一種檢測克侖特羅的酶聯免疫試劑盒的製作方法
2023-06-11 04:52:16
專利名稱：一種檢測克侖特羅的酶聯免疫試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及酶聯免疫和獸藥殘留檢測分析技術領域中的一種檢測克侖特羅的酶聯免疫試劑盒。
背景技術：
克侖特羅又稱咳喘素，是一種β-興奮劑。克倫特羅進入體內後能夠改變養分的代謝途徑，促進動物肌肉，特別是骨骼肌中蛋白質的合成，抑制脂肪的合成和積累，從而改善胴體品質，使生長速度加快，瘦肉相對增加，所以，稱它為「瘦肉精」。在可食用動物的飼養中國內外均有非法使用該藥物提高經濟效益的現象，然而長期使用會使該藥物蓄積在可食用動物的組織中，人食用該組織後，會產生骨骼肌震顫、心跳過速、頭痛等一系列不良反應，嚴重的甚至危及生命。因此歐美各國均禁止在畜牧業生產上使用克侖特羅，我國也嚴禁將克侖特羅用於所有食用動物中並將其列為獸藥殘留監控的重點。我國《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定克侖特羅為不得檢出藥物。
現已報導的克侖特羅殘留量分析方法主要有氣相色譜-質譜聯用法、高效液相-串聯質譜法以及試紙條檢測法，其中，氣相色譜-質譜聯用法已經列為行業或國家標準。氣相色譜-質譜聯用法、高效液相-串聯質譜法雖然可以進行定量分析，但需要經過繁瑣的樣品前處理過程，儀器設備昂貴，很難用於大量樣品的檢測；而試紙條檢測法的靈敏度達不到檢測要求。
發明創造內容本發明的目的是提供一種檢測克侖特羅的酶聯免疫試劑盒。
本發明所提供的檢測克侖特羅的酶聯免疫試劑盒，包括包被的二抗、克侖特羅特異性抗體和酶標克侖特羅。
為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括A，B，C，D，E，F試劑液、G試劑液、H試劑液、I試劑液、J試劑液、K試劑液、L試劑液。
所述A，B，C，D，E，F試劑液為克侖特羅系列濃度標準溶液。
所述G試劑液為酶標克侖特羅濃縮液。
所述H試劑液為克侖特羅抗體濃縮液。
所述I試劑液為磷酸鹽緩衝液。
所述J試劑液為四甲基聯苯胺。
所述K試劑液為檸檬酸緩衝液。
所述L試劑液為終止液。
其中，所述克侖特羅特異性抗體可為克侖特羅單克隆抗體或克侖特羅多克隆抗體；所述克侖特羅單克隆抗體或多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、豬源、兔源和豚鼠源抗體，所述克侖特羅單克隆抗體優選為克侖特羅鼠單克隆抗體，所述克侖特羅多克隆抗體優選為克侖特羅兔多克隆抗體。
以上抗體均可以用克侖特羅與載體蛋白的偶聯物作為免疫原按常規方法製備。
所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、兔血清白蛋白(RSA)、甲狀腺球蛋白(TG)、或血蘭蛋白(KLH)等常用載體蛋白；所述克侖特羅與載體蛋白的偶聯物可通過將克侖特羅和載體蛋白用戊二醛法、高碘酸鈉法或重氮法進行偶聯得到。
所述標記酶可為辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酯酶，優選為辣根過氧化物酶。辣根過氧化物酶可通過戊二醛法、高碘酸鈉法或重氮法標記於克侖特羅上。所述二抗可為抗鼠或抗兔抗抗體，優選為羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。
可作為固定所述二抗的載體的物質很多，如聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯醯胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯葡聚糖、玻璃、矽橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以是試管、微量反應板凹孔、小珠、小圓片等。
本發明的檢測原理為將二抗吸附於固相載體上，加入樣品和酶標克侖特羅，再加入克侖特羅特異性抗體，待測樣品中殘留的克侖特羅和酶標克侖特羅競爭特異性抗體，顯色後終止，測定樣品吸光值，該值與樣品中克侖特羅殘留量呈負相關，與標準曲線比較即可得出克侖特羅的含量。同時根據酶標板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的克侖特羅標準溶液顏色的比較可判斷樣品的濃度範圍。
