哈氏噬纖維菌的電轉化方法

2023-06-10 17:12:31 2

專利名稱：哈氏噬纖維菌的電轉化方法
技術領域：
本發明涉及一種電轉化方法，特別是一種哈氏噬纖維菌的電轉化方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
哈氏曬纖維菌(Cytophaga hutchinsonii)是一類好氧的能夠徹底降解結晶纖維素的革蘭氏陰性細菌，土壤當中廣泛存在，屬於噬纖維擬桿菌屬。由於哈氏噬纖維菌不含有類似厭氧纖維素降解細菌的纖維小體的結構，而且也不分泌游離的纖維素酶，所以其新型的纖維素降解機制到目前為止仍未得到闡明。因其能徹底地降解結晶纖維素，在促進纖維素生物能源轉化利用方面具有潛在的應用前景。鑑於其獨特的纖維素降解機理及良好的應用前景，對於其進行分子水平的功能研究就顯的極為重要，這對於進一步闡釋其纖維素降解機制來說是必要的，而哈氏噬纖維菌的高效轉化則是實現基因功能研究的必要手段。目前，哈氏噬纖維菌的遺傳轉化經常採用接合轉化的方法來完成外源基因的導入，如MARK J. McBRIDE等人通過Tn4351轉座的方法得到了突變子，但該方法操作複雜、轉化效率低，不穩定且重複性較差，所以尋找新的轉化方法是完成哈氏噬纖維菌遺傳操作的必要前提。電轉化法由於具有操作簡單、轉化效率高等優點被廣泛應用於多種微生物，但對於哈氏噬纖維菌來說，由於其培養條件特殊、細胞表面結構含有粘多糖等特點，電轉化較難完成，在國內外則鮮有報導。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種哈氏噬纖維菌的電轉化方法。該方法通過對哈氏菌的培養條件、生長狀態、電擊緩衝液、電場強度、質粒濃度、復甦時間等因素進行優化，得到電轉化的最優條件並提高了電轉化效率。本發明是通過如下技術方案實現的一種哈氏噬纖維菌的電轉化方法，步驟如下(I)製備外源DNA質粒，獲得濃度大於40 U g/ml的重組質粒溶液；(2)配製含有MgCl2和甘油的水溶液，MgCl2的終濃度為8mM，甘油體積佔溶液總體積的10%，將上述水溶液置於冰浴中，製得電擊緩衝液；(3)將菌種保藏號為ATCC NO. 33406的哈氏噬纖維菌菌體在液體培養基TY2中培養活化，170rpm，30°C培養35_50h，再轉接TY2液體培養基中培養，170rpm，30°C培養 35-50h，然後，離心收集細胞；用預冷的無菌水洗滌重懸細胞，離心；再用步驟(2)製得的電擊緩衝液洗滌重懸細胞1-2次，離心；最後用電擊緩衝液重懸細胞，製得感受態細胞；(4)將步驟(3)製得的感受態細胞在14KV/cm、400 Q>25uF的條件下電擊4_6ms， 然後轉入液體培養基TY2，170rpm，30°C復甦培養12-16小時，在含有30 y g/ml紅黴素的固體平板培養基TY2上篩選轉化子，製得電轉化後的哈氏噬纖維菌。所述步驟(I)中的外源DNA質粒為質粒pEP4351。所述步驟(3)和步驟(4)中的液體培養基TY2，每升組分如下蛋白腖2g,酵母浸出物0. 5g,葡萄糖2g,純水定容至1L, pH 7. 2 ;高壓蒸汽滅菌。所述步驟(3)的離心條件為4°C、7000rpm、5min。所述步驟(3)的轉接量為1% (v/v);培養時間為40h ;最後用100-200倍的電擊緩衝液重懸細胞，_70°C凍存。所述步驟⑷中液體培養基TY2的溫度為30°C。提前預冷的液體培養基TY2，可以在一定程度上對受損的細胞加以保護，減少致死率。所述步驟(4)中固體平板培養基TY2，每升組分如下蛋白腖2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，瓊脂10g，純水定容至1L，pH 7. 2 ;高壓蒸汽滅菌。有益效果I、本發明通過研究不同影響因素對哈氏噬纖維菌轉化效率的影響，優化電轉化參數，使外源DNA能利用電轉化方法導入哈氏噬纖維菌，最終在篩選平板上可以得到較多轉化子菌落，轉化效率達到5 X IO4/ u g DNA。2、本發明在電擊緩衝液中添加MgCl2，通過去除哈氏噬纖維菌細胞表面的粘多糖成分，使外源DNA更容易進入哈氏噬纖維菌，從而提高轉化效率2-3倍。3、本發明通過降低加入篩選培養基的溫度，對受損的細胞加以保護，減少致死率。4、本發明可以彌補目前使用的接合轉化方法的不足，為哈氏噬纖維菌的遺傳作業系統及分子生物學研究提供一種了方便、快速的途徑。


