一種細胞活性相關分泌蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-06-10 13:40:21

專利名稱：一種細胞活性相關分泌蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的普遍降低內參的分泌蛋白PRR7及其生物學功能，特別是PRR7在誘導細胞凋亡和自噬方面的功能；PRR7在治療癌症的重組蛋白藥物中的應用。
背景技術：
程序性細胞死亡(programmed Cell Death，Pd))是細胞的一種主動死亡過程，基於形態可以將P⑶分為兩型，I型P⑶又稱凋亡性細胞死亡，II型P⑶又稱自噬性細胞死亡(例如參見 Levine B and Daniel Klionsky J. Development by self-digestion molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev cell，2004，6(4)463-477 ；Xiang J， Chao DT, Korsmeyer SJ.BAX-induced cell death may not requireinterleukin I ^ -converting enzyme-like proteases. Proc Natl Acad Sci，1996,93:14559-14563)。最初認為自噬性細胞死亡與凋亡在形態、生化指標、參與分子和機理方面 均存在不同，近年來越來越多的研究提示二者有著密不可分的關係，在某些情況下可以相互拮抗或促進，可先後發生或同時共存於同一細胞(例如參見Cuervo AM. Autophagy :insickness and in health.Trends Cell Biol,2004,14(2) :70-77 ;Shintani T.Autophagyin health and disease a double-edged sword. Science，2004，3 06(5698) :990-995)。目前的研究至少鑑定了 29種參與自噬的特異性自噬基因ATG (AuTophaGy-related)(例如參見 Kawamata T，Kamada Y，Suzuki K，Kuboshima N，Akimatsu H，Ohsumi M，Ohsumi Y. Characterization of a novel autophagy-specificgene，ATG29. Biochem Biophys Res Commun，2005，338 :1884-1889)，另外預測還有上百種相關基因也參與了這個過程(例如參見Behrends C，Sowa ME, Gygi SP, HarperJW. Network organization of the human autophagy system. Nature，2010，466 :68-78)。現已證明有數個基因在自噬的誘導過程中起非常關鍵的作用，如Beclin I (例如參見Liang XH, Jackson S，Seaman M，Brown K，Kempkes B，Hibshoosh H，Levine B.Inductionof autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin L Nature，1999，402 :672-676)，bcl_2(例如參見 Saeki K，Yuo A，Okuma E，Yazaki Y，Susin S. A, Kroemer G，Takaku F. Bcl-2down-regulation causes autophagy in a caspase—independent mannerin human leukemic HL60 cells. Cell Death Differ，2000，7 :1263-1269)，pl9ARF(ReefS，Zalckvar E，Shifman 0，Bialik S，Sabanay H，0ren M，Kimchi A. A short mitochondrialform of pl9ARF induces autophagy and caspase—independent cell death. Mol Cell，2006，22 :463-475)等。腫瘤的發生和發展是極其複雜的過程。個體差異、器官差異和致癌因素的差異都會對腫瘤的發生、發展和預後產生重要的影響。正是這一複雜性給腫瘤的治療帶來了很多困難。儘管對腫瘤發生和發展的機制尚未完全明了，甚至有爭議，但是有一點共識便是腫瘤是惡性細胞「增生過度，凋亡抑制」的結果。腫瘤增生所產生的惡果顯而易見增殖過度的腫瘤壓迫鄰近器官，並造成侵襲和轉移。
