高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法
2023-06-10 18:32:01
專利名稱：高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法
技術領域：
本發明涉及一種高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法，尤其涉及均勻、大小厚度可控基質薄膜製備方法，以及樣品定量分析方法。本發明的原理基於將能夠吸收雷射能量的有機分子在恆定高壓下壓縮成薄膜(Compressed Matrix Thin Film,簡稱為CMTF)，所製得的基質薄膜既能實現普通方法所得基質吸收雷射能量的功能，又能作為疏水薄膜吸附樣品分子，而使無機鹽原位水洗除去，並且消除樣品在靶上的擴散，提高方法的靈敏度。該方法還能處理固體樣品，提高了應用範圍。
背景技術：
基質輔助雷射解析離解質譜是廣泛應用的一種分析技術，該技術利用可吸收雷射能量的有機小分子基質與樣品混合，並將能量傳遞給樣品分子，使之汽化並離子化，再被質量分析器檢測。在該技術中，有機小分子基質與樣品分子混合模式是關鍵，因為它直接影響分析結果的準確度、解析度以及實驗結果的重現性和定量分析的能力。現有的技術中，常常採用有機溶劑先溶解基質，再讓基質溶液與樣品溶液混合，待溶劑揮發後，樣品與基質分子形成混晶。現有技術的主要缺點在於很難形成大小均勻，形貌可控的晶體，從而使得雷射在不同掃描時間所獲得的圖譜不具有重現性，信號強度與樣品量之間沒有定量關係。並且，由於晶體大小和形貌的差異，造成雷射轟擊樣品分子之後所得離子的初速度和方向不同，影響實驗結果的解析度和質量準確度。
發明內容
本發明目的旨在提供一種高壓成型基質薄膜(CMTF)輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法，具體為將有機小分子基質在高壓下壓製成均勻、大小厚度可控的薄膜，避免溶劑重結晶過程的不確定性，獲得的基質薄膜既能吸收紫外光，又能作為反相疏水層吸附樣品分子，而使無機鹽被原位水洗除去。同時，本方法提供的疏水表面還能避免樣品溶液在樣品靶表面的擴散，提高方法的靈敏度。本方法無需有機溶劑重結晶過程，可以處理固體樣品，擴大應用範圍。本方法所獲得的譜圖信號穩定，信號強度與樣品量之間有良好的線性關係，重現性好，靈敏度高。實現本發明的技術方案:一種高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法，該方法將有機小分子基質在高壓下壓製成薄膜，再將薄膜粘在質譜儀的樣品靶上，樣品點在薄膜上並自然風乾，將樣品原位洗滌除去無機鹽，自然風乾後放入質譜儀進行分析。本發明的技術方案中，所述的有機小分子基質包括:α -氰基-4-羥基肉桂酸(，α -cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA), 2, 5 二輕基苯甲酸(2, 5-dihydroxybenzoicacid, DHB)。本發明的 技術方案中，所述的有機小分子基質在高壓下壓製成薄膜，是將有機小分子基質單獨壓製成薄膜，或者與固體樣品混合後壓製成薄膜。
本發明的技術方案中，基質單獨壓製成薄膜的方法步驟包括:1)、稱取基質α -氰基-4-羥基肉桂酸或2，5 二羥基苯甲酸，基質的種類和量根據不同的樣品而定；2)、將步驟1)得到的基質用瑪瑙研缽磨細，使其顆粒大小小於2 μ m ;3)、將步驟2)得到的基質粉末放入壓片機的模具，模具面積50X70mm，再放入壓片機，施加4800kg壓力，並在此壓力下保持I分鐘；4)、將步驟3)壓制的基質薄膜取出，保存在室溫即可。本發明的技術方案中，基質與固體樣品混合後壓製成薄膜的方法步驟包括:1)、稱取基質α -氰基-4-羥基肉桂酸或2，5 二羥基苯甲酸，基質的種類和量據不同的樣品而定；稱取固體樣品；2)、將步驟1)得到的基質和固體樣品用瑪瑙研缽磨細，使其顆粒大小小於2 μ m，以便使壓製得到的基質薄膜大小和厚度均勻；3)、將步驟2)得到的基質和固體樣品粉末，按基質與固體樣品摩爾比為300: I比例混合，放入壓片機的模具，模具面積50 X 70mm,再放入壓片機,施加4800kg壓力，並在此壓力下保持I分鐘；4)、將步驟3)壓制的薄膜取出，所得薄膜可直接進行雷射解析離解質譜分析。