一種轉基因植物分子水平非預期效應評價的方法
2023-06-10 23:45:46
專利名稱：一種轉基因植物分子水平非預期效應評價的方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，尤其是涉及一種轉基因植物安全性評價方法，具體是轉基因植物分子水平的非預期效應評價的方法。
背景技術：
按照聯合國糧農組織(FAO)的定義，生物安全是指「避免由於對具有感染能力的有機體或者遺傳修飾有機體的研究和商品化生產而對人類的健康和安全以及環境的保護帶來的風險」，可歸納為生態風險、食品安全和非預期效應三個方面。在轉基因植物安全性評價的諸多項目中，非預期效應的評價是難度最高的項目，其原因在於轉基因植物的非預期效應具有顯著的難以預測性(European foodsafety authority, 2005 ；Konig, 2004) 根據聯合國糧農組織和世界衛生組織(FA0/WH0)的定義，轉基因生物非預期效應是指由外源基因整合於基因組導致的非目標性狀的增加或者導致受體植物存在的性狀的丟失(WHO， 2000)。現在實驗室中及世界各國環境和食品監管部門在研究和檢測轉基因植物非預期效應時所使用的方法和技術主要包括1、基於靶標的表型篩選。首先考察轉基因植株整體表型與非轉基因植株是否存在顯著差異，即農藝性狀有沒有退化；然後鑑定目標性狀是否被無誤的引入受體植物。2、主要成分比較分析法。即基於實質等同性原則對轉基因植物及其非轉基因受體在組分上進行比較分析，這些主要成分包括脂肪、蛋白質、碳水化合物、礦物質、灰分、胺基酸、脂肪酸和維生素等。3、組學和譜學的方法，包括轉錄組學(基因晶片)、蛋白質組學(雙向電泳)、代謝組學(代謝物譜系分析)。其實質也是基於實質等同性原則進行的比較法。以蛋白質組學為例，即用雙向電泳技術考察轉基因植物與其非轉基因受體之間在表達譜上是否存在差異點。(參考文獻F. Cellini, A. Chesson, I.Colquhoun, etal, .2004. Unintended effects and their detection in genetically modifiedcrops[J]. Food and Chemical Toxicology. 42 :1089-1125. Deng PJ, Zhou XY, Yang DY, et al, . 2008.The definition, source, manifestationand assessment of unintended effects in genetically modified plants[J]. Journal ofthe Science of Food and Agriculture. 88 :2401-2413.)。上述所有方法的思路都是從結果入手，先分析一個結果性事件對另一個結果性事件是否存在影響，然後從出發的結果上找原因，並試圖研究這個原因是否同時是終點的結果的原因。在這一過程中間，就存在由各通路鏈條的「黑盒子」而導致的結論不確定性。
發明內容
本發明的目的是提供一種評價轉基因植物分子水平非預期效應的方法，以克服現有技術存在的上述不足。為實現上述目的，本發明的技術方案是利用酵母雙雜交的方法，首先對外源目的蛋白克隆與鑑定，構建為誘餌融合蛋白，再將轉基因植物受體親本的cDNA文庫構建獵物融合蛋白，最後用誘餌融合蛋白對獵物融合蛋白文庫進行篩選，通過對轉基因植物受體親本 cDNA文庫的篩選，獲得與外源目的蛋白相互作用的陽性作用子(見圖1)。本發明直接考察外源蛋白與受體植物蛋白組的相互作用，這樣從確定的原因著手，通過設計的實驗得到明確的結果，從而在分子水平得到評價非預期效應的確定性結論，實現對轉基因植物分子水平的非預期效應評價。