凋亡和自噬是一種在正常細胞和病態細胞中普遍存在的生理機制。對自噬研究的不斷深入，不僅進一步揭示了真核生物自身調控的複雜性和多樣性，更為腫瘤的治療提供了新的思路。大量研究表明，在多種人類腫瘤中存在有自噬活性的改變，腫瘤的增殖、凋亡信號途徑與自噬信號途徑相互交錯影響。由此可見，凋亡和自噬與腫瘤的發生、發展有密切的關係(例如參見Bertin S,Pierrefite-Carle V. Autophagy and toll-like receptors a new link in cancer cells. Autophagy. 2008Nov 16 ；4 (8) :1086-1089)。某些抗腫瘤藥物在引起腫瘤細胞產生自噬的同時可能還會導致凋亡，並參與自噬的分子調控。例如，長春新鹼可以誘導肝癌細胞H印G2的自噬性凋亡(例如參見彭心昭，陳英，樸英傑。自噬的抑制影響長春新鹼誘導的肝癌細胞自噬性凋亡。腫瘤，2004，I (25)32-4.)。這種細胞凋亡有著明顯的自噬特徵。據報導，長春鹼類抗腫瘤藥可誘導腫瘤細胞自噬的發生，也能誘導腫瘤細胞凋亡。同樣，蘆薈大黃素在對鼠的C6神經膠質瘤細胞的作用中，除了可以引起Caspase依賴性的凋亡外，還可促進胞質內酸性囊泡的形成，這說明了在蘆薈大黃素的作用下，鼠的C6神經膠質瘤細胞也可以進行自噬性的死亡(例如參見 Mijatovic S,Maksimovic-Ivanic D,Radovic J,Miljkovic Dj, Harhaji Lj,Vuckovic 0,Stosic-Grujicic S,Mostarica Stojkovic M,Trajkovic V. Anti-glioma action of aloeemodin the role of ERK inhibition. Cell Mol Life Sci，2005，62 (5) :589-598)。抗腫瘤藥物與自噬的相關因素，以及自噬與凋亡之間的密切聯繫都有待於進一步研究。自噬處於複雜的細胞應激反應網絡的中心，自噬和腫瘤的複雜關係還有待於更深入的研究，治療的安全性也需要進一步探討。但是，隨著人們對自噬與腫瘤形成、生長及對多種抗癌治療反應研究的不斷深入，期待通過誘導自噬/凋亡或者抑制自噬來發揮抗癌作用。相信在不久的將來對腫瘤細胞自噬能力的調控會成為抑制腫瘤生長或增強抗癌藥物療效的新祀點。本發明人利用突光素酶報告基因方法(例如參見Lorenz ffff,Longiaru M,CormierMJ. Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase.Proc Natl Acad Sci USA. 1991 ;88 (10) :4438-42.)篩選出的顯著下調內參活性的分泌型新基因PRR7，並且通過實驗驗證它具有同時誘導細胞發生凋亡和自噬的功能。PRR7是一種富含脯氨酸結構域的蛋白質，目前還沒有相關的功能報導。本實驗證明分泌蛋白PRR7在14種人源細胞中普遍表達。並且首次證實了分泌蛋白PRR7在293T和HeLa細胞中能夠誘導細胞同時發生凋亡和自噬。因此通過人分泌型蛋白PRR7的表達，可以達到抑制腫瘤細胞生長的目的，同時為
研製治療癌症的重組蛋白藥物奠定了基礎。


圖I顯示PRR7能夠明顯下調pRL-TK-LUC的活性圖2顯示PRR7為分泌蛋白圖3顯示光學顯微鏡下PRR7對細胞形態的影響圖4顯示PRR7能夠明顯抑制細胞的增殖圖5顯示螢光顯微鏡下PRR7對細胞表型的影響圖6顯示PRR7能夠明顯引起細胞PS外翻
圖7顯示PRR7對細胞線粒體膜電位的影響圖8顯示PRR7對LC3-GFP定位的影響圖9顯示PRR7對細胞內LC3蛋白的影響
