一種山竹快繁培養方法

2023-05-29 10:08:06

一種山竹快繁培養方法
【專利摘要】本發明涉及植物組織培養技術，公開了一種山竹快繁培養方法，包括以下步驟：(1)外植體表面滅菌；(2)不定胚的誘導階段；(3)外植體增殖階段；(4)再生芽誘導生根。應用本發明所述的山竹快繁培養方法繁育山竹種苗，增殖係數可達5.4左右，所得試管苗保留了母本植株的優良特性，不會產生性狀分離現象，種苗生長狀況良好。1粒種子經1年培養可產生1500株左右山竹種苗，達到快速、大量繁育山竹種苗的目的，對山竹種植產業具有重大的實際意義。
【專利說明】一種山竹快繁培養方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物組織培養【技術領域】，特別是指一種山竹快繁培養方法。

【背景技術】
[0002] 山竹（Garcinia Mangostana L.)的傳統繁育可通過種子繁育，但山竹種子的活力 不能長時間維持，而且山竹種子繁育係數低，種子數量少，1個果實最多產生2個種子（很多 果實沒有種子），這些因素嚴重局限了山竹的快速、大量繁育。另外，由於山竹果樹自身特 性，不能周年生產種子，造成種子供應不足；其次，實生苗需要10-15年才開花掛果，生長周 期長，產業發展成本高，難以滿足市場的需求。山竹繁殖過程中，也有通過嫁接方法將良種 接穗接到實生苗上進行改良。如陳兵等2014年6月發表在《廣東農業科學》雜誌上的論文 《海南山竹子種苗繁育技術》，介紹了山竹子實生苗和嫁接苗的繁育技術。雖然有觀察到可 以通過雖然通過嫁接可以使山竹提前結果現象，但由於接穗和砧木之間親和能力問題，一 旦遇到大風，容易引起嫁接部位出現斷裂、折斷等問題，因此嫁接的方法在繁育山竹種苗上 也存在很大的局限性。此外，還有報導選用1年生的種子苗的帶芽點的枝條，浸泡生根劑， 在溫室沙床中扦插繁殖山竹種苗。雖然扦插枝條很容易生根，但小的種苗有芽點數目較少， 繁育係數極低，也很難實現山竹種苗的大規模繁育。
[0003] 不定胚是與受精卵具同樣形態變化過程的植物體細胞形成的胚。栽培品種的山竹 僅開雌花，少有雄花。由於山竹是孤雌生殖，沒有分化成胚形式，而形成不定胚，缺乏品種變 異。而山竹種子具有獨特的結構，種子兩端是通過兩個薄的形成層連接著的沒有分化良好 的胚芽和胚根。種子萌發時，芽從原形成層的一端形成，而根從種子另一端長出。由於其存 在的單性特殊生殖方式和種子結構，山竹的不定胚保存了母本的性狀，並且可以穩定遺傳， 不會產生品種變異的現象，因此，山竹不定胚的研究對於規模化培育山竹種苗具有重要意 義。


