一種採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法

2023-06-10 11:45:36 2

專利名稱：一種採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備高鹽稀態醬油的方法，尤其涉及一種採用固定化細胞發酵制
備高鹽稀態醬油的方法。
背景技術：
醬油是一種歷史悠久的調味品，目前國內的醬油的釀造方法主要有高鹽稀態發酵 法和低鹽固態發酵法兩種。低鹽固態發酵法發酵周期短，但是產品風味遠不如高鹽稀態發 酵法。高鹽稀態釀造法是以黃豆和麵粉為主料，經米麴黴等微生物發酵制曲，利用高鹽稀態 天然曬露的發酵方法釀造而成。高鹽稀態發酵工藝的發酵過程主要有兩個階段的生物化學 變化第一階段是在發酵初期，即發酵的前60 90天，主要是由米麴黴在大曲製備過程中 所產生的蛋白酶、糖化酶將原料中的蛋白質分解成胺基酸(醬油中的主要成分)和還原糖， 形成醬油的鮮味物質，同時也會產生少量具有醬香風味的成分；第二階段是在發酵後期，主 要由一些酵母菌、乳酸菌等微生物在發酵過程中不斷產生乙醇、乳酸等有機化合物，通過復 雜的生物化學變化生成醬油中主要風味物質，形成高鹽稀態醬油獨有的醇厚醬香風味，如 乙醇、乳酸、4_乙烯基愈創酚等。因此，高鹽稀態發酵需要4-6個月的時間才能形成醬油醇 厚的醬香風味，但具有發酵時間長，設備利用率低的缺點。 傳統方法對提升醬油風味的研究主要針對於原料配比、原料特殊處理、菌種改造、 添加物及發酵過程中控制關鍵工藝參數等。醬油發酵技術幾千年的發展，雖然使得傳統方 法的研究對提升醬油的風味有一定的幫助，但隨著工藝技術的不斷升級，醬油發酵中傳統 的工藝參數已經基本確定，變化幅度較小，對提升醬油風味的空間非常有限；適當延長發酵 周期雖然可以提高其產品風味，但發酵周期超過120-150天後，風味改善的效果不明顯，且 延長發酵周期限制了設備的周轉利用，無形中提高了生產成本；其次，在醬油發酵的長期過 程中，其產品風味受原料的差異、各地自然條件、氣候因素的變化等多方面因素影響，產品 風味的穩定性較難控制。 固定化細胞發酵是近年來飛速發展的生物工程技術，它是把微生物細胞附著固定 在一定載體上，反應器中單位體積含菌量大大超過常規發酵含菌量，因而能提高發酵速率 並縮短髮酵周期。 日本於1982年開始研究把固定化細胞發酵用於醬油釀造，其後研究人員作了大 量固定化耐鹽酵母菌和乳酸菌的試驗。但都是採用低鹽發酵液為底物，用海藻酸鈉、聚乙稀 醇或陶瓷製品為載體，分別固定耐鹽酵母菌和乳酸菌。據國外研究表明通過固定化細胞工 藝，固定化細胞濃度和代謝產物均比自由細胞提高，固定化細胞發酵產品的理化分析值符 合傳統釀造醬油標準，但感官品評仍然達不到傳統高鹽稀態釀造醬油的水平。目前還沒有 生產企業能實現細胞固定化技術在高鹽稀態釀造醬油的實際生產過程中的產業化應用。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法，該方法不僅能提升高鹽稀態醬油風味並縮短了醬油發酵的周期，而且還能 克服高鹽稀態發酵法發酵周期長、設備利用率低、生產成本偏高的缺點。 本發明的目的是通過以下技術措施來實現的一種採用固定化細胞發酵製備高鹽 稀態醬油的方法，其包括以下步驟 (1)用傳統的高鹽稀態發酵法製備醬油，製得經60-90天發酵的醬油原液備用；
(2)取經活化的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種菌種 分別製成固定化細胞粒子； (3)取步驟(2)中製得的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌
四種菌種的固定化細胞粒子按照質量比o 3 : o 3 : 3 5 : o. 1 l進行復配得到
混合固定化細胞粒子；然後以接種量為10-30% (W/V)將混合固定化細胞粒子接種至步驟
(1)所得的高鹽稀態發酵醬油原液中，在溫度28-33t:連續發酵15-24小時； (4)發酵結束後，將該發酵成熟的高鹽稀態發酵醬油與固定化細胞粒子分離後得
