大曲中香氣物質的提取及分析方法

2023-06-10 11:31:51 4

專利名稱：大曲中香氣物質的提取及分析方法
技術領域：
本發明涉及大曲中香氣物質的提取及分析方法，屬於釀酒技術領域。
背景技術：
大曲是以單一小麥或小麥、大麥和豌豆混合物為原料，經粗粉碎後加水壓成磚狀曲坯，人工控制在一定的溫度、溼度下培育而成的粗酶製劑。它是釀酒發酵的動力，用於蒸餾酒的釀造。目前許多名優白酒就是利用大曲作為釀酒的糖化、發酵劑。在大曲製造過程中微生物的代謝產物和原料的分解產物直接或間接地構成了白酒的風味物質，使白酒具有各種不同的獨特的風味。因此大曲還是生香劑。大曲中富含大量香味前驅物質，因此，大曲本身就是一種香味物質的富集物，所謂的曲香正是一種表現。目前，國內對於大曲中的微量揮發性成分也進行了一些研究，多採用頂空固相微萃取方法分析大曲中的揮發性化合物組成和含量，該方法採取毛細萃取頭吸附香氣物質，·再通過高溫解吸附後通過質譜分析香氣物質。採用頂空固相微萃取提取香氣物質時，與萃取頭的種類、萃取劑的選擇、樣品用量、萃取時間、萃取溫度、鹽離子濃度等諸多因素相關，控制不好對樣品的提取效果影響大；提取的香氣物質吸附於萃取頭上，只能通過高溫解吸附，無法進行稀釋或濃縮等操作。此外，含量高的香氣物質不一定對大曲香味的整體貢獻就大；一些微量揮發性化合物有著較低的閾值，反而有可能是大曲中的特徵香氣物質。因此本領域需要一種新的方法來提取、分析大曲中的特徵香氣物質是哪些。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種分析大曲中香氣物質的提取方法。本發明的技術方案是大曲中香氣物質的提取方法，包括如下步驟粉碎大曲，力口入可溶於水的無機鈣鹽，加入濃度為40飛0%的乙醇提取，收集上清液，加入水溶性無機鹽飽和上清液，用I :廣1 3的戊烷和乙醚溶液萃取2飛次，收集萃取液，去離子水洗滌萃取液，利用溶劑輔助萃取香氣裝置提取香氣物質，加入乾燥劑處理8 12h，過濾，N2吹掃濃縮，即得到香氣物質。進一步的，所述可溶於水的無機鈣鹽質量為大曲粉質量的O. Γ0. 5%。進一步的，所述可溶於水的無機鈣鹽為氯化鈣。具體的，所述加入濃度為4(Γ60%的乙醇提取包括如下步驟向大曲粉中加入的濃度為40 60%的乙醇，濃度為40 60%的乙醇與大曲粉的質量比為I : 2 I 4，超聲震蕩l(T50min，500(Tl0000r/min離心l(T30min，取上清液，重複提取2 4次，合併所用上清液，用去離子水將上清液稀釋至乙醇濃度為1(Γ15%。進一步的，所述的可溶於水的無機鹽為氯化鈉或氯化鉀。進一步的，所述的乾燥劑為無水硫酸鈉或氯化鈣，乾燥劑大曲粉的質量比為I Tl 2。本發明還提供了大曲中香氣物質的分析方法，其特徵在於包括如下步驟
