檢測血液中CD4+T細胞數量的側向層析試劑盒及其製備方法與流程

2023-06-11 02:55:26

本發明屬於醫學檢測免疫分析技術領域，特別涉及一種檢測血液中cd4+t細胞數量的側向層析試劑盒及其製備方法。

背景技術：

自1981年世界第一例愛滋病病毒感染者發現至今，短短30多年間，愛滋病在全球肆虐流行，已成為重大的公共衛生問題和社會問題，引起世界衛生組織及各國政府的高度重視。

t淋巴細胞是一類具有抗感染和腫瘤免疫的細胞，它主要分為cd4+t細胞與cd8+t細胞。cd4+t細胞主要起輔助體液免疫和細胞免疫激活的作用。cd4+t細胞表面的cd4分子是愛滋病病毒的受體，當hiv病毒進入人體後，它感染並損壞cd4+t淋巴細胞，導致機體體液免疫和細胞免疫被抑制，致使整個人體免疫功能遭到破壞，最終喪失對各種疾病的抵抗能力而導致死亡。因此可通過cd4+t淋巴細胞記數能夠直接反映hiv感染患者免疫系統損害狀況。

正常成人的cd4+t細胞為每微升的血液中含有500～1600個，愛滋病病毒感染者的cd4+t細胞可能會出現進行性或不規則性下降，提示感染者的免疫系統受到了嚴重損害，當每微升血液中cd4+t細胞小於200個時就可能會發生多種嚴重的機會性感染或腫瘤。目前最新規定每微升血液中hiv感染者的cd4+t細胞數量水平低於350個就應該開始進行治療。

目前檢查愛滋病的主要方法包括：(1)機體免疫功能檢查，主要包括cd4+t細胞數量檢測和cd4+t細胞與cd8+t細胞比值檢測；(2)pcr技術檢測hiv病毒核酸；(3)hiv抗體和抗原檢測，採用酶聯免疫吸附法、免疫螢光檢測法、免疫印跡檢測法、側向層析試紙法、明膠顆粒凝集試驗、放射免疫沉澱法等。cd4+t細胞數量檢測相比於病毒核酸檢測和病毒抗體檢測，能更加直觀的反應出患者的免疫狀態，為患者提供合適的治療時機和治療方式，從而達到精準治療、精確用藥的目的，對於愛滋病的治療防控具有重要意義。而目前針對cd4+t細胞數量檢測主要方法包括流式細胞術法、微流控晶片計數法以及顯微鏡人功計數法。流式細胞術法和微流控晶片計數法，具有檢測樣本量大和檢測準確率高等優勢。但需要昂貴的流式細胞儀或者微流控操控平臺、專業的實驗技術人員和特定的實驗環境等條件。這些條件不利於愛滋病的實時防控，也不利於愛滋病的精準診療在資源匱乏的國家和地區的普及。顯微鏡人功計數法，相比流式細胞術檢測成本更低，儀器要求更低，適合普通檢測實驗室，但同樣需要專業的技術人員在實驗室檢測、操作繁瑣、人為誤差大，不適合快速檢測和現場檢測。

綜合上所述：已上方法都普遍存在如下幾個問題：第一，需要昂貴的儀器設備；第二，需要專業的檢測實驗室和專業的技術人員；第三，大部分儀器成本和檢測成本昂貴難以普及。側向層析試紙條在診斷領域的應用具有如下優點：第一，無需大型儀器設備；第二，操作簡單，無需專業技術人員可用於現場檢測；第三，檢測成本低，檢測速度快，適合推廣應用。但目前市面上的側向層析試紙用於檢測診斷領域主要的檢測對象是血清或血漿中的蛋白分子或核酸分子，而對於全血的檢測，特別是針對血液中細胞數量檢測側向層析技術還是一片空白。

技術實現要素：

本發明的首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種檢測血液中cd4+t細胞數量的側向層析試劑盒。

本發明的另一目的在於提供上述側向層析試劑盒的製備方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種檢測血液中cd4+t細胞數量的側向層析試劑盒，包含樣品處理管和試紙條；其中，樣品處理管含有全血樣品處理液和信號物標記的cd4抗體(信標cd4抗體)；試紙條包括底板和在底板上附著有沿層析方向緊密相連的樣品墊、濾血層、層析膜層和吸水墊；樣品墊部分壓在濾血層上，濾血層部分壓在層析膜層上，吸水墊部分壓在層析膜層上；在層析膜層上設置檢測線(t線)和質控線(c線)，濾血層、檢測線、質控線和吸水墊依次排列。