圖I為不同電場強度對轉化效率的影響；圖2為添加MgCl2對轉化效率的影響；圖3為復甦培養時加入培養基的溫度對轉化效率的影響；
具體實施方案下面結合實施例對本發明做進一步闡述，但本發明所保護範圍不限於此。實施例中所述哈氏噬纖維菌購自美國標準生物品收藏中心，菌種保藏號 ATCCN0. 33406。實施例I一種哈氏噬纖維菌的電轉化方法，步驟如下(I)用 Takara Plasmid Purification Kit 於 E.coli S17-1 A pir BW19851 菌株中提取質粒 pEP4351(A J COOPER 等人構建，見 J. Bacteriol. 1997,179(20) :6221)，利用分光光度計測定質粒濃度為40 u g/ml重組質粒溶液；(2)配製含有MgCl2和甘油的水溶液，MgCl2的終濃度為8mM，甘油體積佔溶液總體積的10%，將上述水溶液置於冰浴中，製得電擊緩衝液；
(3)將哈氏噬纖維菌菌體在液體培養基TY2中培養活化，170rpm, 30°C培養40h，再轉接到液體培養基TY2液體培養基中，170rpm, 30°C培養40h，然後，7000rpm，5min, 4°C離心收集細胞；用預冷的無菌水洗滌重懸細胞，7000rpm, 5min, 4°C離心收集細胞沉澱，棄上清以除去培養基中的雜質；用預冷的電擊緩衝液洗滌重懸細胞2次，7000rpm，5min，4°C離心收集細胞，最後用100倍的電擊緩衝液重懸細胞，製得感受態細胞後分裝，_70°C凍存待用，製得感受態細胞；(4)從_70°C冰箱中取出感受態細胞，置於冰上解凍；將裝有質粒的I. 5m的離心管與1_的電擊杯以及含有卡那黴素的液體培養基TY2(含有終濃度為5ug/ml的卡那黴素) 置於冰上預冷；取IOul的pEP4351質粒加入90ul的感受態細胞中，輕輕吹打混勻，然後將混合物轉移至已經預冷的電擊杯中，冰上放置約IOmin ;打開電轉化儀，調節參數為14KV/ cm、400Q、25ii F將電擊杯放進電轉化儀卡槽中，電擊5ms，向電擊杯中加入lml、0°C的液體培養基TY2 ;將菌液轉入搖管中，再加入2ml液體培養基TY2，30°C，170rpm，復甦培養14小時；離心收集細胞，塗布含30 u g/ml紅黴素的固體平板培養基TY2上，培養7天，觀察結果， 篩選陽性轉化子，同時設置不加質粒或不電擊的感受態細胞作為陰性對照塗布抗性平板， 陽性轉化子即為電轉化後的哈氏噬纖維菌。液體培養基TY2，每升組分如下蛋白腖2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，純水定容至1L，pH 7. 2 ;高壓蒸汽滅菌。固體平板培養基TY2，每升組分如下蛋白腖2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，瓊脂10g，純水定容至1L，pH 7. 2 ;高壓蒸汽滅菌。轉化子數=菌落數X稀釋倍數X轉化實驗原液總體積/塗板菌液體積=2 X IO4轉化效率=轉化子數/ U g DNA = 2 X 104/0. 4u g DNA = 5 X IO4/ U g DNA經檢測，轉化效率達到5 X IO4/ ii g DNA。實施例2不同電場強度對哈氏噬纖維菌電轉化效率影響的實驗實驗採用哈氏噬纖維菌ATCC 33406菌株，質粒pEP4351用Takara Plasmid Purification Kit提取於E.coli S17-1入pir BW19851菌株，利用分光光度計準確測定質粒濃度為40 ii g/ml。電擊緩衝液配方如下10%甘油、8mM MgCl2，使用前在冰上預冷。將對數期的哈氏噬纖維菌ATCC 33406接種於液體培養基TY2中，170rpm，30°C 振蕩培養40h，7000rpm, 5min，4°C離心收集細胞；用預冷的無菌水洗滌重懸細胞，7000rpm, 5min，4 °C離心收集細胞沉澱，棄上清以除去培養基中的雜質；用預冷的電擊緩衝液洗滌重懸細胞2次，7000rpm，5min，4°C離心收集細胞，最後用電擊緩衝液重懸細胞，濃縮比例為 I 200，製得感受態細胞後分裝，-70°C凍存待用。從_70°C冰箱中取出感受態細胞，置於冰上解凍；將裝有質粒的I. 