a、香氣物質的提取粉碎大曲，加入可溶於水的無機鈣鹽，濃度為4(Γ60%的乙醇提取，收集上清液，加入水溶性無機鹽飽和上清液，用I :廣1 3的戊烷和乙醚溶液萃取2飛次，收集萃取液，去離子水洗滌萃取液，利用溶劑輔助萃取香氣裝置提取香氣物質，加入乾燥劑處理8 12h，過濾，N2吹掃濃縮，即得到香氣物質；b、頻率檢測法分析大曲香氣物質將步驟a得到的香氣物質經氣質聯用裝置分離，記錄下每一種香氣物質的保留時間；同時由6 10名利用連接到氣質聯用裝置上的聞香裝置對被分離的每一種香氣物質進行鑑定，記錄每種香氣物質被聞香員鑑定出來的次數，少於2名聞香員鑑定出來的香氣物質視為幹擾；C、香氣提取稀釋法分析大曲香氣物質採用乙醚按照I :廣1 5的比例稀釋提取的香氣物質，直至所有的香氣物質均無法再嗅聞到，每稀釋一次樣品通過氣質聯用裝置分離，由聞香員鑑定，香氣物質的強度由稀釋比例FD值來表示，FD值高的香氣物質即為特徵香氣物質；其中，所述聞香員為步驟b中鑑定出的香氣物質最多的聞香員。進一步的，所述的氣質聯用裝置的氣相色譜條件如下載氣為He,流速lmL/min ； 在250°C下解吸9min ;樣品通過彈性石英毛細管柱進行分離，程序升溫條件起始溫度35 45°C，保持I 3min，以4 8°C /min升溫速率升至6(TlO(TC，最後以8 12°C /min升至200^2500C /min保持5 IOmin ;汽化室溫度20(T250°C ;不分流。進一步的，所述的氣質聯用裝置的質譜條件如下電子轟擊電離離子源，電子能5(Tl00eV，發射電流150 250μΑ，電子倍增器電壓30(T400V，離子源溫度150 25(TC，接口溫度20(T300°C，質量範圍33 450u，掃描速度O. Γθ. 5s/scan。優選的，所述步驟a中可溶於水的無機鈣鹽質量為大曲粉質量的O. Γ0. 5%。優選的，所述步驟a中可溶於水的無機鈣鹽為氯化鈣。優選的，所述步驟a中濃度為4(Γ60%的乙醇提取包括如下步驟向大曲粉中加入的濃度為4(Γ60%的乙醇，濃度為40 60%的乙醇與大曲粉的質量比為I : 2 I 4，超聲震蕩l(T50min，500(Tl0000r/min離心l(T30min，取上清液，重複提取2 4次，合併所用上清液，用去離子水將上清液稀釋至乙醇濃度為1(Γ15%。優選的，所述步驟a中水溶性無機鹽為氯化鈉或氯化鉀。優選的，所述步驟a中乾燥劑大曲粉的質量比為I :廣1 2，乾燥劑為無水硫酸鈉或氯化鈣。本發明的有益效果在於本發明大曲中香氣物質的提取方法提取的香氣物質無需解吸附即可用於後續分析，也可以進行稀釋等操作，用於進行後續分析等。因此，給大曲中香氣物質的提取提供了新的選擇。本發明的大曲中香氣物質的分析方法能夠準確高效的分析出大曲中的特徵香氣物質。通過對特徵香氣物質的了解,可以更好地了解大曲品質,有助於更好地指導釀酒生產，填補了釀酒領域的技術空白。本發明方法通過將香氣物質的提取方法與分析方法相配合，實現對大曲中特徵香氣物質的分析鑑定。


圖I頻率檢測法分析中溫大曲中特徵香氣成分圖2香氣提取稀釋法分析中溫大曲中特徵香氣成分圖3頻率檢測法分析高溫大曲中特徵香氣成分
圖4香氣提取稀釋法分析高溫大曲中特徵香氣成分