具體實施例方式本發明的篩選體系將內參質粒pRL-TK-LUC (thymidine kinase romoter-Reni I la luciferase)作為報告質粒轉染293T細胞。利用此篩選體系，對本實驗室克隆得到的1000個未知功能的人類基因進行了規模化細胞篩選，得到一個明顯下調pRL-TK-LUC海腎螢光素酶活性的基因PRR7(實施例I)。進一步的蛋白免疫印記結果表明PRR7為分泌型蛋白(實施例2)。本發明中的各種質粒可以通過本領域普通技術人員已知的各種方法來製備。例如，PCR可擴增出目的片段，利用分子克隆技術將其構建到載體上。PRR7在本發明中，PRR7包括PRR7基因或PRR7蛋白等。所述PRR7蛋白為如SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列，其具有274個胺基酸。所述PRR7基因為編碼本發明的SEQ ID NO 2 的多核苷酸序列，其可以為SEQ ID NO :2所示胺基酸的編碼序列，或者除了上述胺基酸序列的編碼序列之外，還可以包括非編碼序列，例如內含子、編碼序列5'或3'端的非編碼序列等。所述多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成的DNA0其中優選的基因為SEQ ID NO :1所示的多核苷酸，其序列全長1543個核苷酸，編碼序列為第491 1315位核苷酸。或者，更優選一種分離的核苷酸序列，其只包含編碼PRR7蛋白序列，例如SEQ ID NO 1所示的編碼序列核苷酸491 1315。本領域普通技術人員已知，本發明的PRR7的核苷酸序列可以完全相同於如SEQID NO I所示的編碼序列，也可以由於遺傳密碼的簡併性，不完全等同於上述核苷酸的編碼序列。本發明的PRR7核苷酸序列可以依據標準的PCR擴增技術將cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，並選取合適的寡核苷酸引物擴增得到。這樣得到的多核苷酸可以克隆到合適的載體中，並用DNA分析技術進行序列描述。也可以通過標準DNA合成技術得到。本發明的PRR7蛋白可以通過常規方法獲得，例如通過轉化宿主細胞並在被轉化的宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用適當的方法(如溫度變動或化學特質誘導)誘導啟動子，然後繼續培養。培養完成後，可用離心法收集細胞，並用任何已知的方法，如凍融法、超聲處理法、溶菌酶溶解法或機械破碎法破碎細胞。可以用各種已知的方法從宿主細胞培養物中回收和純化本發明的PRR7蛋白，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉澱法、酸萃取法、超濾法、離子交換層析法、磷酸纖維層析法、疏水相互作用層析法、凝膠過濾法、親和層析法及高壓液柱層析法。本發明PRR7在誘導細胞凋亡和自噬以及抑制腫瘤細胞生長中的應用由於本發明PRR7可以誘導細胞的凋亡和自噬，因此可以將PRR7作為抑制腫瘤細胞生長的新靶點，例如提供本發明PRR7的基因或蛋白，用於治療腫瘤。本發明通過PRR7誘導細胞的凋亡和自噬達到抑制腫瘤細胞生長的目的。本發明PRR7可以誘導293T和HeLa細胞的凋亡和自噬，本發明的實施例3_8證明了這種誘導作用，因而PRR7可以抑制腫瘤的生長，例如骨髓瘤細胞、人B淋巴細胞瘤細胞、組織相容性淋巴瘤細胞、人急性單核細胞性白血病細胞、肺癌細胞、神經母細胞瘤細胞、肝癌細胞、胰腺癌細胞、食管癌細胞、人胚腎細胞、宮頸癌細胞、前列腺癌細胞、腦瘤細胞、腎癌細胞、卵巢癌細胞。本發明還提供了檢測PRR7引起自噬時，細胞內LC3的表達情況。所述引物如實施例9中所示。檢測方法也是本領域已知的，例如利用本發明PRR7蛋白特異性的單克隆抗體或多克隆抗體，利用免疫螢光法、免疫印記等進行檢測。免疫印跡是利用十二烷基硫酸鈉(SDS)，通過高解析度的聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)，將抗原根據其分子量大小不同而有效分成許多蛋白區帶，將分離後的蛋白帶經不同途徑轉移至一種固相支持體如硝酸纖維膜或PVDF膜上，然後以抗體為探針，與附著於固相支持體的靶蛋白抗原表位發生特異性反應，結合於固相支持體的抗體可用酶標的二抗如鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶偶聯的第二抗體等檢測。免疫印跡可鑑定出混合物中未知蛋白及其分子質量。免疫組織化學是在組織切片中進行的抗原抗體反應，可以檢測抗原在組織中的含量和定位。 本發明的PRR7的基因或蛋白可以作為抑制腫瘤細胞生長的靶標。