一種用於精子dna完整性檢測的精子凍存與復融方法
2023-06-10 22:58:56 2
一種用於精子dna完整性檢測的精子凍存與復融方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，包括以下步驟：(1)將剛取出的患者精液立即輕輕吹打並吸入麥管，裝入冷凍試管內，投入液氮罐中進行冷凍；(2)進行精子DNA完整性檢測前，將冷凍試管從液氮中取出，立即放入37℃水浴中，30秒後取出，加入精子DNA保護緩衝液，混勻，洗滌精子，然後進行精子DNA完整性檢測。本發明的方法不需要添加精子凍存保護劑，不需要等精液液化而直接凍存，步驟簡單，省時。凍存時採用冷凍麥管，外套冷凍試管，能使精子快速冷凍。復融時添加具有抗氧化作用精子DNA保護緩衝液並洗滌精液，以減少操作過程中產生的精子DNA損傷，使精子DNA完整性檢測真實反映冷凍前水平。
【專利說明】一種用於精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用於精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，以及用於凍存的試管，涉及細胞生物學和醫療器械【技術領域】。
【背景技術】
[0002]精子DNA完整性檢測，已越來越多的應用於臨床檢測，但畢竟屬於臨床應用較少的檢測，如對新鮮精液的檢測，難以實現批量檢測。
[0003]為實現批量檢測精子DNA完整性，需將精子凍存，待收集到一定數量的標本後進行復融，然後批量檢測。輔助生殖技術中的精子凍存和復甦，需在精液取出30分鐘液化後再添加保護劑，保證有儘可能多的活動精子以利於受精。但是，操作時間過長，會導致部分精子的DNA損傷，而冷凍保護劑裡保護精子膜不受損的甘油等成分也會對精子的DNA造成一定程度的損傷。大量研究文獻證明精子凍存技術會導致一定程度的精子DNA損傷，特別是對畸形精子DNA的損傷，這樣凍存後再檢測就不能真實反映凍存前精子DNA完整性情況。
【發明內容】
[0004]針對上述現有技術，本發明提供了一種用於精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，以及用於凍存的試管。
[0005]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0006]一種用於精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，包括以下步驟:
[0007](I)將剛取出的患者精液立即輕輕吹打，取一麥管，先吸入5mm的精子DNA保護緩衝液，再吸入2mm的空氣,然後吸入精液,約0.5ml,然後再吸入2mm的空氣,再吸入5mm的精子DNA保護緩衝液，用加熱法將麥管的液體進入端密封，然後將連接吸管端用木籤(比如尖頭木籤)密封，然後裝入冷凍試管內，旋緊冷凍試管螺紋蓋，裝入紗袋中，立即投入液氮罐中進行冷凍；
[0008]所述冷凍試管的結構為:包括管體，管體頂部設有螺紋蓋，管體底部設有鋼塊(目的是增加重量，使試管容易沉入液氮中)，管體的管壁上設有多個小孔(目的是:冷凍時，液氮可快速通過小孔進入試管內，對麥管內的精液進行快速冷凍)。
[0009]優選的，所述冷凍試管的管體長25cm,內徑1.5cm,管壁厚度為0.05cm,管壁上遍布直徑為0.2cm的小孔。
[0010]優選的，所述管體的材質為聚丙烯材料。
[0011]所述麥管為商品化麥氏凍存管。
[0012](2)進行精子DNA完整性檢測前，將冷凍試管從液氮中取出，立即放入37°C水浴中，30秒後取出，打開試管封蓋，取出所有冷凍麥管，用紙巾輕輕擦拭麥管，剪掉採用加熱法密封的密封端，並將此端對準0.5離心管，拔掉另一端的木籤，將精液從木籤端採用吸管吹入離心管；將一個患者所有凍存復融精液混勻後，按體積比1:1的比例加入精子DNA保護緩衝液，混勻，洗滌精子，然後進行常規的精子DNA完整性檢測。