具體實施例方式本發明大曲中香氣物質的提取方法，包括如下步驟粉碎大曲，加入可溶於水的無機鈣鹽，加入濃度為40飛0%的乙醇提取，收集上清液，加入水溶性無機鹽飽和上清液，用1 1~l 3的戊烷和乙醚溶液萃取2飛次，收集萃取液，去離子水洗滌萃取液，利用溶劑輔助萃取香氣裝置提取香氣物質，加入乾燥劑處理8 12h，過濾，N2吹掃濃縮，即得到香氣物質。進一步的，所述可溶於水的無機鈣鹽質量為大曲粉質量的O. Γ0. 5%。進一步的，所述可溶於水的無機鈣鹽為氯化鈣。具體的，所述加入濃度為4(Γ60%的乙醇提取包括如下步驟向大曲粉中加入的濃度為40 60%的乙醇，濃度為40 60%的乙醇與大曲粉的質量比為I : 2 I 4，超聲震蕩l(T50min，500(Tl0000r/min離心l(T30min，取上清液，重複提取2 4次，合併所用上清液，用去離子水將上清液稀釋至乙醇濃度為1(Γ15%。進一步的，所述的可溶於水的無機鹽為氯化鈉或氯化鉀。進一步的，所述的乾燥劑為無水硫酸鈉或氯化鈣，乾燥劑大曲粉的質量比為I Tl 2。本發明還提供了大曲中香氣物質的分析方法，其特徵在於包括如下步驟a、香氣物質的提取粉碎大曲，加入可溶於水的無機鈣鹽，濃度為4(Γ60%的乙醇提取，收集上清液，加入水溶性無機鹽飽和上清液，用I :廣1 3的戊烷和乙醚溶液萃取2飛次，收集萃取液，去離子水洗滌萃取液，利用溶劑輔助萃取香氣裝置提取香氣物質，加入乾燥劑處理8 12h，過濾，N2吹掃濃縮，即得到香氣物質；b、頻率檢測法分析大曲香氣物質將步驟a得到的香氣物質經氣質聯用裝置分離，記錄下每一種香氣物質的保留時間；同時由6 10名利用連接到氣質聯用裝置上的聞香裝置對被分離的每一種香氣物質進行鑑定，記錄每種香氣物質被聞香員鑑定出來的次數，少於2名聞香員鑑定出來的香氣物質視為幹擾；C、香氣提取稀釋法分析大曲香氣物質採用乙醚按照I :廣1 5的比例稀釋提取的香氣物質，直至所有的香氣物質均無法再嗅聞到，每稀釋一次樣品通過氣質聯用裝置分離，由聞香員鑑定，香氣物質的強度由稀釋比例FD值來表示，FD值高的香氣物質即為特徵香氣物質；其中，所述聞香員為步驟b中鑑定出的香氣物質最多的聞香員。進一步的,所述的氣質聯用裝置的氣相色譜條件如下載氣為He,流速lmL/min ；在250°C下解吸9min ;樣品通過彈性石英毛細管柱進行分離，程序升溫條件起始溫度35 45°C，保持I 3min，以4 8°C /min升溫速率升至6(TlO(TC，最後以8 12°C /min升至200^2500C /min保持5 IOmin ;汽化室溫度20(T250°C ;不分流。進一步的，所述的氣質聯用裝置的質譜條件如下電子轟擊電離離子源，電子能5(Tl00eV，發射電流150 250μΑ，電子倍增器電壓30(T400V，離子源溫度150 25(TC，接口溫度20(T300°C，質量範圍33 450u，掃描速度O. Γθ. 5s/scan。優選的，所述步驟a中可溶於水的無機鈣鹽質量為大曲粉質量的O. Γ0. 5%。優選的，所述步驟a中可溶於水的無機鈣鹽為氯化鈣。
優選的，所述步驟a中濃度為4(Γ60%的乙醇提取包括如下步驟向大曲粉中加入的濃度為4(Γ60%的乙醇，濃度為40 60%的乙醇與大曲粉的質量比為I : 2 I 4，超聲震蕩l(T50min，500(Tl0000r/min離心l(T30min，取上清液，重複提取2 4次，合併所用上清液，用去離子水將上清液稀釋至乙醇濃度為1(Γ15%。優選的，所述步驟a中水溶性無機鹽為氯化鈉或氯化鉀。優選的，所述步驟a中乾燥劑大曲粉的質量比為I :廣1 2，乾燥劑為無水硫酸鈉或氯化鈣。本發明中，大曲是由糧食經發酵得到，含有豐富的糖化酶、酯化酶等，為了防止酶對提取效果的影響，向大曲粉中加入可溶水的無機鈣鹽用以抑制酶活。進一步的研究顯示，可溶於水的無機鈣鹽質量為大曲粉質量的O. Γ0. 5%時，抑制效果好，同時不會對後續香氣物質的提取效果產生影響。氯化鈣為較為常用的試劑，易於獲得，同時對酶活的抑制效果也較好，因此優選使用氯化鈣。
