一種增強肽段免疫活性的製備方法和用途的製作方法

2023-06-11 03:14:16 3

專利名稱：一種增強肽段免疫活性的製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用多肽合成的方法建立一種多肽結構，即將多拷貝抗原肽片段 與一個VKGFY多肽片段相連。按照這種方式製備而成的多肽分子具有提高機體免 疫系統對抗原肽片段的免疫反應。可作為免疫製劑用於對疾病的預防和對疾病的 生物(免疫)治療，本發明屬於生物醫藥領域。
背景技術：
生物體的遺傳基因被存儲在多聚核苷酸鏈上，遺傳基因編碼著執行生物學功 能的蛋白質。生物體內的蛋白質多種多樣，它們行使著各種生物學功能維持生命 活動。蛋白質的種類雖然多不勝舉，但它們都是由20個自然界存在的天然氨基 酸組成。由於胺基酸的組成和排列順序的差異導致了蛋白質的千差萬別。 一般來 說，含有50個以上胺基酸的分子被稱為蛋白質，50個以下的被稱為短肽。目前 發現最小的功能小肽是只含有3個胺基酸的3肽物質"促甲狀腺素釋放激素" (TRH)。
由於人類基因組計劃的完成和人類蛋白組計劃的開展，將會有越來越多的蛋 白質功能片段被發現並被作為藥物應用到生物醫藥領域中來。現己開發並在臨床 上得到應用的多肽藥物有"催產素"、"胸腺肽ci 1"、"胸腺五肽"等，有在天 然肽鏈的基礎上進行人工改構製備成為用於治療消化道出血和肢端肥大症的多 肽藥物"奧曲肽"等。蛋白質中的功能片段常常能篩選到含有幾十個或小到只有 三個胺基酸組成的多肽片段，它們為人工合成蛋白質功能片段並將它們投入應用 奠定了基礎。
按照人為的預先設計將具備特定生物學功能的短肽連接在一起，經過人為加 工改造而產生的多功能多肽片段達到預期的目的。這是繼"基因工程"後時代拓展而出的又一項生物技術——"多肽工程"。"多肽工程"在應用領域中具備如下 的優勢-
1. 多肽產物可企業話大規模地合成，產量高，純度高。
2. 多肽藥物的用量小，生物活性高，毒性低。
3. 生產多肽藥物的企業佔地小，設備簡單，設備周轉利用率高，企業屬低能耗， 低排放、低汙染的綠色環保型企業。
多肽製藥是一個新興的製藥領域，隨著人類基因組計劃的完成和"多肽工 程"的深入發展，必將會有更多的多肽藥物面市。

發明內容
人體的免疫器官主要有胸腺、骨髓、脾臟、淋巴結等。脾臟是人體最大的伊 疫器官，T淋巴細胞和B淋巴細胞都在脾臟內部發育成熟，如果脾臟被摘除會導 致機體的體液免疫和細胞免疫功能的紊亂，發生暴發性感染。
美國Tufts大學教授Najjara於1970年發現一種脾臟來源的四肽物質TKPR 具有顯著的抗腫瘤、抗病毒的活性並被命名為Tuftsin,中文名為"促吞噬素"。 實驗證實Tuftsin能使脾內脾小體增多，生發中心生長活躍。Tuftsin能夠提高粒 細胞，單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞的趨化、游離、吞噬活性，提高免疫細胞 分泌細胞因子IL-1、IL-2、TNF- a 、IFN- y 、INF- e等，提高T淋巴細胞的TH1/Th2 平衡向TH1方向偏移，提高細胞毒的作用，增強機體淋巴系統的細胞免疫活性。
Tuftsin對肺癌、肝癌、胃癌、黑色素細胞瘤、膽管癌等多種惡性腫瘤具有較 明顯的治療效果。Tuftsin抗腫瘤的機制主要與它既能促進粒細胞和單核巨噬細胞 的遊走、吞噬、抗原遞呈和細胞毒功能外，又能增加白細胞的數目並刺激提高T 淋巴細胞的功能有關。Tuftsin作為一個參與免疫調節的體液因子具有顯著的抗腫 瘤、抗感染和抗病毒的生物學活性。據報導國外已開始將Tuftsin用於對晚期惡 性腫瘤和AIDS的治療。機體內的專職抗原遞呈細胞，包括粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細 胞等都是從同一個始祖細胞分化發育而來，它們具有對外來抗原的胞飲吞噬，抗 原加工和遞呈的功能。Tuftsin本身是一個僅含有4個胺基酸TKPR的小肽(4 肽)，無抗原性，它可以特異性的結合抗原遞呈細胞表面的受體，促進細胞的吞 噬，抗原加工和遞呈。已經發現以Tuftsin作為抗原肽載體共價連接人工合成的 抗原小肽能夠增強機體對無抗原性，或抗原性很低的小肽的免疫反應，提高抗體 滴度和體內細胞因子N0、 TNF、 IL-1、 IL-2、 IFN-y的分泌水平，能夠誘導T 淋巴細胞的擴增，激發CD4， Thl類型的免疫反應。因此Tuftsin不僅具有激發 T淋巴細胞的細胞毒作用，同時還有激發B淋巴細胞的體液免疫的活性。
