裂殖壺菌WZYU011及其生產凝乳酶的方法與流程

2023-06-10 22:29:26

(一)技術領域

本發明涉及一種凝乳酶的製備，特別涉及一種利用裂殖壺菌生產凝乳酶的方法。

(二)

背景技術：

裂殖壺菌(aurantiochytriumsp.)是一種海洋類真菌的異養型微生物，其細胞中富含dha等重要多不飽和脂肪酸，已成為世界上最常用的dha高產菌株。裂殖壺菌分布於海洋生境，能夠利用自身的多酶體系高效分解環境基質，滿足自身快速生長的需求，其數量級甚至超過細菌，而且作為分解者參與海洋環境物質循環，具有重要的生態學意義。

凝乳酶是奶酪生產中使牛奶凝固的關鍵酶，屬於酸性蛋白酶，又稱天冬氨酸蛋白酶，其產值佔整個酶製劑總產值的15.5％，市場需求量巨大。凝乳酶的傳統來源是哺乳期小牛的皺胃，因其具有較高的凝乳和蛋白水解能力而成為奶酪製作的首選酶。然而動物來源的酶成本昂貴，且提取程序和工藝較為複雜，已不能滿足現代工業對於凝乳酶的要求。所以，研究者不斷尋求新的凝乳酶資源。微生物具有生長速度快、生產成本低、佔地面積小和易於控制生產條件等優點，而且微生物凝乳酶多屬胞外酶，提取方便，使其具有較好的發展前景。目前微生物凝乳酶主要由米黑毛黴、微小毛黴和粟疫黴等黴菌通過固態發酵生產，黴菌容易產生菌絲體，影響產酶；另外與固態發酵相比，液態發酵技術具有發酵時間短、過程易於控制和產量高等優勢。而關於裂殖壺菌來源的凝乳酶及其液態發酵生產的研究並未見報導。裂殖壺菌已通過fda安全認證，中國衛生部也將其加入安全的食品添加劑名錄，故廣泛應用於食品和飼料工業。該菌能夠利用廉價基質快速生長，很大程度上降低了其發酵產品的成本，有利於工業化生產。

(三)

技術實現要素：

本發明目的是提供一種新菌株--裂殖壺菌(aurantiochytriumsp.)wzyu011及利用裂殖壺菌wzyu011高效生產凝乳酶的方法。本發明首次使用已通過食品安全認證的海洋微生物裂殖壺菌，採用廉價原料高效生產凝乳酶，有效降低了凝乳酶的生產成本，且整個工藝流程簡單，設備要求低，可控性強，適用於工業化生產。

本發明採用的技術方案是：

本發明提供一株新菌株--裂殖壺菌(aurantiochytriumsp.)wzyu011，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號：cctccno:m2016619，保藏日期為：2016年11月7日，保藏地址為中國武漢，武漢大學，郵編430072。

本發明還提供一種利用裂殖壺菌wzyu011生產凝乳酶的方法，所述方法為：將裂殖壺菌wzyu011接種至發酵培養基中，在25-35℃下，50-600rpm振蕩培養，得到發酵液，將發酵液離心，棄細胞沉澱，得到含凝乳酶的粗酶液，將粗酶液分離純化，獲得凝乳酶；所述發酵培養基組成為：葡萄糖40-120g/l，酵母粉10-20g/l，蛋白腖5-20g/l，海鹽20g/l，溶劑為水，ph值自然。

進一步，所述裂殖壺菌wzyu011接種前先進行斜面活化和種子擴大培養：(1)斜面培養：將裂殖壺菌wzyu011接種於斜面培養基上，25-35℃下培養1-3天；所述斜面培養基組成為：葡萄糖20g/l，酵母粉10g/l，蛋白陳5g/l，海鹽20g/l，瓊脂20g/l，溶劑為水，ph值自然；(2)種子培養：將斜面培養基上的菌體接入含100ml種子培養基的500ml三角瓶中，在25-35℃下，50-300rpm震蕩培養1-3天，得到種子液；所述種子培養基組為：葡萄糖60g/l，酵母粉10g/l，蛋白陳5g/l，海鹽20g/l，溶劑為水，ph值自然。

進一步，所述裂殖壺菌wzyu011發酵培養方法為：將種子液接入含發酵培養基的發酵罐中，在25-35℃下，轉速50-600rpm，通氣量40-100l/min，溶氧量20-60％的條件下，培養時間1-6天，獲得發酵液。