本發明中，4(Γ60%的乙醇用來溶解大曲中含有的香氣物質，經超聲震蕩使香氣物質充分溶解，離心取上清液進行後續操作。重複提取2 4次，可以使香氣物質被充分的提取。乙醇濃度太低會影響提取效率，濃度高有利於提高提取效率。但發明人經試驗發現，乙醇濃度達到4(Γ60%即可滿足條件，更高的濃度乙醇對提取效率影響不大，反而會造成浪費，增加成本。由於在提取過程中乙醇濃度較高，為了不影響後期利用溶劑輔助萃取香氣裝置對香氣物質的提取，發明人經試驗發現，用去離子水將上清液稀釋至乙醇濃度為1(Γ15%即對後續提取效果影響較小。向乙醇提取液中加入可溶於水的無機鹽使提取液飽和，從而讓香氣物質析出。發明人經過多次實驗發現香氣物質在戊烷乙醚(I Γ1 3)中溶解性最好，經多次萃取，可讓香氣物質的收集更為充分。萃取液經溶劑輔助萃取香氣裝置處理以達到濃縮萃取液中香氣物質的目的，加入乾燥劑(優選無水硫酸鈉或氯化鈣)的主要作用是乾燥，除去有機溶劑、水，具有效果快、殘留少等優點。發明人通過進一步的研究發現乾燥劑的用量以乾燥齊U :大曲粉的質量比為I :廣1 2為最佳，既不會造成原料浪費，也不會影響乾燥效果。由於香氣物質的濃度往往比較低，而且提取的時候多用有機溶劑，一般將提取的溶液進行吹乾濃縮，本發明中優選採用氮氣吹掃以達到濃縮的目的。頂空固相微萃取得到的香氣物質是吸附於萃取頭上，無法進一步的進行稀釋分析，而本發明方法的提取的香氣物質溶於溶液中，可以進一步稀釋，為後續的操作提供方便。本發明中將單獨購買的聞香裝置連接到氣質聯用裝置(氣質聯用裝置上帶有聞香裝置的接入接口)上，在採用頻率檢測法和香氣提取稀釋法分析香氣物質時，香氣物質經氣質聯用裝置分離後被分為兩部分，一部分進行定性分析，一部分通過聞香裝置提供給聞香員鑑定。在本發明中，頻率檢測法分析香味物質時鑑定出最多香氣物質的聞香員，其對香味物質的氣味最為敏感，因此在香氣提取稀釋法分析時採用該聞香員。在香氣提取稀釋法分析時，稀釋比例太小則會增加工作量，稀釋比例太大則使得分析的準確性降低。本發明中的聞香員是經過專業培訓，在香味物質的鑑定方面具有豐富的經驗。本發明中，保留值(retention index)是柯瓦(Kovats)於1958年所提出的,所以又稱柯瓦指數。它表示物質在固定液上的保留值行為，是目前使用最廣泛並被國際上公認的定性指針。它具有重現性好、標準統一及溫度係數小等優點。保留指數的物理意義在於它是與被測物質具有相同調整保留時間的假想的正構烷烴的碳數乘以100。保留值沒有單位，是一個與正構烷烴有關的相對值。氣質聯用分離到的化合物的定性分析採用如方式進行與標準已知化合物比對確認；利用直鏈烷烴C6-C26計算化合物的保留值，通過與文獻報導中的保留值對化合物進行鑑定；未知化合物與NIST譜庫和Wiley譜庫(NIST譜庫和Wiley譜庫為氣質聯用儀器中帶有的資料庫)比對，只有當正反匹配度均大於800 (最大值為1000)的鑑定結果才予以確認,無法確認的即為未知化合物。