所述的檢檢測血液中cd4+t細胞數量的側向層析試劑盒，還包括外殼，外殼設置於試紙條的外部；在外殼上設置有加樣孔和觀察孔，加樣孔位於樣品墊上，觀察孔位於層析膜層上檢測線和質控線區域。塑料外殼的作用是防止試紙條受到汙染以及便攜易用。

所述的全血樣品處理液的組成如下：0.02m、ph＝7.3～7.4pb緩衝液中加入0.9％(w/v)nacl、1％(w/v)bsa、1％(w/v)peg-4000、20％(v/v)飽和硫酸銨(22±3℃)、0.1％(w/v)肝素鈉、0.02％(w/v)nan3。

所述的全血樣品處理液在每支所述的樣品處理管中的量優選為50μl。

所述的信號物標記的cd4抗體在每支所述的樣品處理管中的量優選為1μl按cd4抗體計算為0.01mg/ml的信號物標記的cd4抗體。

所述的信號物標記的cd4抗體優選為螢光微球標記的cd4抗體。

所述的螢光微球標記的cd4抗體，優選為通過如下步驟製備得到：在100μl1％(w/v)羧基化的螢光微球溶液中加入400μl雙蒸水，然後加入20μl1‰(w/v)edc(碳二亞胺)和10μl1‰(w/v)nhs(n-羥基琥珀醯亞胺)，混合反應30min，得到活化後的螢光微球溶液；在活化後螢光微球溶液中加入60μl濃度為1mg/ml的cd4抗體溶液，混合均勻，在攪拌的條件下反應2h；接著加入60μl濃度為10％(w/v)的牛血清白蛋白溶液封閉，攪拌反應1h；離心，棄上清，加入60000μl復溶液重懸沉澱，獲得螢光微球標記的cd4抗體；其中，復溶液是0.02m、ph＝8.4的pb緩衝液中加入5％(w/v)蔗糖、5％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)bsa、0.5％(w/v)表面活性劑(s-17)、0.5％(v/v)tween-20、0.5％(w/v)peg-4000和0.01％(w/v)nan3。

所述的螢光微球溶液優選為為度生物的黃綠色螢光微球溶液，螢光微球粒徑約為130nm、固含量為1％(即1ml的溶液中含有10mg微球顆粒)、羧基含量約為75μmol/g、激發波長為468nm、發射波長為508nm。

所述的離心的條件優選為12000rpm離心15min。

所述的底板的材質為不透水物質，優選為塑料，更優選為聚氯乙烯(pvc)。

所述的濾血層的材質優選為v-9型濾血膜。

所述的濾血層由至少兩層濾血膜疊加而成；優選由三層濾血膜疊加而成；更優選為長度為1.25cm的濾膜、長度為1cm的濾膜和長度為0.75cm的濾膜從上到下依次疊加，其中挨著層析膜層的濾血層一端是平整的。濾血層的主要功能是過濾血液中的血細胞。檢測的血液樣本量一般為50-100μl，如果採用單層膜過濾，膜長度已經超出了試紙條的底板長度。通過實驗研究，發現如果採用三層濾血膜，在達到實驗效果的同時也節約直線長度。

所述的層析膜優選為硝酸纖維素膜。

所述的檢測線(t)上設置有羊抗鼠二抗層。羊抗鼠二抗用來識別信號物標記的鼠源cd4+抗體。由於cd4抗原市場價格昂貴且不穩定，如果使用其作為t線包被抗原，將造成檢測成本過高，不適合產品推廣。通過實驗驗證，羊抗鼠二抗對鼠源的cd4+抗體具有優秀的捕獲能力，可以滿足實驗要求，並且製作成本下降了將近100倍。

所述的質控線(c)上設置有信號物標記的兔igg層。質控線在整個系統中主要有兩個作用：第一作為產品的質量控制，直接判斷產品是否有效；第二作為比色指標，可以通過t線和c線的比值反應檢測信號強度，消除誤差幹擾。