本發明的技術方案中，所述的樣品原位洗滌除去無機鹽的方法是，使用移液器將IOy I或更多濃度0.1wt % TFA(三氟乙酸)水溶液將樣品點完全覆蓋，保持2秒鐘，再用無塵紙吸取樣品上的水，樣品中所含的無機鹽被除去，重複洗2-3次。本發明的高 壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法，分析蛋白質樣品:取一定量蛋白的酶解液，將樣品調至酸性，pH 1-2，使用移液器將I μ I樣品點在樣品靶，等待其自然風乾後，使用移液器將 ο μ I或更多濃度0.lwt%三氟乙酸水溶液將樣品點完全覆蓋，保持2秒鐘，再用無塵紙吸取樣品上的水，樣品中所含的無機鹽被除去，重複洗2-3次，自然風乾後放入質譜儀進行分析；所述的蛋白質為α酪蛋白。雷射束以一定頻率轟擊樣品分子，由於按照此法製得的樣品和基質均勻分布，因此採得的信號穩定，信號絕對強度與樣品的量具有良好的線性關係，可以進行定量分析，本發明的高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法，分析固體樣品:將固體樣品與基質按照摩爾比為1: 300的比例混合併按照上述的方法製備成薄膜，所得薄膜可直接進行雷射解析離解質譜分析；所述的固體樣品為α酪蛋白酶解液的冷凍乾燥乾粉。本發明的效果和優點:1.本發明的高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法，所得基質薄膜表面均勻，大小厚度可控，操作簡單，無需有毒有害試劑，綠色環保。2.整個製備過程簡單，容易控制，耗能少，質量穩定，重現性好，並且易於表徵，成本低，適合於進行大規模實際生產，便於質量控制和產業化。由於基質輔助雷射解析離解質譜是廣泛應用的分析技術，因此本發明具有廣泛的應用前景。3.與現有基質製備方法相比，本發明無需有機試劑，不僅綠色環保，而且消除了重結晶過程的不確定性。本發明所製得基質薄膜均勻，所獲得信號強度穩定，絕對信號強度與樣品量之間的良好線性關係，可以進行樣品定量分析。
4.樣品原位除鹽洗脫容易，金屬離子加合物幹擾小，分析速度快。以下結合附圖和實施例進一步對本發明進行說明。
圖1-A為實施例1高壓成型製備的DHB薄膜圖1-B為實施例1高壓成型製備的CHCA薄膜圖1-C為DHB高壓成型薄膜的100倍顯微鏡1-D為CHCA高壓成型薄膜的100倍顯微鏡1-E為重結晶的DHB的100倍顯微鏡下1-F為重結晶的CHCA的100倍顯微鏡圖以上圖片顯示，高壓成型基質薄膜表面光滑均勻，而重結晶所獲得晶體大小形狀不一。下面圖2-圖5是實施例2所得產物進行樣品分析總離子流圖。圖2是為DHB重結晶法所得總離子流圖。圖3為DHB高壓成型基質薄膜所得總離子流4為CHCA重結晶法所得總離子流5為CHCA高壓成型基質薄膜所得總離子流2-圖5顯示高壓成型基質薄膜上所獲得信號強度穩定，相對標準偏差小。下面圖6-圖9是實施例3高壓成型基質薄膜原位除鹽效果6為α -酪蛋白酶解液在DHB基質的質譜中，箭頭所指為鈉和鉀加合物峰。圖7為α -酪蛋白酶解液在DHB基質上原位除鹽後所得質譜圖由圖可見，鈉峰和鉀峰明顯降低。圖8為α -酪蛋白酶解液在CHCA基質的質譜中箭頭所指為鈉和鉀加合物峰。圖9為α -酪蛋白酶解液在CHCA基質上原位除鹽後所得質譜圖由圖可見，鈉峰和鉀峰明顯降低。圖10是實施例4高壓成型基質薄膜分析固體樣品質譜中:α -酪蛋白酶解液冷凍乾粉樣品直接與CHCA基質混合後高壓成型，然後進行質譜分析，可見所獲得質譜圖與常規分析法所獲得質譜圖一致。下面圖11-圖13是實施例5高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜法的定量分析能力圖11是m/zl337多肽的工作曲線圖由圖可見，線性範圍為l.0yg-0.005 μ g，相關係數平方分別為0.7066。.