高鹽稀態發酵醬油成品。 本發明的步驟(2)中球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四 種菌種的活化及它們的固定化細胞粒子的製備採用現有的方法都可實現本發明的目的。而 作為其中一種實施方式，固定化細胞粒子可通過以下步驟製得 取經活化的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種菌種的 菌液分別與海藻酸鈉膠液按1 : 15 25的體積比混合製備成細胞懸浮液，然後將細胞懸 浮液滴注入質量百分比濃度為2% (W/W)氯化鈣溶液中，即分別得到球擬酵母、魯氏酵母、 生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種菌種的固定化細胞粒子。 所述的海藻酸鈉膠液的質量百分比濃度為1. 5 3. 5% ;所述的質量百分比濃度 為2% (W/W)的氯化鈣溶液的添加量與海藻酸鈉菌液的體積比為1. 5 3 : 1 (V/V)。
所述的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種菌種的固定 化細胞粒子均可要求固定化細胞粒子中的平均含菌量為106 108個/顆粒，可確保各菌種 在醬油發酵原料中具有適合的濃度，並保證醬油發酵原料能夠充分發酵，提高了發酵速度， 得到良好的發酵效果。 本發明可在步驟(3)的高鹽稀態發酵醬油原液中添加質量百分比濃度為5 10% (W/W)的液化糖漿，其添加量為高鹽稀態發酵醬油原液總重量的5 20% (W/W)，為球擬酵 母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌的發酵提供足夠的養分，以促進各菌種的 繁殖生長，有利於產生有效的風味物質，使最終得到的醬油的感官風味獨特、醬香醇厚。
本發明可做以下改進在步驟(3)中所述的連續發酵過程中每隔30 60min進行 一次攪拌；每次攪拌的時間為2 5min，攪拌速度可以是在80 150r/min範圍內。在發 酵過程中進行攪拌，發酵物料中的菌種和養分均勻分布並能與發酵原液充分接觸，並提高 溶解氧的效率，提高發酵效率及效果。 在本發明步驟(4)中發酵成熟的高鹽稀態發酵醬油與固定化細胞粒子分離採用
現有技術中行之有效的分離方法均可，包括離心分離、過濾等。 本發明與現有技術相比具有以下有益效果 (1)本發明是在傳統的高鹽稀態醬油的生產工藝基礎上，利用固定化細胞技術，用 混合的菌種對發酵時間為60-90天的醬油原液進行發酵，改善醬油中醇類、酚類、酯類及雜環類化合物等風味物質的含量及其比例。經檢測，利用該工藝發酵的醬油與需發酵120-150 天的傳統工藝得到的醬油相比，其l-辛烯-3-醇、乙醇、4-乙烯基愈創酚等幾種主要風味物 質的含量都有明顯提高，從而提升高鹽稀態發酵醬油風味，得到感官風味獨特、醬香醇厚的 醬油。 (2)本發明的生產周期在60 90天左右，大大縮短了高鹽稀態發酵醬油的生產周 期，提高了發酵設備的利用率，降低了生產成本。 (3)本發明中的各菌種進行細胞固定化後，可以回收重複使用，在發酵過程中對風 味的控制較為穩定。
具體實施方式

實施例一 採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法 (1)分別取球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母，分別用質量百分比濃度為 2% (W/W)的蔗糖溶液在3(TC恆溫條件下活化，使各酵母菌種活力充分恢復，然後擴培、離
心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 5(w/v)。
(2)將醬油四聯球菌菌種接種到脫脂乳培養基中活化3次以上，使菌種活力充分
恢復，然後擴培離心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 20(w/v)。 (3)採用傳統高鹽稀態醬油發酵法製備得到經發酵60天的高鹽稀態醬油原液，備用。 (4)菌種固定化粒子的製備方法將步驟(1)和步驟(2)製備的球擬酵母、魯氏酵 母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯球菌的菌液分別與質量百分比濃度為2% (W/W)海藻酸 鈉膠液按l : 20(V/V)的體積比混合成細胞懸浮液，然後將細胞懸浮液滴注入質量百分比 濃度為2% (W/W)氯化鈣溶液中，其中2%氯化鈣溶液與海藻酸鈉細胞懸浮液的體積比為
2 : 1(v/v)，即分別得到球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯球菌的珠狀固