本發明的檢測克侖特羅的酶聯免疫試劑盒主要採用ELISA競爭方法定性或定量檢測動物組織(豬、雞、牛、羊的肌肉組織及肝臟、腎臟尿等)、尿樣等樣品中克侖特羅的殘留量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，尿樣離心後可直接檢測，檢測快速，時間約為1.5小時；標準曲線中有1μg/L這一濃度點，實現了定性與定量一體化；最低檢測限達0.1μg/L，該試劑盒與其它β興奮劑交叉率很低，僅與沙丁胺醇有3.6％的交叉反應，具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準確度等特點，可在動物性食品克侖特羅殘留檢測中發揮重要作用。
具體實施例方式
實施例1、克侖特羅抗原及抗體的製備(1)克侖特羅抗原的合成以人血清白蛋白為載體，克侖特羅為半抗原，用重氮化法、戊二醛法、多元酸酐法或EDC法將克侖特羅偶聯在人血清白蛋白上，得到克侖特羅抗原。
(2)克侖特羅兔多克隆抗體的製備採用日本大耳兔作為免疫動物，以步驟(1)中合成的抗原為免疫原，免疫劑量每次為2mg/mL免疫抗原，首次免疫用2mL完全福氏佐劑乳化，四周後加強免疫用2mL不完全福氏佐劑乳化。每次加強免疫間隔2周，共免疫5-10次，最後一次不加免疫佐劑直接肌肉注射，7天後採血檢測，測定血清抗體效價後，頸動脈放血，提取血清，經硫酸銨分級沉澱得到純化的多克隆抗體。
(3)克侖特羅單克隆抗體製備採用BALB/C小鼠作為免疫動物，以步驟(1)中合成的抗原為免疫原，劑量為50μg(0.1mL)加等體積完全福氏佐劑乳化，進行首次皮下多點注射免疫。一月後，取同樣量免疫抗原加不完全福氏佐劑，乳化，進行加強免疫，再過一月後免疫抗原不加佐劑腹腔注射進行加強免疫，之後5天採血，測定抗體效價。取脾細胞按4∶1比例與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合。採用有限稀釋或軟瓊脂平板法篩選雜交瘤細胞，得到完全同質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株。
細胞凍存和復甦取處於對數生長期的雜交瘤細胞用凍存液製成1×106-5×106個/mL的細胞懸液，分裝於凍存管，在液氮中長期保存。復甦時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液後，移入培養瓶內培養。定期檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性。
單克隆抗體的製備與純化採用體內誘生法，將BALB/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7-14天後腹腔注射雜交瘤細胞5×105-106個/只，7-10天後採集腹水。經辛酸-硫酸銨沉澱法進行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
(4)克侖特羅-辣根過氧化物酶結合物的製備用用重氮化法、戊二醛法、多元酸酐法或EDC法將克侖特羅標記於辣根過氧化物酶上，獲得克侖特羅-辣根過氧化物酶結合物，克侖特羅殘留檢測靈敏度(即50％抑制濃度)小於或等於1μg/kg。
(5)二抗的製備以羊作為免疫動物，以鼠或兔IgG為免疫原進行免疫，得到羊抗鼠或羊抗兔抗抗體。具體方法如下將經硫酸銨沉澱法純化的兔或鼠免疫球蛋白用等量福氏完全佐劑乳化後，肌肉、皮下、皮內多點免疫成年綿羊，免疫劑量為10mg蛋白/只，一月後，用半量的兔或鼠免疫球蛋白加入福氏不完全佐劑肌肉、皮下或皮內注射綿羊，之後，每兩周加強免疫一次。瓊擴效價達1∶32以上時，採血，分離血清，用硫酸銨沉澱法粗提後，用免疫親和柱層析法提取羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，得到純化的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。