因此，可以利用雙報告檢測手段、流式細胞技術、免疫印記等方法或它們的組合，間接反映體內PRR7的表達及作用。下面結合具體實施例進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規條件如《分子克隆實驗指南》(2002年第三版[美]薩姆布魯克等著，科學出版社)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例中未標明來源的試劑和材料均可商購獲得。實施例I雙螢光素酶報告系統的檢測HEK293T細胞(購自美國ATCC)常規傳代培養於含10 %胎牛血清(HyClone，SH30084. 03)的 DMEM 培養基(HyClone, SH30022. 01B)中，37°C，5% CO2 孵箱中培養。按照I. I X IO6細胞/ml的密度，接種於96孔板，每孔100 u 1，置於孵箱培養18小時 24小時，使細胞密度達到40% 60%，以備轉染。按照說明書，使用VigoFect陽離子轉染試劑(威格拉斯生物技術(北京)有限公司)將5ngpRL-TK-LUC和50ng待篩基因或者對照質粒共轉入HEK293T細胞。轉染pCMV-sport6空載體的細胞作為空白對照。轉染pCMV_BAX基因的細胞作為陽性對照。每種待篩質粒設3個復孔。培養24小時後檢測螢光素酶活性。按照雙螢光素酶報告系統(Promega，E1960)的說明書裂解細胞後，利用多功能微孔板檢測系統GENios Pro (Tecan)檢測螢光素酶強度。轉染空載體對照pCMV_sport6的細胞的相對螢光值設為100%。結果取3個復孔的平均值。結果參見圖1，篩選了 1000個基因對pRL-TK-LUC相對螢光素酶活性的影響，其中，空載體對照組轉染pCMV-sport6相對螢光素酶活性為I ;PRR7相對螢光素酶活性為0. 6。實施例2分泌型PRR7的檢測將HEK293T細胞(購自美國ATCC)以30萬/孔鋪於六孔板(NEST Biotecl，703001)中常規培養18小時，分別將3u g pCMV-sport6 (陰性對照)、PRR7質粒(pCMV載體)、IL-IO (pCMV載體，陽性對照)按照說明書，使用VigoFect (Vigorous公司，中國)陽離子轉染試劑將質粒轉入HEK293T細胞。繼續培養24小後收集細胞培養的上清液免疫印記檢測PRR7的分泌情況。按標準的免疫印記程序進行電泳、轉膜、封閉等操作。一抗使用My. c抗體(購自Cell Signaling公司)，二抗使用HRP標記的羊抗鼠抗體(Santa Cruz)。使用Pierce公司的發光檢測試劑盒進行檢測。結果參見圖2所示，圖2中各泳道分別為l、pCMV-sport6空載體；2、PRR7過表達的細胞培養上清；3、IL-10過表達的細胞培養上清。實施例3PRR7對細胞存活狀態的影響HEK293T細胞(購自美國ATCC)常規傳代培養於含10 %胎牛血清(HyClone，SH30084. 03)的 DMEM 培養基(HyClone, SH30022. 01B)中，37°C，5% CO2 孵箱中培養。按照I. I X IO6細胞/ml的密度，接種於96孔板，每孔100 u 1，置於孵箱培養18小時 24小時，使細胞密度達到40% 60%，以備轉染。按照說明書，使用VigoFect陽離子轉染試劑(威格拉斯生物技術(北京)有限公司)分別將IOOng pCMV-sport6(陰性對照)、PRR7質粒(pCMV載體)、BAX (pCMV載體，陽性對照)轉入HEK293T細胞。繼續培養，分別於24小時後和48小時後用顯微鏡觀測細胞存活狀態情況。
結果如圖3所示，可以看出，PRR7對細胞的存活有抑制作用，且發現與對照相比細胞明顯減少。實施例4PRR7對細胞增殖狀況的影響HEK293T細胞(購自美國ATCC)常規傳代培養於含10 %胎牛血清(HyClone，SH30084. 03)的 DMEM 培養基(HyClone, SH30022. 01B)中，37°C，5% CO2 孵箱中培養。按照