[0013]所述精子DNA保護緩衝液是通過以下方法製備得到的:取8.5克氯化鈉、2.2克磷酸氫二鈉以及0.2克磷酸二氫鈉，溶解於蒸餾水中，定容至1000毫升，調pH值(氫氧化鈉溶液或鹽酸調整)為7.4，即為pH7.4的磷酸緩衝液；取300 μ I吐溫-20以及0.1克維生素C，加入100毫升磷酸緩衝液中，混勻，即為精子DNA保護緩衝液。
[0014]所述洗滌精子的方法如下:凍存復融精液和精子DNA保護緩衝液混勻後，置於10毫升離心管中，以2500轉/分轉速離心5分鐘，棄上清，再加2毫升精子DNA保護緩衝液，混勻，製成精子懸液，待測。
[0015]常規方法中，添加冷凍保護劑的主要目的是保護精子膜，以免影響精子的活動力。若不添加保護劑直接凍存精子，會損傷精子膜，精子不再運動，但精子核DNA並不會受損，不會影響精子DNA完整性檢測。本發明的方法在精液取出後不經過液化過程，不添加精子冷凍保護劑，立即裝入精子凍存麥管，縮短了操作時間，儘可能地減少了操作對精子DNA完整性的影響。復融過程中，通過迅速加入具有抗氧化劑成分的緩衝液並洗滌精子，儘快進行精子DNA完整性檢測，就可以真實反映冷凍前精子DNA完整性的水平，從而實現精子DNA完整性檢測的批量操作，進而實現規範化操作。
[0016]本發明的方法，不需要添加精子凍存保護劑，不需要等精液液化而直接凍存，步驟簡單，省時。凍存時採用0.5ml精子冷凍麥管，外套本發明特製的四周具有小孔的冷凍試管，能使精子快速冷凍。復融時添加具有抗氧化作用精子DNA保護緩衝液並洗滌精液，以減少操作過程中產生的精子DNA損傷，使精子DNA完整性檢測真實反映冷凍前水平。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1:麥管吸入緩衝液和精液並封口的結構示意簡圖。
[0018]圖2:冷凍試管的結構示意圖。
[0019]其中，1、麥管；2、木籤；3、緩衝液段；4、空氣段；5、精液段；6、管體；7、螺紋蓋；8、鋼塊；9、小孔。
【具體實施方式】
[0020]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0021]實施例1用於精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，包括以下步驟:
[0022](I)將剛取出的患者精液立即輕輕吹打，取一麥管，先吸入5mm的精子DNA保護緩衝液，再吸入2mm的一段空氣，然後吸入精液，約0.5ml，然後再吸入2mm的空氣，再吸入5mm的精子DNA保護緩衝液(所述5mm、2mm是指吸入麥管後空氣或緩衝液所佔據的長度)，用加熱法將麥管的液體進入端密封，然後將連接吸管端用木籤密封(如圖1所示，麥管I的一端用木籤2密封，從木籤密封端開始，依次是5mm長的緩衝液段3、2mm長的空氣段4、精液段
5、2mm長的空氣段4、5mm長的緩衝液段3、加熱法密封端)，然後裝入冷凍試管內，旋緊冷凍試管螺紋蓋，裝入紗袋中，立即投入液氮罐中進行冷凍；
[0023]所述冷凍試管的結構為:包括管體6，管體6頂部設有螺紋蓋7，管體6底部設有鋼塊8(目的是增加重量,使試管容易沉入液氮中)，如圖2所示，管體6長25cm,內徑1.5cm,管壁厚度為0.05cm,管壁上遍布直徑為0.2cm的小孔9。所述管體6的材質可以為聚丙烯材料。
[0024](2)進行精子DNA完整性檢測前，將冷凍試管從液氮中取出，立即放入37°C水浴中，30秒後取出，打開試管封蓋，取出所有冷凍麥管，用紙巾輕輕擦拭麥管，剪掉採用加熱法密封的密封端，並將此端對準0.5離心管，拔掉另一端的木籤，將精液從木籤端採用吸管吹入離心管；將一個患者所有凍存復融精液混勻後，按體積比1:1的比例加入精子DNA保護緩衝液，混勻，洗滌精子，然後進行常規的精子DNA完整性檢測。
[0025]所述精子DNA保護緩衝液是通過以下方法製備得到的:取8.5克氯化鈉、2.2克磷酸氫二鈉以及0.2克磷酸二氫鈉，溶解於蒸餾水中，定容至1000毫升，調pH值(氫氧化鈉溶液或鹽酸調整)為7.4，即為pH7.4的磷酸緩衝液；取300 μ I吐溫-20以及0.1克維生素C，加入100毫升磷酸緩衝液中，混勻，即為精子DNA保護緩衝液。