以Tuftsin的功能為模板，經過篩選尋找到VKGFY是一個具有較強生物活性 的5肽分子。將多拷貝抗原肽片段以(抗原肽片段-Xn) 2-K-Xn-VKGFY，(抗原 肽片段-Xn) 4— (K-Xn) 2-K-Xn-VKGFY，或(抗原肽片段-Xn) 8— (K-Xn) 4— (K-Xn) 2-K-Xn-VKGFY的形式與一個VKGFY多肽片段連接，形成的產物優點為藉助在C 端VKGFY的幫助把與之相連的多拷貝抗原肽片段帶進抗原遞呈細胞，通過在細胞 內的加工和遞呈將抗原信息傳遞給淋巴細胞。增強抗原肽片段的抗原性，提升抗 體滴度，提高細胞免疫因子的分泌水平，提高T淋巴細胞和B淋巴細胞對抗原肽 片段產生的免疫反應。
按照本發明闡述的製備方式，合成產生的免疫製劑能夠提高機體針對抗原 肽片段產生的免疫反應。合成產物可以作為藥物或多肽疫苗應用在疾病預防或疾 病的生物(免疫)治療。
具體設計方式
多肽合成常用的方法為固相合成法，多肽合成的原理是根據胺基酸兩端的氨 基和羧基之間的縮合反應形成醯胺鍵(肽鍵)連接延長肽鏈。首先將多肽片段的 羧基端胺基酸的羧基與固相樹脂共價相連，合成的順序是從肽段的羧基端(c-端)向氨基端(N-端)方向延長，多肽合成完成後再將合成的多肽產物從固相樹 脂由於一個賴氨酸(K)有兩個氨基可供縮合聯接胺基酸並延長肽鏈。所以在賴 氨酸的2個氨基上可以繼續往下連接胺基酸或延長肽鏈形成分支肽，通過賴氨酸 的這個特性可將多拷貝的抗原肽片段並聯起來形成如下結構序列的多肽產物
1 一種多肽分子結構，它由多拷貝抗原肽片段和一個VKGFY多肽片段兩部分 組成，其中多拷貝並聯的抗原肽片段的C端與一個VKGFY片段的N端相連。 抗原肽片段可以是任意一個需要激發機體免疫反應的抗原肽片段。
2 本多肽分子結構可以是由2個拷貝並聯的抗原肽片段與一個VKGFY片段連 接組成，其結構為(抗原肽片段-Xn)2-K-Xn-VKGFY,其中n代表由n個天 然胺基酸(X)連接成的肽鏈，n為自然數，X代表任意L型或D型天然氨 基酸，以下各項多肽結構中的解釋與此相同。
3 本多肽分子結構可以是由4個拷貝並聯的抗原肽片段與一個VKGFY片段連 接組成，其結構為(抗原肽片段-Xn)4-(K-Xn)2-K-Xn-VKGFY。
4 本多肽分子結構可以是由8個拷貝並聯的抗原肽片段與一個VKGFY片段連 接組成，其結構為(抗原肽片段-Xn)8-(K-Xn)4-(K-Xn)2-K-Xn-VKGFY。
5 按照以上權利要求的方式合成的多肽產物可製備成為藥物原料或醫藥制 劑。
6 按照以上權利要求的方式合成的多肽產物可製成多肽疫苗或藥品用於對疾 病的預防和對疾病的生物(免疫)治療。
根據以上設計並通過多肽合成的方式製備而成的合成產物在體內具有顯 著提高抗原肽片段的免疫學活性的作用。製備的合成產物可以作為多肽疫苗或藥 物對疾病進行預防或治療。
實施例1
按照(抗原肽片段-Xn)2-K-Xn-VKGFY的設計方式，將2個拷貝並聯的癌胚抗 原肽CEA (YLSGADLNL) 9肽的C端與VKGFY片段的N端連接，合成產物為 (YLSGADLNL)2-K-VKGFY。經過分離純化使得合成產物純度達到98%以上用於製備 免疫製劑。一.劑型
注射用凍乾粉針。規格
lmg/安瓿。
處方組成
原輔料 用量
製備工藝-
溶液配製:
合成產物lg
甘露醇50g
磷酸二氫鈉(NaH2P04-2H20)0. 796g