所述的信號物標記的兔igg優選為螢光微球標記的兔igg。

所述的螢光微球標記的兔igg，優選為通過如下步驟製備得到：在100μl1％(w/v)羧基化的螢光微球溶液中加入400μl雙蒸水，然後加入20μl(w/v)edc(碳二亞胺)和10μl(w/v)nhs(n-羥基琥珀醯亞胺)，混合反應30min，得到活化後的螢光微球溶液；在活化後螢光微球溶液中加入30μl濃度為2mg/ml的兔igg溶液，混合均勻，在攪拌的條件下反應2h；接著加入60μl濃度為10％(w/v)的牛血清白蛋白溶液封閉，攪拌反應1h；離心，棄上清，加入1000μl復溶液重懸沉澱，獲得螢光微球標記的兔igg；其中，復溶液是0.02m、ph＝8.4的pb緩衝液中加入5％(w/v)蔗糖、5％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)bsa、0.5％(w/v)表面活性劑(s-17)、0.5％(v/v)tween-20、0.5％(w/v)peg-4000和0.01％(w/v)nan3。

所述的螢光微球溶液優選為為度生物的黃綠色螢光微球溶液，螢光微球粒徑約為130nm、固含量為1％(1ml的溶液中含有10mg微球顆粒)、羧基含量約為75μmol/g、激發波長為468nm、發射波長為508nm。

所述的離心的條件優選為12000rpm離心15min。

所述的樣品墊的材質優選為玻璃纖維。

所述的樣品墊為通過全血樣品墊處理液處理得到，具體步驟如下：每條長×寬＝30cm×2cm的樣品墊原材料加入5ml全血樣品墊處理液，37℃乾燥過夜，溼度低於30％、常溫保存；其中全血樣品墊處理液的組成如下：ph值＝7.4、0.015mpbs緩衝液中加入0.5％(w/v)bsa、2％(w/v)海藻糖、2％(w/v)peg-4000、0.5％(v/v)tween-20、0.1％(w/v)肝素鈉、0.02％(w/v)nan3。

所述的吸水墊的材質優選為加厚吸水紙。

所述的檢測血液中cd4+t細胞數量的側向層析試劑盒的製備方法，包括如下步驟：

(1)製備樣品處理管：

①配製全血樣品處理液：100ml0.02m、ph值＝7.3～7.4的pb緩衝液中加入100mg肝素鈉、0.9gnacl、1gbsa、1gpeg-4000、20ml飽和(nh4)2so4(22℃±3℃)、20mgnan3；

②取一支200μlep管(無菌)，加入50μl全血樣品處理液和1μl信號物標記後的cd4抗體，得到樣品處理管；該樣品處理管在23℃±2℃可保存1周，4℃可保存1個月，-20℃可保存3～6個月；

(2)製備試紙條：

①用全血樣品墊處理液處理樣品墊，每條長×寬＝30cm×2cm的樣品墊原材料加入5ml全血樣品墊處理液，37℃乾燥過夜，溼度低於30％、常溫保存；全血樣品墊處理液的組成如下：ph值＝7.4、0.015mpbs緩衝液中加入0.5％(w/v)bsa、2％(w/v)海藻糖、2％(w/v)peg-4000、0.5％(v/v)tween-20、0.1％(w/v)肝素鈉、0.02％(w/v)nan3；

②將羊抗鼠二抗和信號物標記後的兔igg呈直線型包被在層析膜上，分別形成檢測線和質控線；

④先將步驟②得到的層析膜貼附在底板上，得到層析膜層；接著在靠近層析膜層質控線的一端貼上吸水紙，得到吸水墊，吸水墊的部分在層析膜層上；在遠離層析膜層質控線的一端貼上濾血膜，得到濾血層，濾血層的部分位於層析膜層上；再貼上樣品墊，樣品墊的部分位於濾血層上，得到試紙條；