實施例I採用本發明方法分析中溫大曲中的特徵香氣物質取IOg粉碎的中溫大曲粉加入O. Ig氯化鈣抑制酶活，放入50mL離心管，加入15mL50%乙醇溶液浸泡，超聲震蕩30min，10000r/min離心IOmin提取上清液，重複提取兩次。將所有的提取液用去離子水稀釋至14%，稀釋樣品轉入分液漏鬥，加入氯化鈉飽和，用1:1戊烷和乙醚溶液60mL萃取三次，用30mL去離子水洗滌萃取液，利用溶劑輔助萃取香氣裝置(Glasblaserei Bahr,德國)提取香氣物質，提取物加入5g無水硫酸鈉過夜,過濾後用N2吹掃至250 μ L0經氣質聯用儀器分離，分離條件載氣為He,流速lmL/min ;在250°C下解吸9min ;樣品通過DB-WAX彈性石英毛細管柱(30mX0. 25mmXO. 25 μ m,美國Supelco公司生產)進行分離，程序升溫條件起始溫度40°C，保持3min，以5°C /min升溫速率升至80°C，最後以10°C /min升至230°C /min保持7min ;汽化室溫度250°C ;不分流。質譜條件電子轟擊電離(EI)離子源，電子能70eV，發射電流200μΑ，電子倍增器電壓350V，離子源溫度2000C，接口溫度250°C，質量範圍33 450u，掃描速度O. 2s/scan。8名聞香員分別單獨利用氣質聯用聞香裝置(德國Gerstel 0DP2嗅覺檢測器)聞香，記錄下每種香氣物質的嗅聞時間，感官描述，描述人數少於2人的香氣物質視為幹擾，記錄結果見表I和圖I。採用乙醚按照I : 3的比例稀釋提取的香氣物質溶液，直至所有的香氣物質均無法再嗅聞到，每稀釋一次樣品通過氣質聯用裝置聞香，由頻率檢測法中問出香味最多的聞香員嗅聞，香氣物質的強度由稀釋比例FD值來表示，結果見表I和圖2。結果顯示，中溫大曲中的特徵香氣物質為正己醛、未知化合物u2、苯乙醛、4-乙基愈創木酚、未知化合物u5、I-辛烯-3-醇、庚醇、3-甲基丁醇、壬醛、2，6-二甲基吡嗪，其它揮發性化合物作為背景香氣物質存在。表I中溫大曲中特徵香氣物質
權利要求
1.大曲中香氣物質的提取方法，其特徵在於包括如下步驟粉碎大曲，加入可溶於水的無機鈣鹽，加入濃度為4(Γ60%的乙醇提取，收集上清液，加入水溶性無機鹽飽和上清液，用I :廣1 : 3的戊烷和乙醚溶液萃取2飛次，收集萃取液，去離子水洗滌萃取液，利用溶劑輔助萃取香氣裝置提取香氣物質，加入乾燥劑處理8 12h，過濾，N2吹掃濃縮，即得到香氣物質。
2.根據權利要求I所述的大曲中香氣物質的提取方法，其特徵在於所述可溶於水的無機I丐鹽質量為大曲粉質量的O. I "O. 5%。
3.根據權利要求I或2所述的大曲中香氣物質的提取方法，其特徵在於所述可溶於水的無機鈣鹽為氯化鈣。
4.根據權利要求3所述的大曲中香氣物質的提取方法，其特徵在於所述加入濃度為40 60%的乙醇提取包括如下步驟向大曲粉中加入的濃度為40 60%的乙醇，濃度為40 60%的乙醇與大曲粉的質量比為I 2 I 4，超聲震蕩l(T50min，500(Tl0000r/min離心l(T30min，取上清液，重複提取2 4次，合併所用上清液，用去離子水將上清液稀釋至乙醇濃度為10 15%。