定化海藻酸鈣粒子。按上述方法製備得到相應的固定化細胞粒子。要求各固定化細胞粒子
的平均含菌量為106個/顆粒，然後將球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯
球菌四種固定化細胞粒子的按i :i:3: o.s的質量比復配混合。 (5)取100kg步驟(3)所得的高鹽稀態醬油原液，添加10kg質量百分比濃度為 10%的液化糖漿，將製備好的混合菌種固定化細胞粒子接種到醬油原液，接種量為20% (W混合菌稲定化細鵬子/V高鹽稀態醫油原液)，然後進行發酵，在發酵溫度^C下連續發酵24小時，每 隔30min進行攪拌2min，攪拌速度120r/min。 (6)發酵結束後，將發酵成熟的醬油與固定化細胞粒子過濾分離，得到高鹽稀態醬 油。回收後的固定化細胞粒子可進行下一次發酵。 成分比較分析利用固相微萃取一氣質聯用的方法對120天傳統工藝發酵的醬油 樣本和利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本的揮發性風味成分進行分析。檢測結果表明 利用固定化細胞發酵的醬油樣本比120天發酵的醬油樣本中的l-辛烯-3-醇的含量提高 20%，4-乙烯基愈創酚含量提高了 30%，總酯提高了 8%，乙酸乙酯提高了 5%。
感官比較對120天傳統工藝發酵成熟醬油樣本和利用固定化細胞技術發酵的醬 油樣本進行感官評定。感官評定結果表明利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本的醬油風味比120天傳統工藝發酵的醬油樣本有明顯改善，醬香更為醇厚。
實施例二 採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法 (1)分別取球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母，分別用質量百分比濃度為 2% (W/W)的蔗糖溶液在3(TC恆溫條件下活化，使各酵母菌種活力充分恢復，然後擴培、離
心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 4(w/v)。
(2)將醬油四聯球菌菌種接種到脫脂乳培養基中活化3次以上，使菌種活力充分
恢復，然後擴培離心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : i5(w/v)。 (3)採用傳統高鹽稀態醬油發酵法製備得到經發酵70天的高鹽稀態醬油原液，備 用。 (4)菌種固定化粒子的製備方法將步驟(1)和步驟(2)製備的球擬酵母、魯氏 酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯球菌菌液分別與質量百分比濃度為3% (W/W)的海藻 酸鈉膠液按l : 15(V/V)的體積比混合成細胞懸浮液，然後將細胞懸浮液滴注入質量百 分比濃度為2% (W/W)的氯化鈣溶液中，其中2%氯化鈣溶液與海藻酸鈉細胞懸浮液的體
積比為i.5 : 1(v/v)，即分別得到球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯球
菌的珠狀固定化海藻酸鈣粒子。要求各固定化細胞粒子的平均含菌量為107個/顆粒， 然後將球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種固定化細胞粒子的按
l:2:4: 0.3的質量比復配混合。 (5)取100kg步驟(3)所得的高鹽稀態醬油原液，添加13kg質量百分比濃度為8X (W/W)的液化糖漿，將製備好的混合菌種固定化細胞粒子接種到醬油原液，接種量為15%
(w混合菌稲定化細鵬子/v高鹽稀態醫油原液)，然後進行發酵，在發酵溫度;3(rc下連續發酵1S小時，每
隔60min進行攪拌5min，攪拌速度100r/min。 (6)發酵結束後，將發酵成熟的醬油與固定化細胞粒子過濾分離，得到高鹽稀態醬 油。回收後的固定化細胞粒子可進行下一次發酵。 成分比較分析利用固相微萃取一氣質聯用的方法對120天傳統工藝發酵的醬油 樣本和利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本的揮發性風味成分進行分析。檢測結果表明 利用固定化細胞發酵的醬油樣本比120天發酵的醬油樣本中的l-辛烯-3-醇的含量提高 23%，4-乙烯基愈創酚含量提高了 28. 74%，總酯提高了 10%，乙酸乙酯提高了 5%。
