一種用於不貼壁細胞免疫染色的染色管及染色方法與流程

2023-06-11 03:45:21 2

本發明涉及一種生物實驗器械和方法，具體地說，涉及一種用於不貼壁細胞免疫染色的染色管及染色方法。

背景技術：

細胞免疫染色是指用標記(一般採用螢光、冷光物質或者酶標記)的抗體對細胞或組織內的相應的抗原進行定性、定位或定量檢測。不貼壁細胞由於漂浮在液體中很難進行免疫染色，一般使用細胞甩片的方法固定於玻片上才能進行免疫組織化學或免疫螢光染色，而甩片過程會影響細胞的自然形態，可能導致染色結果不準確。

中國專利文獻cn102288471a，公開日2011.12.21，公開了一種懸浮細胞的免疫螢光染色方法，所述的染色方法包括以下步驟：先收集細胞於離心管中，800g離心收集細胞，然後分別加入多聚甲醛固定、triton-x100通透、1％bsa封閉，再依次加入一抗、二抗孵育，以上每步操作後都採用800g離心的方法進行洗滌，最後dapi染色後，滴至載玻片上封片觀察。該發明優點在於免疫螢光染色的過程均在離心管中進行，避開了懸浮細胞難於爬片及試驗過程容易脫落的問題，染色結果較好。

然而本申請發明人在長期的實驗過程中，經過細緻觀察和總結，發現上述方法仍然存在一些弊端：1)離心過程中，細胞和處理溶液有較長時間的接觸，處理溶液過長時間接觸可能對染色結果產生不良影響；2)離心後處理溶液並不能被完全倒除，殘餘的處理溶液可能影響下一步的處理效果；3)經離心後細胞全部聚集於錐狀的離心管管底，加入處理溶液後細胞很難全部與處理溶液充分接觸；4)在移除處理溶液的過程中，難以保證細胞不被帶出，造成細胞數量的損失；5)細胞由dapi染色後需要轉移到載玻片上封片觀察，操作繁瑣。以上弊端將直接影響染色效果和結果的準確性，也給實驗人員帶來不便。

綜上所述，亟需一種新的適用於不貼壁細胞的染色方法，以期獲得更準確的染色結果和節省人力。

技術實現要素：

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種用於不貼壁細胞免疫染色的染色管。

本發明的再一的目的是，提供一種用於不貼壁細胞的免疫染色方法。

為實現上述目的，本發明採取的技術方案是：

一種用於不貼壁細胞免疫染色的染色管，設有外管、內管和密封蓋；所述的外管設有外管管體；所述的內管設有內管管體、支撐臺和濾膜；所述的內管管體底面為開口狀，內管管體包括隔離管體和位於隔離管體下方的染色管體，且內管管體的側壁上設有通氣窗；所述的支撐臺位於內管管體的上端端面上，且外徑大於內管管體的外徑；所述的濾膜孔徑為0.5-1.5μm且外緣固定在內管管體的內壁上；所述的密封蓋設有連接部和蓋體，所述的連接部一端連接外管，另一端連接蓋體；裝配狀態下，所述的內管管體套接在外管管體內，所述的支撐臺由外管管體的上端面支撐住，所述的隔離管體使染色管體與外管管體之間留有間隙，所述的通氣窗連通內管管體與所述間隙，所述的蓋體卡扣在內管管體上。

所述的透氣窗設於隔離管體上。

所述的隔離管體為由上至下直徑逐漸縮小的圓臺柱狀。

所述的透氣窗圍繞內管的縱向中心軸呈對稱輻射狀排布。

所述的外管管體的上端端面設有支撐臺面，所述的支撐臺面的外徑大於外管管體的外徑；裝配狀態下，所述的支撐臺由所述支撐臺面支撐住。

所述的外管管體上段為圓柱狀，下段為圓錐狀。

所述的連接部上設有彎折部。

所述的蓋體上設有手柄。

為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是：

一種用於不貼壁細胞的免疫染色方法，所述的免疫染色方法使用了如上任一所述的染色管。

所述的免疫染色方法包括以下步驟：

a)將培養基中懸浮的細胞加入到內管管體中，離心去除培養基，移除廢液；

b)向內管管體中加入固定液，固定細胞，完畢後離心去除固定液，移除廢液；

c)向內管管體中加入triton溶液，打孔穿透細胞，完畢後離心去除triton溶液，移除廢液；

4)然後封閉、一抗孵育、一抗洗滌、二抗孵育、二抗洗滌、dapi復染，每一步處理後均離心去除廢液；

5)免疫染色完成後，拿出內管，直接置於細胞培養板，在細胞培養板中加入適量pbs緩衝液或甘油封片劑，使之覆蓋內管底部的濾膜，放置在倒置顯微鏡下觀察染色。

本發明優點在於：

1、使用本發明的染色管和染色方法對不貼壁細胞進行免疫螢光染色，能夠避免常規染色方法甩片過程影響細胞自然形態的弊端，也可以避免cn102288471a所公開的染色方法的種種弊端，離心過程中，細胞和處理溶液在高速狀態下接觸時間短，溶液處理後去除徹底，同時避免了去除處理溶液過程中細胞的損失，特別適用於微量珍貴細胞的染色，離心後細胞不會過於聚集，能夠與後續步驟的處理溶液充分接觸，染色後可以直接觀察，染色效果好，結果準確性高，操作簡單，節省人力；

2、本發明的染色管結構簡單，成本低廉，便於推廣應用。

附圖說明

圖1是本發明的染色管結構示意圖。

具體實施方式

本申請發明人在長期的實驗過程中，經過細緻觀察和總結，發現中國專利文獻cn201110211736.x所公開的染色方法存在著如前所述的種種弊端，基於此設計了本發明的新的染色方法及配套的染色管。

