通過鍍膜改變被測面的表面特性，保證測量光經被測面反射後能夠返回探測系統，解決了高NA和高斜率表面檢測的難題，但是該光路本身具有橫向解析度較低的缺陷，且儀器的成本較高。並且在物光與參考光分離的幹涉顯微中，環境的擾動會對物光與參考光造成不同的影響，從而影響兩者之間的光程差的穩定性，最終對測量精度產生影響。

在共光路實驗裝置中，可以通過調節分光鏡的分光層與光軸之間的夾角大小實現物光和參考光之間的同軸幹涉或離軸幹涉。物、參共路幹涉顯微主要有：Fizeau幹涉顯微、澤尼克相襯幹涉顯微、剪切幹涉顯微和點衍射相位顯微技術等。斐索幹涉顯微Fizeau interferometer是利用準直的平行光在樣品表面反射後與入射光發生幹涉，通過記錄的等厚幹涉條紋的形狀分布反映被檢樣品表面的形貌分布。澤尼克相襯幹涉顯微原理是採用環狀光來照明樣品,同時採用環狀相位掩模板來延遲零頻分量的相位,從而使被測樣品的相位信息變成強度信息。在相襯顯微方法中所用的部分相干的環狀光束照明大大降低了成像中的相干噪聲,且提高了顯微鏡的橫向解析度。剪切幹涉法是通過某種元件，將一個空間相干的波面分成兩個完全相同或相似的波面，二者彼此間產生小的空間位移。因為兩個波面上各點相干，在重疊區域會形成一組幹涉條紋，通過處理該幹涉條紋就可以獲得原始波面的信息。點衍射幹涉術的基本原理是當包含樣品信息的入射光波經過聚焦透鏡後，根據透鏡的傅立葉變換特性，該光束的頻譜出現在聚焦透鏡的後焦平面且零頻分量位於頻譜面的中央，而高頻分量分布於零頻分量的周圍。如在專利CN 104034257 A一種菲索型準共光路結構的同步相移幹涉測量裝置及方法，該技術解決了同步相移幹涉用於共光路幹涉系統的難題，使系統中光學元件所存在的應力雙折射效應所造成的相位測量誤差大大降低；又如專利CN 102221327 A基於澤尼克相襯成像的相移幹涉顯微裝置及方法，該發明解決了現有澤尼克相襯成像只能用於定性觀察的局限性，同時克服了現有幹涉顯微方法對環境振動較敏感穩定性差、相干噪聲高、橫向解析度低等技術問題。但是這些幹涉顯微裝置在使用過程中需要較多的光學元器件，特別是顯微鏡系統，實驗成本較高，且對使用人員的專業素養要求高，所以應用門檻較高。

本發明是基於共光路的幹涉顯微，所以其優點在於它的抗幹擾能力強，不會產生額外的光程差，而與其他共光路裝置相比，本發明的裝置結構簡單，成本低廉，且操作方便，可以實現同軸幹涉、離軸幹涉和輕微離軸幹涉。

技術實現要素：

本發明的目的是針對上述問題提供一種共光路幹涉相位顯微一次成像系統及方法，使該裝置能同時適用於同軸與離軸幹涉，也包括輕微離軸幹涉，在單次曝光下採集到幹涉圖，經計算機處理後可以實現相位物體快速相位顯微成像。

本發明的技術方案是：一種共光路幹涉相位顯微一次成像系統，包括雷射器、中性可調衰減器、擴束準直器、半透半反鏡、視場光闌、非偏振分光稜鏡、反射載物臺、樣品、顯微物鏡、第三透鏡、CCD和計算機；

所述雷射器、中性可調衰減器、擴束準直器、半透半反鏡依次放置在同一光路上；所述視場光闌非偏振分光稜鏡、反射載物臺依次放置在半透半反鏡的垂直下方，所述樣品放置在反射載物臺上的一側；所述半透半反鏡的鏡面與水平方向成45°；用於分光的非偏振分光稜鏡的分光層與水平方向垂直；可調反射載物臺的平面與水平面平行；所述顯微物鏡、第三透鏡和CCD依次放置在半透半反鏡的垂直上方，計算機與CCD電連接；