在此基礎上，通過遺傳學和分子生物學等技術的研究可以得到轉基因植物表型的非預期改變，從而進行轉基因植物表型水平非預期效應的確定性結論。本發明具體包括以下步驟1、外源目的蛋白的克隆與鑑定外源目的蛋白是指轉基因植物中插入的目標性狀。從轉基因植物或外源目的蛋白的原始來源處通過PCR或基因分離的方法獲得目標蛋白的基因序列，轉化大腸桿菌克隆擴增，再通過PCR、瓊脂糖電泳、序列測定、序列比對分析鑑定目的片段。2、外源目的蛋白構建誘餌融合蛋白將上述PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，雙酶切同時消化目的基因片段和質粒載體，並回收純化線性酶切產物。將載體和目的基因按照1 3的摩爾比進行連接反應，16°C過夜。連接產物轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，於抗性培養基上鑑定陽性克隆。液體培養後，提取重組質粒，經過PCR、雙酶切和測序鑑定後，確定為外源目的基因構建的誘餌融合蛋白質粒，最後轉化酵母鑑定外源蛋白重組子的自激活活性和毒性，如無自激活活性和毒性，即可用於後續分子操作。3、轉基因植物受體親本的cDNA文庫構建構建cDNA文庫的材料是轉基因植物受體親本的全株幼苗。具體操作為常規文庫構建的方法，提取純化總RNA，分離純化mRNA，反轉錄合成單鏈cDNA，利用Gubler-Hoffman 法合成ds cDNA文庫，經末端平滑化，連接Adaptor、限制性酶切，去除短片段後連接到質粒載體上，構建質粒載體連接文庫。取0. 5 μ L連接液轉化大腸桿菌，檢測文庫庫容約> 1. 8 X IO6Cfu, 100萬倍克隆擴增放大cDNA文庫後提取濃度為1. Omg/mL的質粒2mL待用，即為獵物融合蛋白表達文庫。4、用共轉化的方法通過酵母雙雜交進行文庫篩選共轉系統轉化使用的酵母菌株為Y2H Gold yeast strain (購自Clontech公司)， 將新鮮復甦的酵母單菌落在液體培養基中培養至對數生長期，通過去離子水、lXTE/LiAc 重懸、洗滌後獲得感受態細胞；然後利用PEG/LiAc介導的方法，將誘餌融合蛋白和獵物融合蛋白雙質粒系統通過熱擊共轉入新鮮製備的酵母感受態細胞中，最後將轉化後的酵母塗
布於培養基上培養。實驗所用酵母雙雜系統共有四個報告基因，即-His，-Ade，AURl-C和MEL1，因此篩選結果最終確定的陽性克隆應該可以同時將這四個報告基因的表達激活。文庫篩選過程首先是將共轉化菌液在加有α半乳糖苷酶顯色底物X- α -Gal和抗真菌素金擔子素Aba的雙缺培養基上初篩，這一步篩選所得到的克隆即可以生長且變藍的菌落，理論上認為是由於蛋白質之間的相互作用而激活了兩個報告基因AURl-C和MELl的表達。經過第一輪篩選得到的陽性克隆繼續劃線培養在含Χ-α -Gal和Aba的四缺培養基上。有些第一輪篩出的陽性克隆在四缺培養基上就不能生長了，這些視為假陽性而予以捨棄。在四缺培養基上仍能很好的生長的菌落被認為又激活了 -His，-Ade基因的表達，這些菌落被認為是初步篩選得到的陽性結果。提取所有陽性克隆酵母菌株的質粒，電擊法轉化大腸桿菌DH5CI感受態細胞，轉化後菌液塗布LB+Amp的平板，以篩選文庫質粒。由於表達誘餌蛋白的質粒是Kana抗性，而表達獵物蛋白的質粒是Amp抗性，就可以篩除誘餌質粒，而只保留獵物質粒。每個板上至少隨機挑取10個單克隆，測序並對序列進行分析。將上述序列分析得到的陽性蛋白分別與pGBKT7_Bt共轉化Y2H Gold strain酵母菌株，重複前面的篩選過程，再次獲得的陽性克隆，即可確認該蛋白與誘餌蛋白的相互作用。有益效果本發明所述方法在轉基因植物分子水平非預期效應研究領域具有創新性和很強的實踐性，對目前的實質等同性原則基礎下的各種方法具有很好的改進和補充作用。