5m的離心管與 Imm的電擊杯以及TY2液體(含有終濃度為5ug/ml的卡那黴素)置於冰上預冷；取IOul的 PEP4351質粒加入90ul的感受態細胞中，輕輕吹打混勻，然後將混合物轉移至已經預冷的電擊杯中，冰上放置約IOmin ;設置不同的電場強度參數，以考察電壓對轉化效率的影響， 電阻設置為400 Q，電容25ii F ;用吸水紙將電擊杯外壁上的冰水擦乾，立即放進電轉化儀卡槽中，電擊5ms，向電擊杯中加入lml、0°C的液體培養基TY2 ;將菌液轉入搖管中，再加入 2ml液體培養基TY2，30°C，170rpm，復甦培養16小時；離心收集細胞，塗布含30ug/ml紅黴素的TY2固體平板上，培養7天，觀察結果，對不同電壓得到的陽性轉化子進行計數，計算並比較不同電壓的轉化效率。同時設置不加質粒或不電擊的感受態細胞作為陰性對照塗布抗性平板。對於不同電壓來說，其對轉化效率的影響是比較顯著的，一方面如果電壓太低，對細胞膜的穿透能力較弱難以形成外源DNA進入細胞的孔道，會使最終轉化效率降低；另一方面倘若電壓過大，又會致使感受態細胞受到電脈衝的衝擊太大，降低細胞的存活率，進而影響轉化克隆的產生。本實驗結果見圖1，從圖中可以發現，隨著電壓的升高電轉化效率也逐漸升高，當電壓達到14KV/cm時，轉化效率達到最高，隨後又隨電壓的升高而降低。實施例3不同MgCl2濃度對哈氏噬纖維菌電轉化效率影響的實驗實驗採用哈氏噬纖維菌ATCC 33406菌株，質粒pEP4351用Takara Plasmid Purification Kit提取於E.coli S17-1入pir BW19851菌株，利用分光光度計準確測定質粒濃度為40 ii g/ml。電擊緩衝液成分為含有不同濃度MgCl2的10%的甘油溶液，目的是確定最優的 MgCl2濃度，電擊緩衝液在冰上冷凍保存。將對數期的哈氏噬纖維菌ATCC 33406接種於液體培養基TY2中，170rpm，30°C 振蕩培養4011，7000印111，51^11，41離心收集細胞；用預冷的無菌水洗滌重懸細胞，7000rpm， 5min，4°C離心收集細胞沉澱，棄上清以除去培養基中的雜質；用預冷的含不同濃度MgCl2的電擊緩衝液洗滌重懸細胞2次，7000rpm，5min，4°C離心收集細胞，最後用相應的電擊緩衝液重懸細胞，濃縮比例為I : 200，製得感受態細胞後分裝，-70°C凍存待用。從_70°C冰箱中取出感受態細胞，置於冰上解凍；將裝有質粒的I. 5m的離心管與 Imm的電擊杯以及TY2液體(含有終濃度為5ug/ml的卡那黴素)置於冰上預冷；取IOul 的pEP4351質粒加入90ul的感受態細胞中，輕輕吹打混勻，然後將混合物轉移至已經預冷的電擊杯中，冰上放置約IOmin ;打開電轉化儀，調節參數為14KV/cm、400Q、25iiF，將電擊杯放進電轉化儀卡槽中，電擊5ms，向電擊杯中加入lml、0°C的液體培養基TY2 ;將菌液轉入搖管中，再加入2ml液體培養基TY2，30°C，170rpm，復甦培養16小時；離心收集細胞，塗布含30ug/ml紅黴素的TY2固體平板上，培養7天，觀察結果，對由含不同濃度MgCl2的電擊緩衝液製備的感受態所得到的陽性轉化子進行計數，計算並比較不同濃度的MgCl2對轉化效率的影響。同時設置不加質粒或不電擊的感受態細胞作為陰性對照塗布抗性平板。由於在哈氏噬纖維菌的細胞表面存在多糖類的粘性物質，這對電擊轉化來說是不利的，在電擊緩衝液中加入MgCl2,能夠有效去除其細胞表面粘多糖，實施例驗證了不同 MgCl2濃度對電轉化效率的影響，實驗結果見圖2。MgCl2濃度過大會使體系中的離子濃度升高，易引發爆杯現象從而降低轉化效率，當MgCl2的濃度為8mM時,效果最佳。實施例4復甦培養時不同加入培養基的溫度對哈氏曬纖維菌電轉化效率影響的實驗實驗採用哈氏噬纖維菌ATCC 33406菌株，質粒pEP4351用Takara Plasmid Purification Kit提取於E. coli S17-1入pirBW19851菌株，利用分光光度計準確測定質粒濃度為40 ii g/ml。電擊緩衝液配方如下10%甘油、8mM MgCl2，使用前在冰上預冷。將對數期的哈氏噬纖維菌ATCC 33406接種於液體培養基TY2中，170rpm，30°C 振蕩培養4011，7000印111，51^11，41離心收集細胞；用預冷的無菌水洗滌重懸細胞，7000rpm， 5min，4 °C離心收集細胞沉澱，棄上清以除去培養基中的雜質；用預冷的電擊緩衝液洗滌重懸細胞2次，7000rpm, 5min，4°C離心收集細胞，最後用電擊緩衝液重懸細胞，濃縮比例為 I 200，製得感受態細胞後分裝，-70°C凍存待用。