5.根據權利要求3或4所述的大曲中香氣物質的提取方法，其特徵在於所述的可溶於水的無機鹽為氯化鈉或氯化鉀。
6.根據權利要求5所述的大曲中香氣物質的提取方法，其特徵在於所述的乾燥劑為無水硫酸鈉或氯化鈣，乾燥劑大曲粉的質量比為I :廣1 2。
7.大曲中香氣物質的分析方法，其特徵在於包括如下步驟 a、香氣物質的提取粉碎大曲，加入可溶於水的無機鈣鹽，濃度為4(Γ60%的乙醇提取，收集上清液，加入水溶性無機鹽飽和上清液，用I :廣1 : 3的戊烷和乙醚溶液萃取2飛次，收集萃取液，去離子水洗滌萃取液，利用溶劑輔助萃取香氣裝置提取香氣物質，加入乾燥劑處理8 12h，過濾，N2吹掃濃縮，即得到香氣物質； b、頻率檢測法分析大曲香氣物質將步驟a得到的香氣物質經氣質聯用裝置分離，記錄下每一種香氣物質的保留時間；同時由6 10名利用連接到氣質聯用裝置上的聞香裝置對被分離的每一種香氣物質進行鑑定，記錄每種香氣物質被聞香員鑑定出來的次數，少於2名聞香員鑑定出來的香氣物質視為幹擾； C、香氣提取稀釋法分析大曲香氣物質採用乙醚按照I :廣1 5的比例稀釋提取的香氣物質，直至所有的香氣物質均無法再嗅聞到，每稀釋一次樣品通過氣質聯用裝置分離，由聞香員鑑定，香氣物質的強度由稀釋比例FD值來表示，FD值高的香氣物質即為特徵香氣物質；其中，所述聞香員為步驟b中鑑定出的香氣物質最多的聞香員。
8.根據權利要求7所述的大曲中香氣物質的分析方法，其特徵在於氣質聯用裝置的氣相色譜條件如下載氣為He,流速lmL/min ;在250°C下解吸9min ;樣品通過彈性石英毛細管柱進行分離，程序升溫條件起始溫度35 45°C，保持f 3min，以4 8°C /min升溫速率升至6(Tl00°C，最後以8 12°C /min升至20(T250°C /min保持5 IOmin ;汽化室溫度200^250 0C ;不分流。
9.根據權利要求8或9所述的大曲中香氣物質的分析方法，其特徵在於氣質聯用裝置的質譜條件如下電子轟擊電離離子源，電子能5(Tl00eV，發射電流15(Γ250μ A，電子倍增器電壓30(T400V，離子源溫度15(T250°C，接口溫度20(T30(TC，質量範圍33 450u，掃描速度0.1~0.5s/scan。
全文摘要
本發明涉及大曲中香氣物質的提取及分析方法，屬於釀酒技術領域。本發明要解決的技術問題是提供一種分析大曲中香氣物質的提取方法。本發明的技術方案是大曲中香氣物質的提取方法。本發明還提供了大曲中香氣物質的分析方法，包括如下步驟a、香氣物質的提取；b、頻率檢測法分析大曲香氣物質；c、香氣提取稀釋法分析大曲香氣物質。本發明的大曲中香氣物質的提取及分析方法能準確、可靠的提取大曲中的香氣物質，並能分析大曲中的特徵香氣物質，有助於更好地了解大曲品質。
文檔編號G01N30/02GK102928536SQ20121043051
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月1日 優先權日2012年11月1日
發明者沈才萍, 張春林, 鄔捷峰, 陶文沂, 王小軍, 塗榮坤, 楊平, 敖宗華, 任劍波 申請人:瀘州品創科技有限公司