感官比較對120天傳統工藝發酵成熟醬油樣本和利用固定化細胞技術發酵的醬 油樣本進行感官評定。感官評定結果表明利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本的醬油風 味比120天傳統工藝發酵的醬油樣本有明顯改善，醬香更為醇厚。
實施例三 採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法 (1)分別取球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母，分別用質量百分比濃度為 2% (W/W)的蔗糖溶液在3(TC恆溫條件下活化，使各酵母菌種活力充分恢復，然後擴培、離
心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 6(w/v)。 (2)將醬油四聯球菌菌種接種到脫脂乳培養基中活化3次以上，使菌種活力充分
恢復，然後擴培離心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 25(w/v)。 (3)採用傳統高鹽稀態醬油發酵法製備得到經發酵90天的高鹽稀態醬油原液，備用。 (4)菌種固定化粒子的製備方法將步驟(1)和步驟(2)製備的球擬酵母、魯氏酵 母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯球菌菌液分別與質量百分比濃度為2% (W/W)的海藻酸 鈉膠液按l : 25(V/V)的體積比混合成細胞懸浮液，然後將細胞懸浮液滴注入質量百分比 濃度為2%氯化鈣溶液中，其中2%氯化鈣溶液與海藻酸鈉細胞懸浮液的體積比為2 : 1(V/ V)，即分別得到球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯球菌的珠狀固定化海藻 酸鈣粒子。要求各固定化細胞粒子的平均含菌量為107個/顆粒，然後將球擬酵母、魯氏酵
母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種固定化細胞粒子的按i:3:3:i的質量比 復配混合。 (5)取100kg步驟(3)所得的高鹽稀態醬油原液，添加20kg質量百分比濃度 為5%的液化糖漿，將製備好的混合菌種固定化細胞粒子接種到醬油原液，接種量為25%
(w混合菌稲定化細鵬子/v高鹽稀態醫油原液)，然後進行發酵，在發酵溫度rc下連續發酵is小時，每
隔30min進行攪拌3min，攪拌速度100r/min。 (6)發酵結束後，將發酵成熟的醬油與固定化細胞粒子過濾分離，得到高鹽稀態醬 油。回收後的固定化細胞粒子可進行下一次發酵。 成分比較分析利用固相微萃取一氣質聯用的方法對120天傳統工藝發酵的醬油 樣本和利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本的揮發性風味成分進行分析。檢測結果表明 利用固定化細胞發酵的醬油樣本比120天發酵的醬油樣本中的l-辛烯-3-醇的含量提高 20%，4-乙烯基愈創酚含量提高了 33. 5%，總酯提高了 8%，乙酸乙酯提高了 3%。
感官比較對120天傳統工藝發酵成熟醬油樣本和利用固定化細胞技術發酵的醬 油樣本進行感官評定。感官評定結果表明利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本的醬油風 味比120天傳統工藝發酵的醬油樣本有明顯改善，醬香更為醇厚。
實施例四 採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法 (1)分別取魯氏酵母、生香賽特假絲酵母，分別用質量百分比濃度為2% (W/W)的 蔗糖溶液在3(TC恆溫條件下活化，使各酵母菌種活力充分恢復，然後擴培、離心，用無菌水
稀釋待用，菌種:無菌水=i : 5謂。 (2)將醬油四聯球菌菌種接種到脫脂乳培養基中活化3次以上，使菌種活力充分