圖12是m/z 1759多肽的工作曲線圖由圖可見，，線性範圍為1.0 μ g-0.005 μ g，相關係數平方為0.8917。圖13是m/z2316多肽的工作曲線圖由圖可見，線 性範圍為L O μ g-0.005 μ g，相關係數平方分0.9629。
具體實施例方式實施例1高壓成型基質薄膜的製備，製備步驟依次如下:I)、用分析天平稱取一定量的基質，比如50mgCHCA(α -cyano-4-hydroxycinnamic acid)和 12mg DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid),基質的種類和量可據不同的樣品而定；2)、將步驟I)得到的基質用瑪瑙研缽磨細，使其顆粒大小小於2 μ m ;3)、將步驟2)得到的基質粉末放入壓片機的磨具，再放入壓片機，施加4800kg壓力，並在此壓力下保持I分鐘；4)、將步驟3)壓製得基質薄膜(CMTF)取出，保存在室溫。其中，步驟4)所得CHCA薄膜的圖片如圖1_A所示，所得DHB薄膜的圖片如圖1_B所示，圖中顯示所得基質薄膜表面光滑，基質均勻。步驟4)所得CHCA薄膜和DHB薄膜在100倍顯微鏡放大後分別如圖1-C和圖1-D所示，與結晶法所得CHCA薄膜(圖1-E)及DHB薄膜(圖1-F)相比，基質分布均勻，而結晶法所得晶體顆粒大小和形狀不均。實施例2實施例1製備的高壓成型基質薄膜用於樣品分析信號強度穩定性I)、將實施例1製備的高壓成型基質薄膜粘在樣品靶上；2)、將α-酪蛋白酶解液樣品調至pH 1_2，使用移液器將I μ I樣品點在薄膜上不同的樣品點位置，並讓其自然風乾；3)、取10 μ I濃度0.1wt % TFA水溶液使其覆蓋樣品點，保持2秒鐘，用無塵紙吸掉水珠，重複3次；4)、將樣品靶放入質譜儀；5)、使用一定頻率的雷射轟擊樣品，使待測樣品氣化並離子化，並檢測其信號強度；其中，步驟5)所獲得DHB高壓成型基質薄膜總離子流圖如圖3所示，CHCA高壓成型基質薄膜總離子流圖如圖5所示，與DHB重結晶法所得總離子流圖(圖2)及CHCA重結晶法所得總離子流圖(圖4)相比，高壓成型基質薄膜法所獲得信號強度穩定，相對標準偏差小。表I列出了用不同方法重複測量所獲得信號的相對標準偏差，可見高壓成型基質薄膜法明顯優於結晶法。結晶法由於晶體大小不均，晶體顆粒在靶上的分布不均，不均導致信號強度不均，甚至使雷射掃描時不能轟擊到樣品(如圖中箭頭所指位置)。
表1.不同方法所獲得的相對標準偏差 ^
權利要求
1.一種高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法，其特徵在於，該方法將有機小分子基質在高壓下壓製成薄膜，再將薄膜粘在質譜儀的樣品靶上，樣品點在薄膜上並自然風乾，將樣品原位洗滌除去無機鹽，自然風乾後放入質譜儀進行分析。
2.根據權利要求1所述的高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法，其特徵在於，所述的有機小分子基質包括:α -氰基-4-羥基肉桂酸或2，5 二羥基苯甲酸。
3.根據權利要求1所述的高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法，其特徵在於，所述的有機小分子基質在高壓下壓製成薄膜，是將有機小分子基質單獨壓製成薄膜，或者與固體樣品混合後壓製成薄膜。