本發明具有以下優點(1)確定性這是本方法最大的創新和優點所在。直接從效應產生的根本原因入手，獲得明確的結論。傳統研究轉基因生物非預期效應的各種方法(如主要成分比較法和組學的方法等)最大的問題就是原因和結果之間各通路鏈條的「黑盒子」而導致的結論不確定性。在這點上本發明做了根本性的改進。( 高效性通過酵母雙雜交進行的文庫篩選和驗證即可以獲得一些陽性互作蛋白，結果明確且易於分析。(3)實用性酵母雙雜交的方法對比於比較分析法和組學的方法技術更為成熟和簡單。更易於操作。(4)廣泛適應性本發明所述方法可以用於任何轉基因植物外源目標蛋白分子水平的非預期效應研
圖1是酵母雙雜交的方法研究轉基因植物分子水平非預期效應流程圖；圖2是文庫篩選陽性結果的圖樣，為在四缺培養基(含有X-α-Gal和Aba)上篩選的陽性結果，在四缺培養基上仍可生長的菌落被認為是存在陽性相互作用的結果，每個菌斑對應一個可能的陽性作用結果；圖3是陽性克隆PCR電泳結果圖，所示為從四缺培養基上獲得的陽性菌落提取酵母質粒，轉化大腸桿菌，在含Amp的LB培養基上篩出的陽性單菌落提取質粒後PCR的結果， 其中I-M泳道各為一陽性結果，Marker為TrandK分子量標記。以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
具體實施例方式實施例1對轉Bt基因水稻分子水平非預期效應研究的實例。1、外源蛋白Bt基因的克隆鑑定分析目的基因片段序列和連接載體多克隆位點信息，設計下列引物5，端引物CCCATATGATGGATAACAATCCGAACATC，下劃線部分為所引入的Nde I酶切位點；3』端引物GCGTCGACATCATATTCTGCCTCAAAGG,下劃線部分為所引入的Mil酶切位佔.對蘇雲金桿菌HD-I菌株(購自中國科學院微生物所菌種保藏中心)PCR獲得 Bt 基因片段。50 μ L PCR 體系5，端引物 1 μ L，3，端引物 1 μ L，10XK0D buffer 5 μ L, MgS04buffer 2 μ L, dNTP 5 μ L, KOD plus 酶 1 μ L，ddH20 35 μ L ；PCR 條件94 "C 5min, 94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 2min，39 個循環，72°C IOmin0 將 PCR 產物用瓊脂糖凝膠電泳鑑定片段大小並測序，基因序列在NCBI上Blast比對鑑定序列信息。2、誘餌質粒載體的構建將上述PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳並回收DNA片段，用del和MlI雙酶切同時分別消化目的基因片段Bt和質粒載體pGBKT7，並回收純化線性酶切產物。將載體和目的基因按照1 3的摩爾比進行連接反應，16°C過夜。連接產物轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，於抗性培養基上鑑定陽性克隆。搖菌提取重組質粒，經過PCR、雙酶切和測序鑑定後， 轉化酵母感受態細胞鑑定其沒有自激活活性和毒性，可用於後續分子操作。3、水稻cDNA文庫的構建種植水稻「明恢63」 ( 「華恢1號」受體親本)，取三葉期幼苗，五葉期幼苗和分櫱期苗三個時期全株苗材料，液氮研磨後，將三期幼苗研磨粉充分混勻提取純化總RNA，分離純化mRNA，反轉錄合成單鏈cDNA，利用Gubler-HofTman法合成ds cDNA文庫，經末端平滑化，連接Adaptor、限制性酶切，去除短片段後連接到載體pGADT7上，構建水稻質粒載體連接文庫。取0.5yL連接液轉化大腸桿菌，檢測文庫庫容> LSXlO6Cfu, 100萬倍克隆擴增放大cDNA文庫後提取濃度為1. Omg/mL的質粒2mL待用。