恢復，然後擴培離心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 20(w/v)。 (3)採用傳統高鹽稀態醬油發酵法製備得到經發酵80天的高鹽稀態醬油原液，備 用； (4)菌種固定化粒子的製備方法將步驟(1)和步驟(2)製備的魯氏酵母、生香 賽特假絲酵母和醬油四聯球菌的菌液分別與質量百分比濃度為2% (W/W)海藻酸鈉膠液按 1 : 20(V/V)的體積比混合成細胞懸浮液，然後將細胞懸浮液滴注入質量百分比濃度為2% (W/W)氯化鈣溶液中，其中2%氯化鈣溶液與海藻酸鈉細胞懸浮液的體積比為3 : 1(V/V)， 即分別得到魯氏酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯球菌的珠狀固定化海藻酸鈣粒子。要 求各固定化細胞粒子的平均含菌量為io8個/顆粒，然後將魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及 醬油四聯球菌三種固定化細胞粒子的按2 : 3 : 0.5的質量比復配混合。 (5)取100kg步驟(3)所得的高鹽稀態醬油原液，添加10kg質量百分比濃度為10%的液化糖漿，將製備好的混合菌種固定化細胞粒子接種到醬油原液，接種量為30% (W混合菌稲定化細鵬子/V高鹽稀態醫油原液)，然後進行發酵，在發酵溫度^C下連續發酵24小時，每 隔30min進行攪拌2min，攪拌速度120r/min。 (6)發酵結束後，將發酵成熟的醬油與固定化細胞粒子過濾分離，得到高鹽稀態醬 油。回收後的固定化細胞粒子可進行下一次發酵。 成分比較分析利用固相微萃取一氣質聯用的方法對120天傳統工藝發酵的醬油 樣本和利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本的揮發性風味成分進行分析。檢測結果表明 利用固定化細胞發酵的醬油樣本比120天發酵的醬油樣本中的l-辛烯-3-醇的含量提高 18%，4-乙烯基愈創酚含量提高了 22.8%，總酯提高了 9%，乙酸乙酯提高了 3%。
感官比較對120天傳統工藝發酵成熟醬油樣本和利用固定化細胞技術發酵的醬 油樣本進行感官評定。感官評定結果表明利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本的醬油風 味比120天傳統工藝發酵的醬油樣本有改善，醬香較為醇厚。
實施例五 採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法 (1)分別取魯氏酵母、生香賽特假絲酵母，分別用質量百分比濃度為2% (W/W)的 蔗糖溶液在3(TC恆溫條件下活化，使各酵母菌種活力充分恢復，然後擴培、離心，用無菌水
稀釋待用，菌種:無菌水=i : 6謂。
(2)將醬油四聯球菌菌種接種到脫脂乳培養基中活化3次以上，使菌種活力充分
恢復，然後擴培離心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 25(w/v)。 (3)採用傳統高鹽稀態醬油發酵法製備得到經發酵75天的高鹽稀態醬油原液，備 用； (4)菌種固定化粒子的製備方法將步驟(1)和步驟(2)製備的魯氏酵母、生香賽 特假絲酵母和醬油四聯球菌菌液分別與質量百分比濃度為1.5% (W/W)的海藻酸鈉膠液按 1 : 23(V/V)的體積比混合成細胞懸浮液，然後將細胞懸浮液滴注入質量百分比濃度為2% 氯化鈣溶液中，其中2%氯化鈣溶液與海藻酸鈉細胞懸浮液的體積比為2.5 : 1(V/V)，即分 別得到魯氏酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯球菌的珠狀固定化海藻酸鈣粒子。要求各 固定化細胞粒子的平均含菌量為107個/顆粒，然後將魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油
四聯球菌三種固定化細胞粒子的按3:4:i的質量比復配混合。 (5)取100kg步驟(3)所得的高鹽稀態醬油原液，添加20kg質量百分比濃度 為5%的液化糖漿，將製備好的混合菌種固定化細胞粒子接種到醬油原液，接種量為10%
(w混合菌稲定化細鵬子/v高鹽稀態醫油原液)，然後進行發酵，在發酵溫度rc下連續發酵is小時，每