4.根據權利要求3所述的高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法，其特徵在於，基質單獨壓製成薄膜的方法步驟包括: 1)、稱取基質α-氰基-4-羥基肉桂酸或2，5二羥基苯甲酸，基質的種類和量根據不同的樣品而定； 2)、將步驟I)得到的基質用瑪瑙研缽磨細，使其顆粒大小小於2μ m ; 3)、將步驟2)得到的基質粉末放入壓片機的模具，模具面積50X 70mm，再放入壓片機，施加4800kg壓力，並在此壓力下保持I分鐘； 4)、將步驟3)壓制的基質薄膜取出，保存在室溫即可。
5.根據權利要求3所述的高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法，其特徵在於，基質與固體樣品混合後壓製成薄膜的方法步驟包括: 1)、稱取基質α-氰基-4-羥基肉桂酸或2，5 二羥基苯甲酸，基質的種類和量據不同的樣品而定；稱取固體樣品； 2)、將步驟I)得到的基質和固體樣品用瑪瑙研缽磨細，使其顆粒大小小於2μ m ; 3)、將步驟2)得到的基質和固體樣品粉末，按基質與固體樣品摩爾比為300: I比例混合，放入壓片機的模具，模具面積50 X 70mm,再放入壓片機,施加4800kg壓力，並在此壓力下保持I分鐘； 4)、將步驟3)壓制的薄膜取出，所得薄膜可直接進行雷射解析離解質譜分析。
6.根據權利要求1所述的高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法，其特徵在於，所述的樣品原位洗滌除去無機鹽的方法是，使用移液器將10 μ I或更多1%三氟乙酸水溶液將樣品點完全覆蓋，保持2秒鐘，再用無塵紙吸取樣品上的水，樣品中所含的無機鹽被除去，重複洗2-3次。
7.權利要求1所述的高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法分析蛋白質樣品，其特徵在於:取一定量蛋白的酶解液，將樣品調至酸性，ΡΗ1-2，使用移液器將I μ I樣品點在樣品靶，等待其自然風乾後，使用移液器將10 μ I或更多濃度0.lwt%三氟乙酸水溶液將樣品點完全覆蓋，保持2秒鐘，再用無塵紙吸取樣品上的水，樣品中所含的無機鹽被除去，重複洗2-3次，自然風乾後放入質譜儀進行分析；所述的蛋白質為α酪蛋白。
8.權利要求1所述的高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法分析固體樣品，其特徵在於:將固體樣品與基質按照摩爾比為1: 300的比例混合併按照權利要求5所述的方法製備成薄膜，所得薄膜可直接進行雷射解析離解質譜分析；所述的固體樣品為α酪蛋白酶解液的冷凍乾燥乾粉。
全文摘要
一種高壓成型基質薄膜輔助-雷射解析離解質譜定量分析方法。該方法將有機小分子基質在高壓下壓製成薄膜，再將薄膜粘在質譜儀的樣品靶上，樣品點在薄膜上並自然風乾，將樣品原位洗滌除去無機鹽，自然風乾後放入質譜儀進行分析。本法避免了結晶法所得晶體大小和形狀的不均勻性。所得基質薄膜能起到疏水反相固定相的作用，吸附樣品分子，而無機鹽原位水洗除去，而且能避免樣品分子在樣品靶表面的擴散，從而提高了靈敏度。本法所得質譜信號穩定，重現性好，金屬離子加合物幹擾小，譜圖背景小，信號強度與樣品量呈現良好線性關係，能夠進行定量分析。本方法簡單，不需要複雜的儀器，無需複雜的樣品前處理，無需有機溶劑，綠色環保。
文檔編號G01N27/64GK103245717SQ201210029189
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者鍾鴻英, 黃璐璐, 肖瀟, 鄭石 申請人:華中師範大學