【發明內容】

[0004] 為了克服山竹種子繁育係數低而其它繁育方法在山竹繁育產業中存在的不足， 本發明提出了一種山竹快繁培養方法。
[0005] 本發明的技術方案是這樣實現的：
[0006] -種山竹快繁培養方法，包括以下步驟：
[0007] (1)外植體表面滅菌
[0008] 從成熟山竹果實中獲取的山竹種子，用加有洗衣粉或洗潔精的水溶液洗滌或流水 衝洗2_5h ;再用酒精浸蘸5-30s，邊浸蘸邊搖動山竹種子，無菌水衝洗；最後在含有次氯酸 鈉和吐溫80的消毒液中浸泡15-20min,邊浸泡邊搖動山竹種子,無菌水衝洗,備用；
[0009] (2)不定胚誘導階段
[0010] 經過步驟⑴處理的山竹種子切塊，轉入MS培養基中進行誘導培養；
[0011] (3)外植體增殖階段
[0012] 外植體轉入WPM培養誘導不定芽；待不定芽長出葉片，培養後取葉片橫切3-5mm， 培養40-60d產生芽點；芽點生長成再生芽時從外植體切除轉入增殖培養基進行增殖培養；
[0013] (4)再生芽誘導生根
[0014] 當再生芽長到13-17mm時，轉入生根培養基誘導生根，培養後移到苗圃進行假植。
[0015] 進一步，所述步驟（1)所用洗衣粉或洗潔精水溶液質量濃度為1-3%，酒精的體積 濃度為65-75%，次氯酸鈉的體積濃度為5-8%，吐溫80的體積濃度為0. 1-0. 3%。
[0016] 進一步，步驟（2)所述山竹種子不定胚分離成3-6塊。
[0017] 進一步，步驟⑵所用培養基為添加質量濃度為0· 3-0. 8mg/L的NAA和0-5mg/L 的BA的MS培養基，或添加質量濃度為2. 0-4. Omg/L的2, 4-D和0-5mg/L的BA的MS培養 基，光照時間8-12h/d進行誘導培養。
[0018] 進一步，步驟（3)培養外植體長出葉片所用的培養基為添加質量濃度2-6mg/L的 BA、10-30g/L的蔗糖和2-3g/L的Phytagel的WPM培養基，葉片培養30-50d後進行橫切； 再生芽增殖培養基為添加質量濃度為0. 9-1. 3mg/L的BA的WPM培養基。
[0019] 進一步，步驟（3)培養外植體長出葉片所用的培養基為添加4-5mg/L的BA、 15-25g/L的蔗糖、2. 4-2. 6g/L的Phytagel的WPM ;再生芽增殖培養基為添加質量濃度為 I. O-L 2mg/L 的 BA 的 WPM 培養基。
[0020] 進一步，步驟（3)所述再生芽高度在5-6_時切除。
[0021] 進一步，步驟⑷所述生根培養基為添加質量濃度為0. 1-1. 〇mg/L的IBA的1/2MS 培養基，培養條件為光照強度2000Lx，光照時間8-12小時/天，培養時間為40-60d。
[0022] 進一步，步驟（4)試管苗莖高5-7cm，根長3-5cm移到苗圃進行假植。
[0023] 本發明的有益效果：
[0024] 本發明利用山竹孤雌生殖的特性，其不定胚作為外植體不會出現後代性狀分離的 現象，通過本發明所述的快繁培養方法，增殖係數為5. 4左右，能夠快速、大量培育山竹種 苗，彌補了山竹採用種子繁殖、嫁接、扦插等方法繁殖存在的繁殖係數低、生長周期長、種苗 抗風性差等問題，所生產的種苗保留了母本植株的優良特性，生長狀況良好，不會產生性狀 分離現象，1粒山竹種子經1年培養可產生1500株山竹種苗，大大提高了山竹的繁殖速度， 能夠實現快速、穩定繁育山竹種苗的目的，對山竹種植產業具有重大的實際意義。