實施例2、檢測克侖特羅的酶聯免疫試劑盒1、檢測克侖特羅的酶聯免疫試劑盒的結構該試劑盒主要由盒體，酶標板，A，B，C，D，E，F試劑液(克侖特羅系列濃度標準溶液)、G試劑液(克侖特羅-辣根過氧化物酶結合物濃縮液)、H試劑液(克侖特羅抗體濃縮液)、I試劑液(磷酸鹽緩衝液)；J試劑液(四甲基聯苯胺)；K試劑液(檸檬酸緩衝液)；L試劑液(終止液)；蓋板膜和託架組成。上述試劑液存放在試劑瓶中。託架內裝有上述A，B，C，D，E，F，G，H，J試劑瓶。託架，酶標板、蓋板膜、I試劑瓶、K試劑瓶和L試劑瓶均安裝在盒體內。酶標板由塑料支架和各自分開的帶孔的塑料條組成。
2、所用試劑的配製A，B，C，D，E，F試劑液為克侖特羅系列濃度標準溶液，其濃度分別為0、0.1、0.3、1、3、9μg/L。
G試劑液為克侖特羅-辣根過氧化物酶結合物濃縮液，含有5-500mg/L的克侖特羅-辣根過氧化物酶結合物。
H試劑液為克侖特羅抗體濃縮液，含有蛋白濃度為5-500mg/L的克侖特羅鼠單克隆抗體或兔多克隆抗體。
I試劑液為0.01M pH7.2磷酸鹽緩衝液。
J試劑液為0.1-10mg/mL四甲基聯苯胺溶液。
K試劑液為0.1M pH5.0檸檬酸緩衝液。
L試劑液為終止液，1-2mol/L硫酸或鹽酸。
3、酶標板的製備用包被緩衝液(0.05M pH9.6碳酸鹽緩衝液)將羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG稀釋成0.1-5μg/ml，每孔加入100μl，4℃過夜，傾去包被緩衝液，用0.05％吐溫的0.05M pH7.2磷酸鹽緩衝液洗滌3次，每次30秒，拍幹，然後在每孔中加5％脫脂牛奶0.05M磷酸鹽緩衝液250μl，室溫溫育1-2h，傾去孔內液體，乾燥後用鋁膜真空密封保存。
實施例3、樣品的前處理及檢測1、豬尿凍融後離心取上清，直接檢測。
2、豬肝
(1)提取稱取絞碎組織1.0g，置於離心管中，加50mmol/L鹽酸5mL，振蕩1.5h，於10-15℃以5000r/min或更高的速度離心15min，上清液轉至另一離心管中。加入1mol/L氫氧化鈉溶液300μL，混勻。振搖15min，加500mmol/L磷酸二氫鉀緩衝液(pH3.0)4mL，混勻，4℃放置1.5h或過夜。再以5000r/min或更高的速度10-15℃離心15min，取清亮的上清液備用。
(2)淨化C18固相萃取柱依次用無水甲醇3mL、50mmol/L磷酸二氫鉀緩衝液(pH3.0)2mL預洗。取全部備用液過柱，用50mmol/L磷酸二氫鉀緩衝液2mL淋洗，擠幹。用無水甲醇2mL洗脫，收集洗脫液，在50-60℃中用氮氣或空氣吹乾。殘渣用水1.0mL溶解(如有沉澱用5000r/min以上的速度離心)，上清作為供試試料。
3、檢測檢測前將試劑盒恢復室溫(18℃-30℃)，用試劑液H和I配成抗體溶液，分別在酶聯板微孔中加入20μl A，B，C，D，E，F試劑液和試樣溶液，然後每微孔中加入100μl抗體溶液，18℃-30℃孵育30min。用去離子水洗酶標板3次，拍幹。用試劑液G和I配成酶結合物溶液，然後每微孔中加入100μl酶結合物溶液，蓋上蓋板膜，18℃-30℃孵育30min。再用去離子水洗酶標板3次，拍幹，用J試劑液與K試劑液配製底物混合液(0.1％四甲基聯苯胺的檸檬酸緩衝液)，取100μl加入酶標板小孔後混勻，避光顯色約15min，最後加入M終止液(2mol/L硫酸)，用酶標儀測定450nm處A450值。按下 式計算百分吸光度值(B-為標準溶液或樣品的平均吸光度值；B0-為0濃度的標準溶液平均吸光度值。)以標準溶液中克侖特羅濃度的對數為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪製標準曲線，從標準曲線上計算出試樣溶液中克侖特羅濃度。
實施例4、試劑盒靈敏度、特異性、精密度和準確度該試劑盒的二抗為羊抗兔IgG抗體，克侖特羅特異性抗體為克侖特羅兔多克隆抗體，酶標克侖特羅為克侖特羅-辣根過氧化物酶結合物。
1、靈敏度按常規方法進行了試劑盒靈敏度試驗，結果表明標準曲線範圍為0.1μg/L-9μg/L，其中包含1μg/L這一臨界濃度點；試劑盒的最低檢測限為0.1μg/L，在豬尿和豬肝等樣品中檢測限≤1.0μg/L(kg)。