磷酸氫二鈉(Na2HP(V 12H20)1. 755g
注射用水加至1000ml
共製成1000瓶
在100級無菌室內操作。
磷酸緩衝液的配製
① 0.2mol/L NaH2P04:準確稱取磷酸二氫鈉(Na跳.2柳17.8g，加注射 用水溶解並定溶至500ml，搖勻，備用；
② 0. 2mol/L Na2HP04:準確稱取磷酸氫二鈉(Na2HP04.12H20 ) 35. 82g，加注 射用水溶解並定溶至500ml，搖勻，備用；
③ 10鵬ol/L磷酸緩衝液(p服.8 ):取51ml 0. 2mol/L NaH2P04溶液、 49ml0. 2mol/L化2冊04溶液混勻，並定溶至2000ml ，用磷酸調pH值至6. 8備用。
藥液配製-
按照配方準確稱取處方量的甘露醇和合成產物，用10ramol/L磷酸緩衝液 (pH6.8)溶解並定溶至lOOOtnl。準確稱取配製液體積0. 2% (W/V)的活性碳，
加入上述溶液中，攪拌15分鐘；取上述溶液粗濾兩遍脫炭，再用0.2口m微孔濾膜進行正壓無菌過濾，4'遊放備用。 分裝與冷凍
在無菌室內操作；取上述精濾液測定含量，調整裝量，取lml分裝於3ml 藥用安瓿瓶中；製品2(TCX冷凍乾燥機，預凍3小時使製品溫度至-40'C(板溫預
先冷至-20°0，保溫1小時，製冷冷凝器溫度至-55'G開啟真空泵，使乾燥箱內
真空度達到8.0xl(T2mBar左右，對板層加熱升溫，每小時升溫5°G 6小時後板
溫至-10Tg定，品溫隨板溫約每小時升溫3°C真空度維持在6.0x10—2mBar左右，
約乾燥8小時，品溫至共熔點-15T2E右，製品水層消失；而後對板層繼續加熱升
溫，速率為每小時5°C 7小時後板溫至25°C品溫約經14小時至25°C保溫3
小時，乾燥箱極限真空度為6.0x10—2mBar左右；停機，將安瓿封口即得。
工藝驗證
按照處方製備工藝，製備三批註射用凍乾粉針，考察成品的合格率需大於
90%。隨機抽樣檢測成品的理化性質、有關物質、含量、熱源、細菌的含量。
要求不同批次的製劑含量與標示量基本一致，有關物質在製備前後無明顯變 化，無菌、無熱源、血管刺激性、溶血性及過敏性試驗均為陰性。
原輔料的來源及質量規格:_
原輔料 質量規格 來源 用途
合成產物 符合暫定標準 自製 主藥
甘露醇 CP. 2000 89頁 北京製藥廠 支撐劑
磷酸二氫鈉 CP. 2000 1058頁 蘇州中化藥品有限公司 緩衝鹽
磷酸氫二鈉 GB1263-86 蘇州中化藥品有限公司 緩衝鹽
注射用水 CP. 2000 428頁 北京製藥廠 溶劑
針用活性炭 CP. 2000 465頁 北京大力活性炭廠 吸附劑包裝規格-儲存
成品為白色凍乾粉針，lmg/安瓿，10安瓿/盒 2-8'C避光保存，有效期3年。
二.劑型
注射用水針。
規格
lmg/ml/安瓿。
處方組成:
原輔料
用量
合成產物
注射用水加至
共製成
1000瓶
製備工藝
溶液配製在100級無菌室內操作。
精確稱量合成產物，取無菌注射用水將其溶解並定溶在1000ml。用0.2ym微孔 濾膜進行正壓無菌過濾後取lml分裝於3ml藥用安瓿瓶中封口。
成品在包裝時目測封口是否整齊光滑，做內容物的外觀、色澤、澄明度檢查。 隨機抽査成品的裝量、含量、有關物質，細菌、熱源的檢査需達到質檢標 準。局部刺激試驗、溶血性及過敏性試驗均需為陰性。
包裝規格 lmg/ml/安瓿，10支安瓿/盒。 保存方式 4'C避光保存，有效期1年。
使用方式 取lmg/安瓿用注射用水溶解內容物，做皮下注射。每周1次，連 續6次一個療程。 製備和使用方法可做適當變通而不必拘泥於此。
實施例2
合成產物可用於對病人外周血中分離提取的免疫細胞進行刺激，病人自身的 免疫細胞經過刺激能夠提高識別和殺傷外來致病體或腫瘤細胞的能力，加強病人 抵抗疾病的能力。樹突狀細胞(Dendritic Cell,縮寫DC)是唯一能夠觸發靜息T淋巴細胞 並啟動初始免疫反應的抗原提呈細胞(APC)。將分離培養的DC經過與合成產物 的共同孵育，將經過合成產物負載或衝擊的DC細胞重新回輸到腫瘤患者體內， 回輸的DC能夠提高機體對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。 1採集患者外周血細胞20ml，加入肝素20u/ml。 2用RPMI 1640培養液對血液進行對半稀釋，混勻。