從_70°C冰箱中取出感受態細胞，置於冰上解凍；將裝有質粒的I. 5m的離心管與 Imm的電擊杯以及TY2液體(含有終濃度為5ug/ml的卡那黴素)置於冰上預冷；取IOul 的pEP4351質粒加入90ul的感受態細胞中，輕輕吹打混勻，然後將混合物轉移至已經預冷的電擊杯中，冰上放置約IOmin ;打開電轉化儀，調節參數為14KV/cm、400Q、25iiF，將電擊杯放進電轉化儀卡槽中，電擊5ms，向電擊杯中加入Iml不同溫度的液體復甦培養基TY2 ； 將菌液轉入搖管中，再加入2ml30°C的液體培養基TY2，30°C，170rpm，復甦培養16小時；離心收集細胞，塗布含30ug/ml紅黴素的TY2固體平板上，培養7天，觀察結果，計算陽性轉化子數並比較不同復甦培養基加入溫度對轉化效率的影響，實驗結果見圖3。同時設置不加質粒或不電擊的感受態細胞作為陰性對照塗布抗性平板。電擊過程會放出熱量，在一定程度上會影響感受態的活性，同時會使細胞受損，電擊後立即加入低溫的復甦培養基會對受損細胞予以保護並降低由電擊所導致的細胞致死率，最終提高電轉化效率。
權利要求
1.一種哈氏噬纖維菌的電轉化方法，其特徵在於，步驟如下(1)製備外源DNA質粒，獲得濃度大於40μ g/ml的重組質粒溶液；(2)配製含有MgCl2和甘油的水溶液，MgCl2的終濃度為8mM，甘油體積佔溶液總體積的 10 %，將上述水溶液置於冰浴中，製得電擊緩衝液；(3)將菌種保藏號為ATCCNO. 33406的哈氏噬纖維菌菌體在液體培養基TY2中培養活化，170rpm，30°C培養35_50h，再轉接TY2液體培養基中培養，170rpm，30°C培養35_50h，然後，離心收集細胞；用預冷的無菌水洗滌重懸細胞，離心；再用步驟(2)製得的電擊緩衝液洗滌重懸細胞1-2次，離心；最後用電擊緩衝液重懸細胞，製得感受態細胞；(4)將步驟(3)製得的感受態細胞在14KV/cm、400Ω、25 μ F的條件下電擊4-6ms，然後轉入液體培養基TY2，170rpm，30°C復甦培養12-16小時，在含有30 μ g/ml紅黴素的固體平板培養基TY2上篩選轉化子，製得電轉化後的哈氏噬纖維菌。
2.如權利要求I所述的電轉化方法，其特徵在於，所述步驟(I)中的外源DNA質粒為質粒 PEP4351。
3.如權利要求I所述的電轉化方法，其特徵在於，所述步驟(3)和步驟(4)中的液體培養基TY2，每升組分如下蛋白腖2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，純水定容至lL，pH 7. 2 ;高壓蒸汽滅菌。
4.如權利要求I所述的電轉化方法，其特徵在於，所述步驟(3)的離心條件為4°C、 7000rpm、5mino
5.如權利要求I所述的電轉化方法，其特徵在於，所述步驟(3)的轉接量為1%(v/v)； 培養時間為40h ;最後用100-200倍的電擊緩衝液重懸細胞，_70°C凍存。
6.如權利要求I所述的電轉化方法，其特徵在於，所述步驟(4)中液體培養基TY2的溫度為30。。。
7.如權利要求I所述的電轉化方法，其特徵在於，所述步驟(4)中固體平板培養基 TY2，每升組分如下蛋白腖2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，瓊脂10g，純水定容至1L，pH 7. 2 ;高壓蒸汽滅菌。
全文摘要
本發明涉及一種電轉化方法，步驟如下(1)製備外源DNA質粒；(2)配製含有MgCl2和甘油的水溶液，將上述水溶液置於冰浴中，製得電擊緩衝液；(3)將菌種保藏號為ATCCNO.33406的哈氏噬纖維菌菌體製備感受態細胞；(4)電擊，然後轉入液體培養基TY2復甦培養，在含有紅黴素的固體平板培養基TY2上篩選轉化子，製得電轉化後的哈氏噬纖維菌。
文檔編號C12N15/63GK102586305SQ20121004977
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月29日 優先權日2012年2月29日
發明者盧雪梅, 季曉飛, 張為燦, 徐元喜, 李鵬偉 申請人:山東大學