2、特異性測定選擇與克侖特羅結構和功能類似的八種藥物，分別測定交叉反應率。結果如表1所示，表明該試劑盒與其它β興奮劑交叉率很低，僅與沙丁胺醇有3.6％的交叉反應，樣品的測定結果能代表克侖特羅殘留量。
表1.交叉反應
3、準確度、精密度測定分別在空白豬尿、豬肝中添加克侖特羅標準液至終濃度為1.0μg/L和2.0μg/L。各濃度分別製備樣品5份，然後分別測定其含量，重複3次。結果表明在豬肝中，1μg/kg添加濃度的回收率為40％～110％；在豬尿中，1μg/L添加濃度的回收率為60％～120％；在空白添加添加豬肝和豬尿樣品中，批內變異係數CV≤20％，批間變異係數CV≤25％。
權利要求
1.一種檢測克侖特羅的酶聯免疫試劑盒，包括包被的二抗、克侖特羅特異性抗體和酶標克侖特羅。
2.根據權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述試劑盒還包括A，B，C，D，E，F試劑液、G試劑液、H試劑液、I試劑液、J試劑液、K試劑液和L試劑液。
3.根據權利要求1或2所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述克侖特羅特異性抗體為克侖特羅單克隆抗體或克侖特羅多克隆抗體，它們是用克侖特羅與載體蛋白的偶聯物作為免疫原製備得到的。
4.根據權利要求3所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述克侖特羅單克隆抗體或多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、豬源、兔源或豚鼠源抗體。
5.根據權利要求4所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述克侖特羅單克隆抗體為克侖特羅鼠單克隆抗體。
6.根據權利要求4所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述克侖特羅多克隆抗體為克侖特羅兔多克隆抗體。
7.根據權利要求3所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白或血蘭蛋白。
8.根據權利要求1或2所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述標記酶為辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酯酶。
9.根據權利要求1或2所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述二抗為抗鼠或抗兔抗抗體。
10.根據權利要求9所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述二抗為羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。
全文摘要
本發明公開了一種檢測克侖特羅的酶聯免疫試劑盒。本發明所提供的檢測克侖特羅的酶聯免疫試劑盒，包括包被的二抗、克侖特羅特異性抗體和酶標克侖特羅。本發明的檢測克侖特羅的酶聯免疫試劑盒對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，尿樣離心後可直接檢測，檢測快速，時間約為1.5小時；標準曲線中有1μg/L這一濃度點，實現了定性與定量一體化；最低檢測限達0.1μg/L，該試劑盒與其它β興奮劑交叉率很低，僅與沙丁胺醇有3.6％的交叉反應，具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準確度等特點，可在動物性食品克侖特羅殘留檢測中發揮重要作用。
文檔編號G01N33/544GK1707266SQ20041004656
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月11日 優先權日2004年6月11日
發明者劉智宏, 郭文林, 葉妮, 黃齊頤, 郭筱華 申請人:中國獸醫藥品監察所