[0026]所述洗滌精子的方法如下:凍存復融精液和精子DNA保護緩衝液混勻後，置於10毫升離心管中，以2500轉/分轉速離心5分鐘，棄上清，再加2毫升精子DNA保護緩衝液，混勻，製成精子懸液，待測。
【權利要求】
1.一種用於精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，其特徵在於:包括以下步驟: (1)將剛取出的患者精液立即輕輕吹打，取一麥管，先吸入5mm的緩衝液，再吸入2mm的空氣，然後吸入精液0.5ml，然後再吸入2mm的空氣，再吸入5mm的緩衝液，用加熱法將麥管的液體進入端密封，然後將連接吸管端用木籤密封，然後裝入冷凍試管內，旋緊冷凍試管螺紋蓋，裝入紗袋中，立即投入液氮罐中進行冷凍； (2)進行精子DNA完整性檢測前，將冷凍試管從液氮中取出，立即放入37°C水浴中，30秒後取出，擰開試管螺紋蓋，取出麥管，剪掉採用加熱法密封的密封端，並將此端對準離心管，拔掉另一端的木籤，將精液從木籤端採用吸管吹入離心管；按體積比1:1的比例加入精子DNA保護緩衝液，混勻，洗滌精子，然後進行常規的精子DNA完整性檢測。
2.根據權利要求1所述的用於精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，其特徵在於:所述冷凍試管的結構為:包括管體，管體頂部設有螺紋蓋，管體底部設有鋼塊，管體的管壁上設有多個小孔。
3.根據權利要求1或2所述的用於精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，其特徵在於:所述冷凍試管長25cm,內徑1.5cm,管壁厚度為0.05cm,管壁上遍布直徑為0.2cm的小孔。
4.根據權利要求1或2所述的用於精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，其特徵在於:所述冷凍試管的管體的材質為聚丙烯材料。
5.根據權利要求1所述的用於精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，其特徵在於:所述精子DNA保護緩衝液是通過以下方法製備得到的:取8.5克氯化鈉、2.2克磷酸氫二鈉以及0.2克磷酸二氫鈉,溶解於蒸懼水中，定容至1000毫升,調pH值為7.4,即為pH7.4的磷酸緩衝液；取30(^ I吐溫-20以及0.1克維生素C，加入100毫升磷酸緩衝液中，混勻，即為精子DNA保護緩衝液。
6.根據權利要求1所述的用於精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，其特徵在於:所述洗滌精子的方法如下:凍存復融精液和精子DNA保護緩衝液混勻後，置於10毫升離心管中，以2500轉/分轉速離心5分鐘，棄上清，再加2毫升精子DNA保護緩衝液，混勻，製成精子懸液，待測。
7.一種用於精子DNA完整性檢測的精子凍存的冷凍試管，其特徵在於:所述冷凍試管的結構為:包括管體，管體頂部設有螺紋蓋，管體底部設有鋼塊，管體的管壁上設有多個小孔。
8.根據權利要求7所述的冷凍試管，其特徵在於:所述冷凍試管的管體長25cm，內徑1.5cm,管壁厚度為0.05cm,管壁上遍布直徑為0.2cm的小孔。
9.根據權利要求7所述的冷凍試管，其特徵在於:所述冷凍試管的管體的材質為聚丙烯材料。
10.一種用於精子DNA完整性檢測的精子復融的精子DNA保護緩衝液，其特徵在於:是通過以下方法製備得到的:取8.5克氯化鈉、2.2克磷酸氫二鈉以及0.2克磷酸二氫鈉，溶解於蒸餾水中，定容至1000毫升，調pH值為7.4，即為pH7.4的磷酸緩衝液；取300 μ I吐溫-20以及0.1克維生素C，加入100毫升磷酸緩衝液中，混勻，即為精子DNA保護緩衝液。
【文檔編號】A01N1/02GK104396945SQ201410723087
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月3日 優先權日:2014年12月3日
【發明者】張麗紅, 王秋菊, 蓋凌, 劉蓓, 許觀照, 張偉, 孫林, 李希合, 王琳琳, 蔣寶宏, 王洪巖 申請人:張麗紅