所述雷射器發出的水平方向的光束，向前傳輸經過中性可調衰減器調節到合適的光強，再經過擴束準直器擴束準直後，向半透半反鏡傳輸，雷射經過半透半反鏡的反射面改向為豎直向下的光束，雷射通過視場光闌把雷射束調節到合適的大小後傳輸向非偏振分光稜鏡，非偏振分光稜鏡把雷射束平均分為兩束豎直向下的平行光，這兩束光照射向反射載物臺和載物臺上的樣品；樣品光與參考光通過反射載物臺全反射向非偏振分光稜鏡，又經過非偏振分光稜鏡的合束並產生幹涉，通過半透半反鏡，由其後的的顯微物鏡放大，再由第三透鏡準直為平行光，最終在CCD上形成相移幹涉圖，並傳輸、顯示在計算機上。

上述方案中，所述半透半反鏡用石英玻璃製成，分光面為鍍膜半反射、半透射的迎光束面，各為入射光強度的50％。

上述方案中，所述載物臺為一個角度可調的全反鏡，光軸與非偏振分光稜鏡的分光層之間的夾角可通過載物臺調節。

上述方案中，所述視場光闌可調節光束的大小，使幹涉圖像的大小不超過CCD的記錄靶面。

上述方案中，所述擴束準直器包括第一透鏡和第二透鏡。

一種利用所述的共光路幹涉相位顯微一次成像系統進行成像的方法，包括以下步驟：

步驟S1、所述雷射束髮出的水平方向的光束，向前傳輸經過中性可調衰減器調節至合適光強後，利用擴束準直器將照明光束擴束準直為大小合適的平行光；

步驟S2、光束經半透半反鏡反射為豎直向下並向非偏振分光稜鏡傳輸，在這兩個裝置中間放置一個大小合適的視場光闌使得成像區域的大小不超過CCD記錄靶面的面積，又經非偏振分光稜鏡分光為物光和參考光兩束豎直向下的光束，照射到反射載物臺上；前面所述的物光照射到樣品上作為樣品光，而參考光則被反射載物臺全反射後直接原路返回；

步驟S3、物參反射光束經過非偏振分光稜鏡合束後，物光和參考光之間發生幹涉，並原路返回經過視場光闌和半透半反鏡，再經過顯微物鏡放大後，由第三透鏡準直為平行光，最終在CCD上形成相移幹涉圖，並傳輸到計算機裡，經計算機處理後顯示。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

1、本發明通過採用非偏振分光稜鏡對雷射束進行分光，該分光裝置結構簡單，易於操作；

2、本發明採用差分幹涉光路保證了本發明系統的可靠性與穩定性；

3、本發明系統結構簡單，成本低廉、實驗操作方便；

4、本發明中外界環境的擾動對幹涉儀中的物光和參考光造成相同的影響，因而在最終記錄時這些外界因素的影響將被相互抵消，從而使得該類幹涉儀的抗幹擾能力增強；

5、本發明中顯微物鏡位於幹涉系統之後，可減少相位噪聲。因此，本發明系統應用面廣，具有很好的實用價值。

附圖說明

圖1是本發明一實施方式的共光路幹涉相位顯微一次成像系統及方法對應的光路示意圖。

圖中：1：雷射器；2：中性可調衰減器；3：擴束準直器；4：半透半反鏡；5：視場光闌；6：非偏振分光稜鏡；7：反射載物臺；8：樣品；9：顯微物鏡；10：第三透鏡；11：CCD；12：計算機；R：參考光束；O：樣品光束。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細說明，但本發明的保護範圍並不限於此。

本發明是一種基於物、參共光路的幹涉顯微成像裝置及一次成像的方法，基於差分幹涉光路，採用非偏振分光鏡把雷射分為物光與參考光兩束平行光，再利用反射載物臺全反射物光與參考光，物光和參考光經非偏振分光稜鏡合束後以共光路的方式傳播，後經顯微物鏡放大，最終被CCD相機採集並傳輸到計算機裡，通過相應的軟體進行樣品圖像的後處理。本發明可以通過調整反射載物臺的角度實現現有的光路幹涉成像系統，其中包括離軸幹涉、同軸幹涉和輕微離軸幹涉。本發明在相位顯微方面具有廣泛的實用價值與應用前景，特別是在生物細胞形態識別應用領域。

圖1所示為本發明所述共光路幹涉相位顯微一次成像系統及方法的一種實施方式，所述一種共光路幹涉相位顯微一次成像系統，包括雷射器1、中性可調衰減器2、擴束準直器3、半透半反鏡4、視場光闌5、非偏振分光稜鏡6、反射載物臺7、樣品8、顯微物鏡9、第三透鏡10、CCD11和計算機12。