進一步，所述種子液以體積濃度的1％-10％的接種量接種至發酵培養基。

進一步，所述發酵培養時間為1-6天。

進一步，所述發酵液在5000rpm，4℃下離心5min，獲得粗酶液。

進一步，所述發酵培養基組成為：葡萄糖60g/l，酵母粉20g/l，蛋白腖10g/l，海鹽20g/l，溶劑為水，ph值自然。

與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：

裂殖壺菌較其它凝乳酶生產菌株有很多優勢：(1)生長速率快，在1-3天的時間內即可達到5-20g/l生物量，並生產大量凝乳酶，酶活力可達50-300u/ml；(2)能夠利用葡萄糖、酵母粉和蛋白腖等傳統廉價的原料，發酵培養基中的海鹽組分能夠替代其它菌種發酵生產凝乳酶所必須的無機鹽，大大降低生產成本；(3)生產凝乳酶的方式為胞外分泌，大大簡化了凝乳酶的提取和分離工藝，適合工業化生產；(4)安全性高，可以廣泛應用於食品領域。在廉價培養基中，在1-5天的時間內，裂殖壺菌的凝乳酶產量可達50-300u/ml。(5)用該菌株發酵產酶過程比傳統的黴菌相比，縮短生產周期，降低發酵成本，易於控制，使凝乳酶大規模生產和應用成為可能；該凝乳酶為胞外酶，易於分離、純化和應用，且活力較高，適合工業化生產和應用；裂殖壺菌已通過各級安全認證，其來源的凝乳酶可用於食品、醫藥和飼料等各種領域。

(四)附圖說明

圖1是實施例1裂殖壺菌wzyu011在牛奶平板上產生的透明圈。

圖2是實施例2裂殖壺菌wzyu011菌種平板菌落形態。

圖3是實施例2裂殖壺菌wzyu011菌種顯微細胞形態。

圖4是實施例6裂殖壺菌wzyu011凝乳酶沉降奶粉溶液的效果；a200μl蒸餾水與5ml100g/l脫脂奶粉水溶液反應(對照)；b為500μl粗酶液與5ml100g/l脫脂奶粉水溶液反應；c為200μl粗酶液與5ml100g/l脫脂奶粉水溶液反應。

(五)具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此：

實施例1產凝乳酶裂殖壺菌wzyu011的篩選

(1)菌株wzyu011篩選

在浙江省溫州市樂清灣海邊採集腐葉樣品，洗淨放於表面懸浮0.1g松花粉的yp培養液(1g/l酵母粉，1g/l蛋白腖，50mg/l氨苄青黴素，50mg/l鏈黴素，水配製，ph6.0)中，30℃黑暗培養1周，取50μl培養物塗布於yp平板(1g/l酵母粉，1g/l蛋白腖，50mg/l氨苄青黴素，50mg/l鏈黴素，瓊脂20g/l，水配製，ph值6.0)上，28℃培養3天，直到長出單菌落，重複劃線gyp平板純化培養三次，得到純的菌株。將純的菌落點種於牛奶-gyp平板上，30℃倒置靜止培養3天，觀察透明圈(圖1)，記為菌株wzyu011。

gyp平板培養基組分為(g/l):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白陳5，海鹽20，瓊脂20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min，倒制平板。

牛奶-gyp平板組分為(g/l)：a：4％(w/v)的牛奶；b：4％(w/v)的瓊脂；c：gyp固體培養基(g/l):葡萄糖60，酵母粉10，蛋白陳5，海鹽20，瓊脂20，溶劑為水，ph值自然。將滅菌的a，b兩種培養基組分混合，倒入平板，待培養基凝固後倒入gyp固體培養基，製成牛奶-gyp雙層平板。

(2)菌株wzyu011鑑定

生理生化特徵：

將菌株wzyu011接種在gyp平板上，28℃培養2天，菌落呈黃白色，圓形，表面溼潤光滑，微微隆起(圖2)；在顯微鏡下細胞呈圓形或橢圓形，直徑5-20μm，細胞表面比較明亮，有鱗片狀結構，邊緣清晰，細胞分裂增殖，有偶數個細胞聚集在一起的現象(圖3)。

菌株wzyu011的18srdna序列見seqidno.1所示。與aurantiochytriumsp.菌株krs101和st-2012等菌株的18srdna序列相似度可達99％，故將將菌株wzyu011鑑定為裂殖壺菌(aurantiochytriumsp.)，命名為裂殖壺菌(aurantiochytriumsp.)wzyu011，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號：cctccm2016619，保藏日期為：2016年11月7日，保藏地址為中國武漢，武漢大學，郵編430072。