隔30min進行攪拌3min，攪拌速度100r/min。 (6)發酵結束後，將發酵成熟的醬油與固定化細胞粒子過濾分離，得到高鹽稀態醬 油。回收後的固定化細胞粒子可進行下一次發酵。 成分比較分析利用固相微萃取一氣質聯用的方法對120天傳統工藝發酵的醬油 樣本和利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本的揮發性風味成分進行分析。檢測結果表明 利用固定化細胞發酵的醬油樣本比120天發酵的醬油樣本中的l-辛烯-3-醇的含量提高 18. 6%，4-乙烯基愈創酚含量提高了 20. 7%，總酯提高了 6%，乙酸乙酯提高了 2%。
感官比較對120天傳統工藝發酵成熟醬油樣本和利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本進行感官評定。感官評定結果表明利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本的醬油風 味比120天傳統工藝發酵的醬油樣本有改善，醬香較為醇厚。
實施例六 採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法 (1)分別取球擬酵母、生香賽特假絲酵母，分別用質量百分比濃度為2% (W/W)的 蔗糖溶液在3(TC恆溫條件下活化，使各酵母菌種活力充分恢復，然後擴培、離心，用無菌水
稀釋待用，菌種:無菌水=i : 6謂。
(2)將醬油四聯球菌菌種接種到脫脂乳培養基中活化3次以上，使菌種活力充分
恢復，然後擴培離心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 25(w/v)。 (3)採用傳統高鹽稀態醬油發酵法製備得到經發酵90天的高鹽稀態醬油原液，備 用； (4)菌種固定化粒子的製備方法將步驟(1)和步驟(2)製備的球擬酵母、生香賽 特假絲酵母和醬油四聯球菌菌液分別與質量百分比濃度為2.5% (W/W)的海藻酸鈉膠液按 1 : 18(V/V)的體積比混合成細胞懸浮液，然後將細胞懸浮液滴注入質量百分比濃度為2% 氯化鈣溶液中，其中2%氯化鈣溶液與海藻酸鈉細胞懸浮液的體積比為2 : 1(V/V)，即分別 得到球擬酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯球菌的珠狀固定化海藻酸鈣粒子。要求固定 化細胞粒子的平均含菌量為107個/顆粒，然後將球擬酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯
球菌三種固定化細胞粒子的按3:3:i的質量比復配混合。 (5)取100kg步驟(3)所得的高鹽稀態醬油原液，添加20kg質量百分比濃度 為5%的液化糖漿，將製備好的混合菌種固定化細胞粒子接種到醬油原液，接種量為25%
(w混合菌稲定化細鵬子/v高鹽稀態醫油原液)，然後進行發酵，在發酵溫度;3(rc下連續發酵加小時，每
隔30min進行攪拌3min，攪拌速度100r/min。 (6)發酵結束後，將發酵成熟的醬油與固定化細胞粒子過濾分離，得到高鹽稀態醬 油。回收後的固定化細胞粒子可進行下一次發酵。 成分比較分析利用固相微萃取一氣質聯用的方法對120天傳統工藝發酵的醬油 樣本和利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本的揮發性風味成分進行分析。檢測結果表明 利用固定化細胞發酵的醬油樣本比120天發酵的醬油樣本中的l-辛烯-3-醇的含量提高 15%，4-乙烯基愈創酚含量提高了 13%，總酯提高了 10%，乙酸乙酯提高了 5%。
感官比較對120天傳統工藝發酵成熟醬油樣本和利用固定化細胞技術發酵的醬 油樣本進行感官評定。感官評定結果表明利用固定化細胞技術發酵的醬油樣本的醬油風 味比120天傳統工藝發酵的醬油樣本有改善，醬香較為醇厚。 本發明可用其他的不違背本發明的精神或主要特徵的具體形式來概述。本發明的 上述實施方案都只能認為是對本發明的說明而不是限制，因此在與本發明的權利要求書相 當的含義和範圍內的任何改變，都應認為是包括在權利要求書的範圍內。
權利要求