2X IO3細胞/ml的密度，接種於96孔板，每孔100 yl，置於孵箱培養18小時 24小時，使細胞密度達到40% 60%，以備轉染。按照說明書，使用VigoFect陽離子轉染試劑(威格拉斯生物技術(北京)有限公司分別將)20ngpCMV-Sport6(陰性對照)、PRR7質粒(pCMV載體)、BAX (pCMV載體，陽性對照)轉入HEK293T細胞，每種待篩質粒設3個復孔。繼續培養分別於培養後2411、4811、7211、9611、12011和 144h 時加入 CCK-8 (Cell Counting Kit_8，購自日本同仁化學CK04)每孔加入10 yl，利用多功能微孔板檢測系統GENios Pro (Tecan)測定各孔的吸光度值。結果如圖4所示，可以看出，PRR7對細胞的增殖有抑制作用。實施例5化學染色檢測PRR7對細胞凋亡的檢測HEK293T細胞(購自美國ATCC)常規傳代培養於含10 %胎牛血清(HyClone，SH30084. 03)的 DMEM 培養基(HyClone, SH30022. 01B)中，37 °C，5 % C02 孵箱中培養。按照I. I X 106細胞/ml的密度，接種於96孔板，每孔100 U 1，置於孵箱培養18小時 24小時，使細胞密度達到40% 60%，以備轉染。按照說明書，使用VigoFect陽離子轉染試劑(威格拉斯生物技術(北京)有限公司)分別將IOOng pCMV-sport6(陰性對照)、PRR7質粒(pCMV載體)、BAX(pCMV載體，陽性對照)轉入HEK293T細胞。繼續培養，分別於24小時後和48小時後，分別加入細胞液與終濃度為IuM的CalceinAM(購自美國InvitrogenC3100MP)和 2uM 的 EthD-I (購自美國 Invitrogen E1169)兩種螢光染料 37°C孵育 30min。其中Calcein AM能夠將活細胞標記成綠色，而EthD-I能將死細胞標記成紅色，利用螢光顯微鏡下進行觀察，利用紅綠螢光的比例，來判斷細胞的存活狀態。結果如圖5所示，可以看出，PRR7與對照相比PRR7和BAX在24h紅色螢光增多，即死細胞增多，48h更為明顯。實施例6流式技術檢測PRR7對細胞凋亡影響
細胞凋亡的主要生化指標是細胞膜脂醯絲氨酸(PS)外翻和線粒體膜電位的下降，碘化丙啶(PD是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來；Di0C6是異種特異性針對線粒體膜電位變化的染料，用它來染細胞可以觀察由於細胞凋亡引起線粒體膜電位降低的細胞的百分比。將HEK293T細胞(購自美國ATCC)以30萬/孔鋪於六孔板(NEST Biotecl, 703001)中常規培養18小時，分別將3 u gpCMV-sport6 (陰性對照)、PRR7質粒(pCMV載體)、BAX (pCMV載體，陽性對照)按照說明書，使用VigoFect (Vigorous公司)陽離子轉染試劑將質粒轉入HEK293T細胞。繼續培養，分別於24小時後和48小時後收集細胞培養上清於離心管，胰酶消化細胞，一併轉入離心管，I, 500rpm離心5分鐘，棄上清，PBS洗滌細胞2次，重懸於200 U I結合緩衝液(IOmM HEPES，pH 7. 4, HOmMNaCl, ImM MgCl2, 5mM KC1，2. 5mM CaCl2)，力口入終濃度為0. 5 ii g/ml的FITC-Annexin-V(購自美國BD公司556547)，室溫避光反應20分鐘後加入終濃度為Iu g/ml的PI (購自美國BD公司556547)，根據細胞濃度補上200-400 ill結合緩衝液，立即進行流式細胞術分析；細胞重懸於400ulPBS中，製備單細胞懸液，加入20nM 的Di0C6(購自美國Invitrogen D-273)，避光37°C孵育15min，進行流式細胞術分析。收穫10，000個細胞，計算引起線粒體膜電位下降的細胞百分比。結果如圖6、7所示，可以看出，PRR7與對照相比有明顯的誘導細胞凋亡的作用，並且由於細胞凋亡引起細胞線粒體膜電位降低的細胞數的百分比增加。實施例7過表達PRR7觀察LC3-GFP的點狀聚集LC3為酵母自噬基因Atg8/Apg8/Aug7的同源物，以LC3-I和LC3-II兩種形式存在。在正常情況下，LC3-I彌散的分布在胞質中。當自噬發生時，LC3-I經過切割形成LC3-II，並轉位於自噬泡表面。呈點狀分布。LC3-I和LC3-II分子量分別為18kD和16kD。藉助於螢光顯微鏡，利用LC3-GFP可以很方便地觀察到LC3在細胞中的定位並以此檢測自噬的發生發展。實驗中使用pCMV-sport6空載體作為陰性對照，以轉染了 LC3-GFP後使用撤血清為陽性對照。HeLa細胞(購自美國ATCC)常規傳代培養於含10 %胎牛血清(HyClone，SH30084. 03)的 DMEM 培養基(HyClone, SH30022. 01B)中，37°C，5% CO2 孵箱中培養。按照