(3)將樣品處理管和試紙條搭配在一起，得到檢測血液中cd4+t細胞數量的側向層析試劑盒。

步驟(2)中所述的羊抗鼠二抗優選通過噴金劃膜儀包被到層析膜上，羊抗鼠二抗的濃度為1mg/ml時，按1μl/cm製備檢測線。

步驟(2)中所述的信號物標記的兔igg優選通過噴金劃膜儀包被到層析膜上，信號物標記的兔igg稀釋14倍後按1μl/cm製備質控線。

本發明的是基於細胞阻斷競爭法原理：向樣品處理管中加入待測的全血樣品，樣品經全血樣本處理液稀釋和前處理，降低纖維蛋白等雜質的幹擾，同時樣品處理管中的信標cd4抗體對樣本進行染色，形成信標cd4抗體和cd4+t細胞複合物；然後，將反應後的混合物滴加到試紙條上，首先，經過樣品墊處理，樣品墊中含有蛋白質、緩衝物質、封閉劑、親水性大分子物質、表面活性劑和抗凝劑等，這些物質使得樣本的滲透率下降，調節溶液ph並為nc膜上的免疫反應提供一個最佳的反應環境；其次，樣品中的全部細胞(包括信標cd4抗體和cd4+t細胞複合物)會被阻隔在濾血層，而樣品中的其他物質(包括血漿、樣品處理液和餘下的信標cd4抗體)通過濾血層到達nc膜；nc膜上的羊抗鼠二抗捕獲信標cd4抗體形成檢測信號。當檢測樣本中cd4+t細胞數量足夠多，能夠將樣品處理管中的信標cd4抗體大部分或全部結合時，檢測線上的羊抗鼠二抗無法捕獲或只能少量捕獲信標cd4抗體而沒有顏色顯示或顏色強度較弱，而質控線上的信號物標記的兔igg作為固定的信號對比線，檢測線通過與其對比而判讀細胞數量，在檢測線顏色強度低於質控線顏色強度的這種情況判讀為陰性；當血液中cd4+t細胞數量較少時，不足以與樣品處理管中信標cd4抗體完全結合，從而存在信標cd4抗體通過濾血層而被檢測線上的羊抗鼠二抗捕獲，檢測線有顏色顯示，並且顏色強度大於等於質控線顏色強度，這種情況判讀為陽性。

本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果：本發明能快速檢測人體血液中的免疫細胞數量有利於及時快速的對患者免疫功能做出評價，對於各類疾病的診療都具有重大意義。本發明提供的檢測血液中cd4+t細胞數量的側向層析試劑盒是在目前傳統的側向層析試紙條結構基礎上進行了重新的設計與改進，並加入了樣品前處理環節，此技術突破了傳統的免疫層析檢測技術對檢測樣本對象的局限性，將免疫層析檢測技術擴展到了一個全新的檢測領域，及血液中細胞的數量檢測領域，推動了側向層析技術發展，建立了一種血液中細胞數量檢測的新方法。本技術對原材料要求低，只需要單一的一種細胞膜表面特異抗體就能建立對應細胞的數量檢測方法，具有檢測目標的廣泛性。本技術相對於傳統的細胞檢測技術具有操作簡單、儀器便攜、檢測成本低等優點，此發明將彌補現如今市場上所缺乏的一種可以在非專業實驗室和非專業實驗人員操作下，利用可攜式設備進行的，能簡便、高效的對愛滋病患者的免疫狀態進行診斷和治療預後的產品。此技術樣品處理時間為15min，檢測時間為15min，根據cd4抗體標記的信號物不同可以採用目測(膠體金)和儀器檢測(螢光微球、量子點)兩種結果讀取方式，可以直接判讀出陰陽性結果或者通過後期數據處理得到具體細胞數量。

附圖說明

圖1是本發明提供的檢測血液中cd4+t細胞數量的側向層析試劑盒的結構示意圖；其中，1-反應管、2-樣品墊、3-濾血層、4-層析膜層、5-檢測線、6-質控線、7-吸水墊、8-底板；箭頭表示層析液流動方向。

圖2是本發明提供的試紙條檢測比例稀釋的血液樣本，並通過檢測線上螢光強度和質控線上螢光強度的比值和樣本稀釋比例得到的曲線圖；其中，不規則曲線為檢測值得到的曲線，斜直線為擬合曲線。

圖3是本發明提供的試紙條檢測通過比例稀釋得到的cd4細胞數量梯度樣本，並通過檢測線上螢光強度和質控線上螢光強度的比值和細胞數量得到的曲線圖；其中，內嵌不規則曲線圖為檢測得到的曲線，外部斜直線圖為以50個細胞/μl～500個細胞/μl細胞梯度的檢測螢光強度的比值得到的擬合曲線。

圖4是本發明全血樣品墊處理液配方優化結果圖；其中圖a為四種樣品墊的測試結果圖；圖b為全血樣品墊4處理液中肝素鈉含量優化結果圖；圖c為全血樣品墊4處理液中peg-400含量優化結果圖；圖d為全血樣品墊4處理液中bsa含量優化結果圖；圖e為全血樣品墊4處理液中tween-20含量優化結果圖；圖f為全血樣品墊4處理液中海藻糖含量優化結果圖。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。