4、文庫篩選用酵母雙雜交的方法篩選水稻中與蘇雲金桿菌殺蟲蛋白(CrylAb/Bt)相互作用的候選蛋白。本實驗設計中以Bt作為誘餌連接到載體pGBKT7，而水稻文庫蛋白則作為獵物。根據發明方案中所述篩庫方法進行文庫篩選。共轉系統轉化使用的酵母菌株為Y2H Gold yeast strain，將新鮮復甦的酵母單菌落在液體培養基中培養至對數生長期，通過去離子水、ΙΧΤΕ/LiAc重懸、洗滌後獲得感受態細胞；然後利用PEG/LiAc介導的方法，將誘餌融合蛋白和獵物融合蛋白雙質粒系統通過熱擊共轉入新鮮製備的酵母感受態細胞中，最後將轉化後的酵母塗布於培養基上培養。實驗所用酵母雙雜系統共有四個報告基因，即-His，-Ade, AURl-C和MEL1， 因此篩選結果最終確定的陽性克隆應該可以同時將這四個報告基因的表達激活。文庫篩選過程首先是將共轉化DNA-BD/Bait (pGBKT7_BT)和水稻cDNA文庫構建的AD/ prey(pGADT7-Library)的酵母菌液塗布在加有α半乳糖苷酶顯色底物X-α-Gal和抗真菌素金擔子素Aba的雙缺培養基上初篩，這一步篩選所得到的克隆即可以生長且變藍的菌落，理論上認為是由於蛋白質之間的相互作用而激活了兩個報告基因AURl-C和MELl的表達。經過第一輪篩選得到的陽性克隆繼續劃線培養在含X- α -Gal和Aba的四缺培養基上進行更嚴謹的陽性篩選。有些第一輪篩出的陽性克隆在四缺培養基上就不能生長了，這些視為假陽性而予以捨棄。在四缺培養基上仍能很好的生長的菌落被認為又激活了 -His，-Ade 基因的表達，這些菌落被認為是初步篩選得到的陽性結果。四缺培養基上篩選的陽性結果見圖2。提取所有陽性克隆酵母菌株的質粒，電擊法轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，轉化後菌液塗布LB+Amp的平板，以篩選文庫質粒。由於表達誘餌蛋白的質粒是Kana抗性，而表達獵物蛋白的質粒是Amp抗性，就可以篩除誘餌質粒，而只保留獵物質粒。每個板上至少隨機挑取10個單克隆，菌落PCR(圖幻後提取質粒，測序並對序列進行分析。將上述序列分析得到的有意義的陽性蛋白分別與pGBKT7_Bt共轉化Y2H Gold strain酵母菌株，重複前面的篩選過程，再次獲得的陽性克隆，即可確認該蛋白與誘餌蛋白的相互作用。最終得到的陽性互作蛋白有①金屬硫蛋白類蛋白；②肌醇加氧酶類蛋白；③脂肪酶；④冷素類家族蛋白；⑤稻屬gamma鏈前體類似物；⑥芥子酶前體；⑦二氫吡啶二羧酸合酶1，葉綠體內蛋白前體。由此可以看出，轉Bt水稻中這些蛋白會和表達的Bt蛋白發生相互作用，在分子水平上產生非預期效應。
權利要求
1.一種轉基因植物分子水平非預期效應評價的方法，其特徵在於，用外源目的蛋白構建誘餌融合蛋白，用轉基因植物受體親本cDNA文庫構建獵物融合蛋白文庫，通過酵母雙雜交用誘餌融合蛋白對獵物融合蛋白文庫進行篩選，獲得陽性相互作用蛋白，從而實現對轉基因植物分子水平非預期效應的評價。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，將外源基因連接到具有編碼DNA結合功能域基因的酵母雙雜交質粒上構建得到表達誘餌融合蛋白的表達質粒，將cDNA文庫的基因連接到的具有編碼DNA轉錄激活結構域基因的酵母雙雜交質粒上構建得到表達獵物融合蛋白的表達質粒，將這兩種質粒共轉化酵母中，篩選陽性克隆，獲得陽性互作蛋白。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述DNA結合功能域為GAL4-bd或 LexA-bd,所述DNA轉錄激活結構域為GAL4_ad或VP16。