下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式作詳細說明。

附圖中涉及的附圖標記和組成部分如下所示：

1.外管，11.外管管體，12.支撐臺面

2.內管，21.內管管體，211.隔離管體，212.染色管體，22.支撐臺，23.濾膜

3.密封蓋，31.連接部，311.彎折部，32.蓋體，33.手柄

4.通氣窗

實施例1

請參見圖1，圖1是本發明的染色管結構示意圖。所述的染色管設有外管1、內管2和密封蓋3。所述的外管1設有外管管體11和支撐臺面12；所述的外管管體11上段為圓柱狀，下段為圓錐狀；所述的支撐臺面12位於外管管體11的上端端面上，其外徑大於外管管體11的外徑。所述的內管2設有內管管體21、支撐臺22和濾膜23；所述的內管管體21底面為開口狀，內管管體21包括隔離管體211和染色管體212，所述的隔離管體211位於染色管體212的上方，隔離管體211為由上至下直徑逐漸縮小的圓臺柱狀，且側壁上設有通氣窗4，所述的通氣窗4有四個，圍繞內管2的縱向中心軸呈對稱輻射狀排布，所述的染色管體212為圓柱狀；所述的支撐臺22位於內管管體21的上端端面上，其外徑大於內管管體21的外徑；所述的濾膜23與內管管體21的底面齊平，且外緣固定在內管管體21的內壁上，濾膜23的孔徑為0.5-1.5μm。所述的密封蓋3設有連接部31、蓋體32和手柄33；所述的連接部31的一端連接在外管1的支撐臺面12的側壁上，連接部31上設有彎折部311，連接部31的另一端連接蓋體32；所述的手柄33連接在蓋體上，並向外部延伸。

裝配狀態下，所述的內管管體21套接在外管管體11內，所述的支撐臺22位於支撐臺面12上方並由支撐臺面12支撐住，進而使得內管2不會掉入外管1內部；所述的隔離管體211使染色管體212的外壁與外管管體11的內壁之間留有間隙，所述的通氣窗4使內管管體21的內部與所述間隙相連通；所述的蓋體32卡扣在內管管體21上，密封內管管體21的頂面。

需要說明的是：所述的外管管體11的下段為圓錐狀，更便於廢液被收集到底部。所述的支撐臺面12用於支撐內管2的支撐臺22，支撐臺面12外徑大於外管管體11的外徑，能夠形成較大的上表面，增加平衡穩固的支撐效果。所述的濾膜23孔徑為0.5-1.5μm，細胞無法透過這層膜，液體在靜止狀態時由於表面張力也無法滲過這層膜，當在離心力作用下，液體得以透過這層膜掉入外管1管底，達到移除液體而不損失細胞的目的。濾膜23的材質可以是pe等。濾膜23與內管管體21可以是一體成型，也可以通過熱塑等工藝將其邊緣固定在內管管體21的下端並保證邊緣呈密封狀態。所述的染色管體212用於盛放細胞和染色用的溶液。所述的隔離管體211設計成由上至下直徑逐漸縮小的圓臺柱狀，且側壁上設通氣窗4，作用是使染色管體212的外壁與外管管體11的內壁之間形成間隙，由通氣窗4連通內管管體21的內部與所述間隙，更便於溶液被快速離心至外管1中，減少溶液在高速旋轉狀態下與細胞的接觸時間。所述的通氣窗4不僅限於四個，但優選為對稱分布，可防止離心不平衡，透氣窗4不僅限於設在隔離管體211上，也可以設在染色管體212上，但優選設在隔離管體211上，能防止加液時液體經透氣窗4灑落到內管管體21外部。所述的彎折部311可以預塑成可彎折狀態，如彎折部311的厚度較薄，可便於密封蓋3的開合，且避免蓋體32在連接部31的拉伸作用下不能平衡地卡扣在內管管體21上。所述的手柄33用於拇指和食指把持施力以打開或閉合密封蓋3。

實施例2

一種不貼壁細胞的免疫染色方法，其應用實施例1所述的染色管完成免疫染色操作。更具體地，所述的免疫染色方法包括以下步驟：

1)將培養基中懸浮的細胞加入到內管管體21部分，低速離心去除培養基，移除廢液；

2)向內管管體21中加入固定液，固定細胞，完畢後低速離心去除固定液，移除廢液；

3)向內管管體21中加入triton溶液，打孔穿透細胞，完畢後低速離心去除triton溶液，移除廢液；

4)然後封閉、一抗孵育、一抗洗滌、二抗孵育、二抗洗滌、dapi復染，以此類推，每一步均低速離心去除廢液；

5)免疫染色完成後，去除內管2，直接置於細胞培養板，在細胞培養板中加入適量pbs緩衝液或甘油封片劑，使之覆蓋內管2底部的濾膜23，放置在倒置顯微鏡下觀察染色即可。

使用本發明的染色管和染色方法對不貼壁細胞進行免疫染色，能夠避免常規染色方法中甩片過程影響細胞自然形態的弊端，也可以避免cn102288471a所公開的染色方法的種種弊端，離心過程中，細胞和處理溶液在高速狀態下接觸時間短，處理溶液去除徹底，同時避免了去除處理溶液過程中細胞的損失，特別適用於微量珍貴細胞的染色，離心後細胞不會過於聚集，能夠與後續步驟的處理溶液充分接觸，染色後可以直接觀察，染色效果好，結果準確性高，操作簡單，節省人力，且本發明的染色管結構簡單，成本低廉，便於推廣應用。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護範圍。