3在50ml離心管內加入10ml Ficoll淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)，在其 上緩慢加入20ml血液稀釋液。在4。C， 2000 rpm ， 20分鐘離心分離外周單 核細胞(PBMCs)
4小心吸出層內的PBMCs，用5X體積的PBS洗滌細胞2次，再用RPMI 1640
培養液洗滌一次。洗滌條件為4 °C， 1500 rpm ， 5分鐘。 5用無血清RPMI 1640培養液調整細胞濃度在2x107ml (用0. 2%臺盤藍進行活
細胞計數)然後種植在12孔板，2xl07孔，或種植在25ml塑料培養瓶內，
置37 °C ， 5% C02培養箱中孵育2小時。 6吸出未貼壁的細胞，用溫的RPMI 1640培養液洗滌2次。而貼壁細胞體積小，
多為圓形。
7加入含有粒細胞集落刺激因子(rhGM-CSF ) 1000 U/ml (杭州九源公司， P印rotech公司)，白介素-4(rhlL-4 ) 1000U/ml (P印rotech公司)，20%FCC 的RPMI 1640完全培養液中連續培養6天，每3天換一次培養液。在倒置顯 微鏡下培養3天的細胞可見體積變大，有大突起。培養7天可見細胞已形成 毛刺狀突起，第9天細胞突起變細，變為典型的DC細胞。
8免疫衝擊刺激向細胞培養液中加入合成的多肽產物10ug/lxl(fcells/ml， 繼續孵育24-48小時。
9收穫細胞。
10回輸給患者，回輸的DCs細胞量在lxl06-l(f之間，治療方式為1-3月1次。 經過合成產物負載或衝擊處理過的患者自體DC細胞具有加快細胞增殖，提 高DC細胞特異性捕捉和殺傷腫瘤細胞的能力，具有提高患者對腫瘤細胞的免疫 抵抗能力。
以上方式僅供參考而不必拘泥於此。
權利要求
1.一種多肽分子結構，它由多拷貝抗原肽片段和一個VKGFY多肽片段兩部分組成，其中多拷貝並聯的抗原肽片段的C端與一個VKGFY多肽片段的N端相連。抗原肽片段可以是任意一個需要激發機體免疫反應的抗原肽片段。
2. 本多肽分子結構可以是由2個拷貝並聯的抗原肽片段並聯與一個VKGFY 片段連接組成，其結構為(抗原肽片段-Xn)2-K-Xn-VKGFY，其中n代表 由n個天然胺基酸(X)連接成的肽鏈，n為自然數，X代表任意L型或D 型天然胺基酸，以下各項多肽結構中的解釋與此相同。
3. 本多肽分子結構可以是由4個拷貝並聯的抗原肽片段與一個VKGFY片段連 接組成，其結構為(抗原肽片段-Xn)廠(K-Xn)2-K-Xn-VKGFY。
4. 本多肽分子結構可以是由8個拷貝並聯的抗原肽片段與一個VKGFY片段連 接組成，其結構為(抗原肽片段-Xn)s-(K-Xn)f (K-Xn)2-K-Xn-VKGFY。
5. 按照以上權利要求的方式合成的多肽產物可製備成為藥物原料或醫藥制 劑。
6. 按照以上權利要求的方式合成的多肽產物可製成多肽疫苗或藥品用於對疾病的預防和對疾病的生物(免疫)治療。
全文摘要
本發明的名稱為一種增強肽段免疫活性的製備方法和用途，涉及應用多肽合成的方法建立一種多肽分子結構方式，將一種含有多拷貝並聯的抗原肽分子的C端與一個VKGFY多肽片段的N端相連的結構產物。本方式製備的產物具有提高機體免疫系統對抗原肽片段的免疫反應的特點，按照此方式製備的合成產物可用於對疾病的預防和疾病的生物(免疫)治療。
文檔編號C07K14/005GK101307098SQ200710099348
公開日2008年11月19日 申請日期2007年5月17日 優先權日2007年5月17日
發明者蘇 韓 申請人:北京中天康泰生物科技有限公司