I.I X IO6細胞/ml的密度，接種於96孔板，每孔100 u 1，置於孵箱培養18小時 24小時，使細胞密度達到40%-60%，以備轉染。按照說明書，使用VigoFect陽離子轉染試劑(威格拉斯生物技術(北京)有限公司)分別將200ngpCMV-Sport6(陰性對照)和LC3-GFP、PRR7質粒(pCMV載體)和LC3-GFP質粒、LC3-GFP轉入HeLa細胞。繼續培養20h後將轉染LC3-GFP的孔的培養基換為Earle’s平衡鹽緩衝液(EBSS購自美國Sigma E2888)，持續16小時後，利用螢光顯微鏡觀測。結果如圖8其中LC3-GFP撤血清組(飢餓)作為陽性對照。與之相似，空載體組HeLa細胞中LC3-GFP均勻分布於胞質中，發生自噬的HeLa細胞其LC3-GFP呈斑點狀分布，數量明顯增加。實施例8過表達PRR7觀察細胞內LC3蛋白的變化目前認為自噬發生過程中細胞內LC3-I型蛋白向LC3-II型蛋白的轉變是檢測自噬最可靠的指標之一，因此我們通過免疫印跡實驗，用抗LC3抗體分析轉染細胞中膜結合形式的LC3-II蛋白含量的變化。免疫印記檢測HeLa細胞內LC3總蛋白的表達量。根據培養要求按轉染試劑說明書分別將10 y g pCMV-sport6 (陰性對照)、PRR7質粒(pCMV載體)轉染入6孔板的一個孔HeLa細胞中，Earle’s平衡鹽緩衝液(EBSS購自美國SigmaE2888)處理的孔作為陽性對照。培養24小時後提取蛋白免疫印記檢測LC3蛋白水平。將各孔培養的細胞使用100 u I細胞裂解液(1XPBS，1%NP40，0. 5%脫氧膽酸鈉，0. 1%SDS)裂解細胞，離心取上清用於免疫印記檢測。按標準的免疫印記程序進行電泳、轉膜、封閉等操作。一抗使用LC3抗體(均購自Cell Signaling公司),二抗使用HRP標記的羊抗兔抗體(Santa Cruz)。使用Pierce公司的發光檢測試劑盒進行檢測。
結果如圖9，與空載體組相比，PRR7轉染組和陽性對照組都能引起LC3-II蛋白比例的增加。
權利要求
1.胺基酸序列為SEQID NO :2所示的PRR7在誘導細胞凋亡和/或細胞自噬中的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其中所述應用為誘導人源細胞的凋亡與自噬。
3.如權利要求I或2所述的應用，其中所述細胞為PRR7普遍表達的人源細胞，包括骨髓瘤細胞、人B淋巴細胞瘤細胞、組織相容性淋巴瘤細胞、人急性單核細胞性白血病細胞、肺癌細胞、神經母細胞瘤細胞、肝癌細胞、胰腺癌細胞、食管癌細胞、人胚腎細胞、宮頸癌細胞、前列腺癌細胞、腦瘤細胞、腎癌細胞、卵巢癌細胞。
4.如權利要求I或2所述的應用，其中所述細胞為293T和HeLa細胞。
5.胺基酸序列為SEQID NO 2所示的PRR7在治療癌症的重組蛋白藥物中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其中所述能夠治療癌症的重組蛋白藥物是通過誘導細胞凋亡和/或細胞自噬。
7.如權利要求5或6所述的應用，其中所述癌症為PRR7普遍表達的，包括骨髓瘤細胞、人B淋巴細胞瘤細胞、組織相容性淋巴瘤細胞、人急性單核細胞性白血病細胞、肺癌細胞、神經母細胞瘤細胞、肝癌細胞、胰腺癌細胞、食管癌細胞、人胚腎細胞、宮頸癌細胞、前列腺癌細胞、腦瘤細胞、腎癌細胞、卵巢癌細胞。
8.如權利要求5所述的應用，其特徵在於它的活性成分包含權利要求I所述的PRR7蛋白及其編碼基因。
全文摘要
本發明涉及一種新的細胞活性相關的分泌蛋白脯氨酸富集蛋白7(proline rich protein 7，PRR7)及其生物學功能，特別是PRR7在誘導細胞凋亡和自噬方面的功能；PRR7在診斷和/或治療癌症的重組蛋白藥物中的應用。
文檔編號A61K38/17GK102755632SQ201110109679
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月29日 優先權日2011年4月29日
發明者李長清, 李靜, 石太平, 謝杰施, 鄧唯唯, 郝東霞, 雄英, 馬大龍 申請人:北京諾賽基因組研究中心有限公司