【具體實施方式】
[0025] 下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通 技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範 圍。
[0026] 實施例1
[0027] -種山竹快繁培養方法，包括以下步驟：
[0028] (1)外植體表面滅菌
[0029] 從成熟山竹果實中獲取的山竹種子，用加有質量濃度1 %洗衣粉或洗潔精的水溶 液洗1-2次或流水衝洗l_5h ;再用體積分數65 %的酒精浸蘸5-15s，邊浸蘸邊搖動山竹種 子，無菌水衝洗2-4次；最後在體積濃度5 %次氯酸鈉和體積濃度0. 1 %吐溫80的消毒液中 浸泡15-20min，邊浸泡邊搖動山竹種子，無菌水衝洗3-5次，經過表面消毒、滅菌後的山竹 種子備用；為避免山竹種子活性降低，從果實中取出的種子需在5d內處理完成；
[0030] (2)不定胚的誘導培養
[0031] 經過步驟（1)處理過的山竹種子切成3塊，轉入MS培養基中誘導培養，光照時間 為 8h/d，培養基中添加 0· 3mg/L 的萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid, NAA) ; (3)誘導組 織的增殖
[0032] 外植體轉入木本植物用培養基（Woody Plant medium，WPM培養基）培養誘導不定 芽，WPM培養基含有質量濃度為2mg/L BA、10g/L蔗糖和2g/L Phytagel，不定芽培養長出 葉片後培養30d，取葉片橫切3-5mm培養，MS培養基培養40d後，每片葉片外植體可產生50 個左右的芽點；每個芽點可長成一個再生芽，再生芽高度在5-6_時，發育出芽的基本結構 後，從外植體切除，在0. 9mg/L BA的WPM培養中進行增殖培養；
[0033] (4)再生芽誘導生根
[0034] 當再生芽長到13mm時，在1/2MS培養基中添加0. lmg/L的IBA，2000Lx光照條件 下8小時/天，進行生根誘導，培養45天後，待試管苗莖高5-7cm、根長3-5cm後移到苗圃進 行假植。
[0035] 實施例2
[0036] -種山竹快繁培養方法，包括以下步驟：
[0037] (1)外植體表面滅菌
[0038] 從成熟山竹果實中獲取的山竹種子，用加有質量濃度2 %洗衣粉或洗潔精的水溶 液洗1-2次或流水衝洗l_5h ;再用體積濃度70%的酒精浸蘸10-20s，邊浸蘸邊搖動山竹 種子，無菌水衝洗2-4次；最後在體積濃度7 %次氯酸鈉和0. 2 %吐溫80的消毒液中浸泡 15-20min，邊浸泡邊搖動山竹種子，無菌水衝洗3-5次，經過表面消毒、滅菌後的山竹種子 備用；為避免山竹種子活性降低，從果實中取出的種子需在5d內處理完成；
[0039] (2)不定胚的誘導培養
[0040] 經過步驟⑴處理過的山竹種子切成4塊接種在MS培養基中誘導培養，光 照時間為l〇h/d，培養基中添加0. 5mg/L的NAA和和2. Omg/L的BA (6-苄基腺嘌呤， 6-BenzyIaminopurine)；
[0041] (3)誘導組織的增殖
[0042] 外植體轉入WPM培養基培養誘導不定芽，WPM培養基含有4. 5mg/L BA、20g/L蔗糖 和2. 5g/L Phytagel，不定芽長出葉片後，培養40d後取葉片橫切3-5mm培養，培養50d後， 每片葉外植體可產生50個左右的芽點；每個芽點可長成一個再生芽，再生芽高度在5-6_ 發育出芽的基本結構後，從外植體切除，在I. lmg/LBA的WPM培養中進行增殖培養；
[0043] (4)再生芽生根
[0044] 當再生芽長到15mm時，在1/2MS培養基中添加0· 5mg/L的IBA，2000Lx光照條件 下10h/d，進行生根誘導，培養50d待試管苗莖高5-7cm、根長3-5cm後移到苗圃進行假植。
[0045] 實施例3
[0046] 從成熟山竹果實中獲取的山竹種子，包括以下步驟：
[0047] (1)外植體表面滅菌
[0048] 從成熟山竹果實中獲取的山竹種子，用加有質量濃度3 %洗衣粉或洗潔精的水溶 液洗1-2次或流水衝洗l_5h ;再用體積分數75%的酒精浸蘸20-30s，邊浸蘸邊搖動山竹種 子，無菌水衝洗2-4次；最後在體積濃度5-8%次氯酸鈉和0. 3%吐溫80的消毒液中浸泡 15-20min，邊浸泡邊搖動山竹種子，無菌水衝洗3-5次，經過表面消毒、滅菌後的山竹種子 備用；為避免山竹種子活性降低，從果實中取出的種子需在5d內處理完成；
[0049] (2)不定胚的誘導培養
[0050] 經過步驟⑴處理過的山竹種子切成6 ±夬，接種在MS培養基中誘導培養，光照時 間為12h/d，培養基中添加0. 8mg/L的NAA和5mg/L的BA ;
[0051] (3)誘導組織的增殖
[0052] 外植體轉入WPM培養基培養誘導不定芽，WPM培養基含有6mg/L BA、30g/L蔗糖和 3. Og/L Phytagel，待不定芽長出葉片後，培養50d後，取葉子橫切3-5mm培養，培養60d後， 每片葉外植體可產生50個左右芽點；每個芽點可長成一個再生芽，再生芽高度在5-6_發 育出芽的基本結構後，從外植體切除，在I. 3mg/LBA的WPM培養中進行增殖培養；
[0053] (4)再生芽誘導生根
[0054] 當再生芽長到17mm時，在1/2MS培養基中添加 I. Omg/L的IBA，2000Lx光照條件 下12h/d，誘導生根，培養60d待試管苗莖高5-7cm、根長3-5cm後移到苗圃進行假植。
[0055] 實施例4
[0056] -種山竹快繁培養方法，其中步驟（2)中MS培養基中添加2mg/L的2, 4-D，其餘操 作同實施例1。
[0057] 實施例5
[0058] 一種山竹快繁培養方法，其中步驟（2)中MS培養基中添加3mg/L 2, 4-D和2. Omg/ L的BA，其餘操作同實施例2。
[0059] 實施例6
[0060] 一種山竹快繁培養方法，其中步驟⑵中MS培養基中添加4mg/L 2, 4-D和5mg/L 的BA，其餘操作同實施例3。
[0061] 本發明所述的山竹快繁培養方法繁育效果觀察
[0062] 取30粒發育良好的山竹種子，分作6組，每組5粒，分別採用以上6個實施例中的 培養方法進行快繁培養1年，計算所得的山竹試管苗數目。實驗結果見表1。
[0063] 表1本發明所述的山竹快繁培養方法繁育效果