實施例2裂殖壺菌wzyu011液體發酵生產凝乳酶

將-80℃保存的裂殖壺菌wzyu011菌株轉接到斜面培養基上，30℃靜止培養2天；將菌體接入含100ml種子培養基的500ml三角瓶中，30℃，200rpm震蕩培養1天，得到種子液；將種子液按體積濃度4％的接種量轉到含3l發酵培養基的發酵罐中，30℃，轉速300rpm，通氣量80l/min，溶氧量60％條件下培養3天，得到發酵液，生物量可達10g/l；將發酵液5000rpm，4℃下離心5min，棄細胞沉澱得到粗酶液，經測定凝乳酶活力是100u/ml。

凝乳酶活力測定方法是：取0.4ml粗酶液與1ml含40mg/l牛血紅蛋白溶液混合(牛血紅蛋白購自美國sigma公司，溶於20mmph為3.4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液)，溫度40℃下保溫1h後迅速加入0.4ml15％(w/v)tca(三氯乙酸)水溶液終止反應。tca加入對照管中的時間要在加入底物前面。將試管於冰浴中靜置20min，然後10000rpm離心20min，取上清，使用分光光度計，於280nm處下測定吸光度。酶活定義是在1h內，測得溶液吸光度在280nm下每增加0.01作為一個酶活單位u。

斜面培養基組分為(g/l):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白陳5，海鹽20，瓊脂20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min；種子培養基為(g/l):葡萄糖60，酵母粉10，蛋白陳5，海鹽20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min；發酵培養基為(g/l):葡萄糖40，酵母粉10，蛋白腖5，海鹽20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min。

實施例3裂殖壺菌wzyu011液體發酵生產凝乳酶

將-80℃保存的裂殖壺菌wzyu011菌株轉接到斜面培養基上，25℃靜止培養3天；將菌體接入含100ml種子培養基的500ml三角瓶中，25℃，300rpm震蕩培養3天，得到種子液；將種子液按體積濃度10％的接種量轉到含3l發酵培養基的發酵罐中，25℃，轉速600rpm，通氣量40l/min，溶氧量40％條件下培養6天，得到發酵液，生物量可達19.5g/l；將發酵液5000rpm，4℃下離心5min，棄細胞沉澱得到粗酶液，經實施例2方法測定凝乳酶活力是150u/ml。

斜面培養基、種子培養基組成同實施例2，發酵培養基為(g/l):葡萄糖60，酵母粉15，蛋白腖10，海鹽20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min。

實施例4裂殖壺菌wzyu011液體發酵生產凝乳酶

將-80℃保存的裂殖壺菌wzyu011菌株轉接到斜面培養基上，35℃靜止培養1天；將菌體接入含種子培養基的500ml三角瓶中，35℃，50rpm震蕩培養1天，得到種子液；將種子液按體積濃度1％的接種量轉到含3l發酵培養基的發酵罐中，35℃，轉速50rpm，通氣量100l/min，溶氧量20％條件下培養1天，得到發酵液，生物量可達5.1g/l；將發酵液5000rpm，4℃下離心5min，棄細胞沉澱得到粗酶液，經實施例2方法測定凝乳酶活力是50u/ml。

斜面培養基和種子培養基組成同實施例2，發酵培養基為(g/l):葡萄糖120，酵母粉20，蛋白腖20，海鹽20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min。

實施例5裂殖壺菌wzyu011液體發酵生產凝乳酶

將-80℃保存的裂殖壺菌wzyu011菌株轉接到斜面培養基上，28℃靜止培養2天；將菌體接入含100ml種子培養基的500ml三角瓶中，28℃，200rpm震蕩培養2天，得到種子液；將種子液按體積濃度10％的接種量轉到含3l發酵培養基的發酵罐中，28℃，轉速500rpm，通氣量70l/min，溶氧量50％條件下培養5天，得到發酵液，生物量可達20.3g/l；將發酵液5000rpm，4℃下離心5min，棄細胞沉澱得到粗酶液，經實施例2方法測定凝乳酶活力是300u/ml。

斜面培養基和種子培養基組成同實施例2，發酵培養基為(g/l):葡萄糖50，酵母粉15，蛋白腖10，海鹽20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min。

實施例6裂殖壺菌wzyu011來源凝乳酶在牛奶凝聚中的應用

將實施例5製備的粗酶液200μl和500μl分別與5ml100g/l脫脂奶粉水溶液(脫脂奶粉購自中國完達山公司，溶於蒸餾水中)混合，充分振蕩混勻，在溫度35℃下保溫，1分鐘後奶粉溶液便開始凝聚，觀察拍照(圖4)。

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浙江工業大學

裂殖壺菌wzyu011及其生產凝乳酶的方法

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