所述雷射器1、中性可調衰減器2、擴束準直器3、半透半反鏡4依次放置在同一光路上；所述視場光闌5非偏振分光稜鏡6、反射載物臺7依次放置在半透半反鏡4的垂直下方，所述樣品8放置在反射載物臺7上的一側；所述半透半反鏡4的鏡面與水平方向成45°；用於分光的非偏振分光稜鏡6的分光層與水平方向垂直；可調反射載物臺7的平面與水平面平行；所述顯微物鏡9、第三透鏡10和CCD11依次放置在半透半反鏡4的垂直上方，計算機12與CCD11電連接。

所述雷射器1發出的水平方向的光束，向前傳輸經過中性可調衰減器2調節到合適的光強，再經過由第一透鏡和第二透鏡組成的擴束準直器3擴束準直後，向半透半反鏡4傳輸，雷射經過半透半反鏡4的反射面改向為豎直向下的光束，雷射通過視場光闌5把雷射束調節到合適的大小後傳輸向非偏振分光稜鏡6，非偏振分光稜鏡6把雷射束平均分為兩束豎直向下的平行光，這兩束光照射向反射載物臺7和載物臺上的樣品8；樣品光與參考光通過反射載物臺7全反射向非偏振分光稜鏡6，又經過非偏振分光稜鏡6的合束並產生幹涉，通過半透半反鏡4，由其後的的顯微物鏡9放大，再由第三透鏡10準直為平行光，最終在CCD11上形成相移幹涉圖，並傳輸、顯示在計算機12上。

所述半透半反鏡4用石英玻璃製成，分光面為鍍膜半反射、半透射的迎光束面，各為入射光強度的50％，並與水平方向成45°角，實現把光束由水平反射為豎直向下。

所述載物臺7為一個角度可調的全反鏡，使光軸與非偏振分光稜鏡6的分光層之間的夾角可調，可實現同軸、離軸和輕微離軸幹涉的光路調節。

所述視場光闌5是用於調節光束的大小，使最終形成的幹涉圖像的大小不超過CCD11的記錄靶面。

本發明還提供一種利用所述的共光路幹涉相位顯微一次成像系統進行成像的方法，包括以下步驟：

步驟S1、所述雷射束1發出的水平方向的光束，向前傳輸經過中性可調衰減器2調節至合適光強後，利用擴束準直器3將照明光束擴束準直為大小合適的平行光後照明樣品；

步驟S2、光束經半透半反鏡4反射為豎直向下並向非偏振分光稜鏡6傳輸，在這兩個裝置中間放置一個大小合適的視場光闌5使得成像區域的大小不超過CCD記錄靶面的面積，又經非偏振分光稜鏡6分光為物光和參考光兩束豎直向下的光束，照射到反射載物臺7上；前面所述的物光照射到樣品8上作為樣品光，而參考光則被反射載物臺7全反射後直接原路返回；

步驟S3、物參反射光束經過非偏振分光稜鏡6合束後，物光和參考光之間發生幹涉，並原路返回經過視場光闌5和半透半反鏡4，再經過顯微物鏡9放大後，由第三透鏡10準直為平行光，最終照射到CCD 11的記錄靶面上，並將數據傳輸到計算機12裡，經由相應的軟體處理後在計算機12上顯示。

本發明的工作原理如下：

雷射束1沿水平方向傳輸，經過中性可調衰減器2調節至合適光強後，利用擴束準直器3將照明光束擴束準直為大小合適的平行光後照明樣品，光束經半透半反鏡4反射為豎直向下傳輸向非偏振分光稜鏡6，在這中間放置一個大小合適的視場光闌使得成像區域的大小不超過CCD記錄靶面的面積，經非偏振分光稜鏡6分光為物光和參考光兩束豎直向下的光束，照射到反射載物臺7上；物光照射到樣品8上作為樣品光，而參考光則被反射載物臺7全反射後直接原路返回；物參反射光束經過非偏振分光稜鏡6合束後，物光和參考光之間發生幹涉，並原路返回經過視場光闌5和半透半反鏡4，再經過顯微物鏡9放大後，由第三透鏡10準直為平行光，最終照射到CCD 11的記錄靶面上，CCD 11將數據傳輸到計算機12裡，最後通過對應的軟體就可在計算機12上實現定量相位成像。在整個裝置中反射載物臺7通過旋轉可改變光束光軸的方向，由此可根據需要，觀察採集到的幹涉圖像來調整反射載物臺7的角度，實現自由切換同軸幹涉、離軸幹渉和輕微離軸幹涉。

應當理解，雖然本說明書是按照各個實施例描述的，但並非每個實施例僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。

上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發明的可行性實施例的具體說明，它們並非用以限制本發明的保護範圍，凡未脫離本發明技藝精神所作的等效實施例或變更均應包含在本發明的保護範圍之內。