【權利要求】
1. 一種山竹快繁培養方法，其特徵在於，包括以下步驟： (1) 外植體表面滅菌 從成熟山竹果實中獲取的山竹種子，用加有洗衣粉或洗潔精的水溶液洗滌或流水衝洗 2_5h ;再用酒精浸蘸5-30s，邊浸蘸邊搖動山竹種子，無菌水衝洗；最後在含有次氯酸鈉和 吐溫80的消毒液中浸泡15-20min，邊浸泡邊搖動山竹種子，無菌水衝洗，備用； (2) 不定胚誘導階段 經過步驟（1)處理過的山竹種子切塊，轉入MS培養基中進行誘導培養； (3) 外植體增殖階段 外植體轉入WPM培養誘導不定芽；待不定芽長出葉片，培養後取葉片橫切3-5mm，培養 40-60d產生芽點；芽點生長成再生芽時從外植體切除轉入增殖培養基進行增殖培養； (4) 再生芽誘導生根 當再生芽長到13-17mm時，轉入生根培養基誘導生根，培養後移到苗圃進行假植。
2. 根據權利要求1所述的一種山竹快繁培養方法，其特徵在於：所述步驟（1)所用洗 衣粉或洗潔精水溶液質量濃度為1-3%，酒精的體積濃度為65-75%，次氯酸鈉的體積濃度 為5-8 %，吐溫80的體積濃度為0. 1-0. 3 %。
3. 根據權利要求1所述的一種山竹快繁培養方法，其特徵在於：步驟（2)所述山竹種 子不定胚分離成3-6塊。
4. 根據權利要求1所述的一種山竹快繁培養方法，其特徵在於，步驟（2)所用培養基 為添加質量濃度為〇. 3-0. 8mg/L的NAA和0-5mg/L的BA的MS培養基，或添加質量濃度為 2. 0-4. Omg/L的2, 4-D和0-5mg/L的BA的MS培養基，光照時間8-12h/d進行誘導培養。
5. 根據權利要求1所述的一種山竹快繁培養方法，其特徵在於：步驟（3)培養外植 體長出葉片所用的培養基為添加質量濃度2-6mg/L的BA、10-30g/L的蔗糖和2-3g/L的 Phytagel的WPM培養基；再生芽增殖培養基為添加質量濃度為0. 9-1. 3mg/L的BA的WPM培 養基。
6. 根據權利要求5所述的一種山竹快繁培養方法，其特徵在於：步驟（3)培養外植體 長出葉片所用的培養基為添加4-5mg/L的BA、15-25g/L的蔗糖、2. 4-2. 6g/L的Phytagel的 WPM ;葉片培養30-50d後進行橫切；再生芽增殖培養基為添加質量濃度為1. 0-1. 2mg/L的 BA的WPM培養基。
7. 根據權利要求1所述的一種山竹快繁培養方法，其特徵在於：步驟（3)所述再生芽 高度在5-6mm時切除。
8. 根據權利要求1所述的一種山竹快繁培養方法，其特徵在於：步驟（4)所述生根培 養基為添加質量濃度為〇. 1-1. 〇mg/L的IBA的1/2MS培養基，培養條件為光照強度2000Lx， 光照時間8-12h/d，培養時間40-60d。
9. 根據權利要求1所述的一種山竹快繁培養方法，其特徵在於：驟（4)試管苗莖高 5-7cm，根長3-5cm移到苗圃進行假植。
【文檔編號】A01H4/00GK104221859SQ201410439705
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月1日 優先權日:2014年9月1日
【發明者】李敬陽, 金志強, 明建鴻, 唐粉玲, 林妃, 許奕, 常勝合 申請人:中國熱帶農業科學院海口實驗站