4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，構建誘餌融合蛋白表達質粒的方法是通過PCR特異擴增目的基因，凝膠電泳回收PCR產物，雙酶切同時消化PCR產物和質粒載體 PGBKT7，並回收純化線性酶切產物；將載體和目的基因按照1 3的摩爾比進行連接反應， 16°C過夜；連接產物轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，於抗性培養基上鑑定陽性克隆；液體培養後，提取重組質粒，經過PCR、雙酶切和測序鑑定後，確定為外源目的基因構建的誘餌融合蛋白質粒，最後轉化酵母鑑定外源蛋白重組子的自激活活性和毒性。
5.如權利要求1-4之一所述的方法，其特徵在於，所述cDNA文庫的構建方法是以轉基因植物受體親本的全株幼苗為材料提取純化總RNA，分離純化mRNA，反轉錄合成單鏈cDNA，利用Gubler-Hoffman法合成ds cDNA文庫，經末端平滑化，連接接頭、限制性酶切，去除短片段後連接到質粒載體上；將連接產物轉化大腸桿菌，檢測文庫庫容大於 LSXlO6Cfu,並擴增放大cDNA文庫，即為獵物融合蛋白表達文庫。
6.如權利要求1-4之一所述的方法，其特徵在於，用共轉化的方法通過酵母雙雜交進行文庫篩選的方法是將新鮮復甦的酵母單菌落在液體培養基中培養至對數生長期，通過去離子水、ΙΧΤΕ/LiAc重懸、洗滌後獲得感受態細胞；然後利用PEG/LiAc介導的方法，將誘餌融合蛋白和獵物融合蛋白雙質粒系統通過熱擊共轉入新鮮製備的酵母感受態細胞中， 最後將轉化後的酵母塗布於培養基上培養；酵母雙雜系統共有四個報告基因-His，-Ade, AURl-C和MELl，將共轉化菌液在加有α半乳糖苷酶顯色底物X- α -Gal和抗真菌素金擔子素Aba的雙缺培養基上初篩，篩選能夠生長且變藍的菌落；經過第一輪篩選得到的菌落繼續劃線培養在含X-α-Gal和Aki的四缺培養基上，仍能生長的菌落為初步篩選得到的陽性克隆。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，還包括對初步篩選得到的陽性克隆進一步鑑定提取所有陽性克隆酵母菌株的質粒，電擊法轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，轉化後菌液塗布LB+Amp的平板，以篩選文庫質粒；每個平板上至少隨機挑取10個單克隆，提取質粒，測序並對序列進行分析；將上述序列分析得到的陽性蛋白的克隆提取質粒分別與表達誘餌融合蛋白的質粒載體共轉化酵母菌株，重複前面的篩選過程。
8.如權利要求2 4任一項所述的方法，其特徵在於，所述植物為水稻，所述外源蛋白為CryIAb/Bt，所述具有編碼DNA結合功能域基因的酵母雙雜交質粒為pGBKT7，所述具有編碼DNA轉錄激活功能域基因的酵母雙雜交質粒為PGADT7，所述酵母菌為Y2HGold yeast strain。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，得到的陽性互作蛋白有①金屬硫蛋白類蛋白；②肌醇加氧酶類蛋白；③脂肪酶；④冷素類家族蛋白；⑤稻屬gamma鏈前體類似物；⑥ 芥子酶前體；⑦二氫吡啶二羧酸合酶1，葉綠體內蛋白前體。
全文摘要
本發明提供了一種基於酵母雙雜交技術的轉基因植物分子水平非預期效應評價的方法。將外源目的蛋白構建為誘餌融合蛋白，再將轉基因植物受體親本的cDNA文庫構建獵物融合蛋白，通過酵母雙雜交的方法用誘餌融合蛋白對獵物融合蛋白文庫進行篩選，獲得與外源目的蛋白相互作用的陽性作用子，從而實現對轉基因植物分子水平的非預期效應的評價。
文檔編號C12Q1/02GK102251025SQ20111010479
公開日2011年11月23日 申請日期2011年4月26日 優先權日2011年4月26日
發明者王戎疆, 甄剛, 許崇任, 韓娟 申請人:北京大學