一種採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法，其特徵是，其包括以下步驟(1)用傳統的高鹽稀態發酵法製備醬油，製得經60-90天發酵的醬油原液備用；(2)取經活化的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種菌種分別製成固定化細胞粒子；(3)取步驟(2)中製得的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種菌種的固定化細胞粒子按照質量比例0～1∶0～3∶3～5∶0.1～1進行復配得到混合固定化細胞粒子；然後以接種量為10-30％(W/V)將混合固定化細胞粒子接種至步驟(1)所得的高鹽稀態發酵醬油原液中，在溫度28-33℃連續發酵15-24小時；(4)發酵結束後，將該發酵成熟的高鹽稀態發酵醬油與固定化細胞粒子分離後得高鹽稀態發酵醬油成品。
2. 根據權利要求1所述的採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法，其特徵是， 所述的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種菌種的固定化細胞粒 子通過以下步驟製得取經活化的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種菌種的菌液 分別與海藻酸鈉膠液按l : 15 25的體積比混合製備成細胞懸浮液，然後將細胞懸浮液 滴注入質量百分比濃度為2%的氯化鈣溶液中，即分別得到球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特 假絲酵母及醬油四聯球菌四種菌種的固定化細胞粒子。
3. 根據權利要求1或2所述的採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法，其特徵 是，所述的海藻酸鈉膠液的質量百分比濃度為1. 5 3. 5%。
4. 根據權利要求3所述的採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法，其特徵是， 所述的質量百分比濃度為2%的氯化鈣溶液的添加量與海藻酸鈉菌液的體積比為1. 5 3 ! 1。
5. 根據權利要求4所述的採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法，其特徵是， 所述的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種菌種的固定化細胞粒 子均要求固定化細胞粒子中的平均含菌量為106 108個/顆粒。
6. 根據權利要求5所述的採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法，其特徵是， 在所述的步驟(2)的高鹽稀態發酵醬油原液中添加質量百分比濃度為5 10%的液化糖 漿，其添加量為高鹽稀態發酵醬油原液總重量的5 20%。
7. 根據權利要求6所述的採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法，其特徵是， 在步驟(2)中所述的連續發酵過程中每隔30 60min進行一次攪拌。
8. 根據權利要求7所述的採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法，其特徵是， 所述的攪拌的時間為2 5min，攪拌的速度在80 150r/min範圍內。
全文摘要
本發明公開了一種採用固定化細胞發酵製備高鹽稀態醬油的方法，其包括以下步驟(1)用傳統的高鹽稀態發酵法製備醬油，製得經60～90天發酵的醬油原液備用；(2)取經活化的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種菌種分別製成固定化細胞粒子；(3)取步驟(2)中製得的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯球菌四種菌種的固定化細胞粒子進行復配得到混合固定化細胞粒子；然後將混合固定化細胞粒子接種至步驟(1)所得的高鹽稀態發酵醬油原液中進行發酵；(4)發酵結束後，將該發酵成熟的高鹽稀態發酵醬油與固定化細胞粒子分離後得高鹽稀態發酵醬油成品。該方法不僅能提升高鹽稀態醬油風味，而且縮短了醬油發酵的周期，克服了高鹽稀態發酵法發酵周期長、設備利用率低、生產成本偏高的缺點。
文檔編號A23L1/238GK101731568SQ20101001930
公開日2010年6月16日 申請日期2010年1月8日 優先權日2010年1月8日
發明者劉佔, 吳廣泉, 張慶宇, 曾亞麗, 楊明泉, 胡鋒, 賈愛娟, 陳穗, 高聽明 申請人:廣東美味鮮調味食品有限公司