實施例1

檢測血液中cd4+t細胞數量的側向層析試劑盒的製備方法及應用：

1、主要試劑材料，如表1所示：

表1

2、主要使用儀器，如表2所示：

表2

3、主要溶液的配製：

(1)1％(m/v)檸檬酸三鈉溶液：稱取1g檸檬酸三鈉溶解於100ml超純水；

(2)1％(m/v)氯金酸溶液：將1g氯金酸溶解於100ml超純水；

(3)0.25mol/lk2co3溶液：稱取3.45gk2co3溶解於100ml超純水；

(4)1‰(m/v)edc溶液：稱取1mgedc溶解於1ml超純水；

(5)1‰(m/v)nhs：稱取1mgnhs溶解於1ml超純水；

(6)10％(m/v)bsa溶液：稱取10gbsa溶於100ml超純水中；

(7)0.15mol/l，pbs緩衝液(10×)，ph7.4：nacl80g、kh2po42g、kcl2g、na2hpo4·12h2o29g，加入1000ml雙蒸水中溶解；

(8)0.2mol/l，pb緩衝液(10×)，ph7.4：kh2po44g、na2hpo4·12h2o29g，加入1000ml雙蒸水中溶解，ph調節到7.4；

(9)0.2mol/l，pb緩衝液(10×)，ph8.4：kh2po44g、na2hpo4·12h2o29g，加入1000ml雙蒸水中溶解，ph調節到8.4；

(10)復溶液：

加入到20ml0.02mol/lph＝8.4的pb緩衝液中溶解；

(10)飽和硫酸銨：硫酸銨500g，用500ml雙蒸水水浴60℃攪拌溶解，冷卻到室溫，瓶底有晶體析出即可。

(11)全血樣品墊1處理液：100mlph＝7.4、0.015mpbs緩衝液(1×)中加入1gbsa、1g海藻糖、1gpeg-4000、1mltween-20、20mgnan3。

(12)全血樣品墊2處理液：100mlph＝7.4、0.015mpbs緩衝液(1×)中加入0.8gnacl、1g酸水解酪素、1g海藻糖、1gpeg-4000、1gpvp-40k、20mgnan3。

(13)全血樣品墊3處理液：100mlph＝7.4、0.015mpbs緩衝液(1×)中加入0.8gnacl、1gbsa、1g海藻糖、1gpeg-4000、1mltween-20、100mg肝素鈉、20mgnan3。

(14)全血樣品墊4處理液：100mlph＝7.4、0.015mpbs緩衝液(1×)中加入1gbsa、1g海藻糖、1gpeg-4000、1mltween-20、100mg肝素鈉、20mgnan3。

(15)優化後的全血樣品墊處理液：ph值＝7.4、0.015mpbs緩衝液中加入0.5％(w/v)bsa、2％(w/v)海藻糖、2％(w/v)peg-4000、0.5％(v/v)tween-20、0.1％(w/v)肝素鈉、0.02％(w/v)nan3。

(16)全血樣品處理液：100mlph＝7.4、0.02mpb緩衝液中加入0.9gnacl、1gbsa、1gpeg-4000、20ml飽和硫酸銨(22±3℃)、100mg肝素鈉、20mgnan3。

4、試劑盒的製備

4.1螢光微球

購於為度生物有限公司，粒徑130nm，固含量1mg/ml，激發波長468nm，發射波長508nm。

4.2螢光微球標記的兔igg的製備

100μl羧基化的螢光微球溶液中加入400μlddh2o，然後加入20μl(w/v)edc和10μl(w/v)nhs，混合反應30min；然後加入60μl兔igg(1mg/ml)混合均勻，在攪拌的條件下反應2h；加入60μl10％牛血清白蛋白封閉，攪拌反應1h；最後12000rpm離心15min棄上清，加入10000μl復溶液重懸沉澱，並用超聲清洗儀高頻和低頻各清洗6min使溶液充分重懸，獲得螢光微球標記的兔igg(fnps-兔igg)，4℃保存。

4.3螢光微球標記的cd4抗體的製備

100μl羧基化的螢光微球溶液中加入400μlddh2o，然後加入20μl(w/v)edc和10μl(w/v)nhs，混合反應30min；然後加入60μlcd4抗體(1mg/ml)混合均勻，在攪拌的條件下反應2h；加入60μl10％牛血清白蛋白封閉，攪拌反應1h；最後12000rpm離心15min棄上清，加入10000μl復溶液重懸沉澱，並用超聲清洗儀高頻和低頻各清洗6min使溶液充分重懸，獲得螢光微球標記的cd4抗體，4℃保存。

4.4樣品墊的處理

樣品墊處理：每條長×寬＝30cm×2cm的樣品墊原材料加入5ml優化後的全血樣品墊處理液，37℃乾燥過夜，溼度低於30％、常溫保存。

5、基於螢光微球信號系統的檢測人體血液中的cd4+t細胞數量的免疫層析試紙條的組裝

如圖1所示，基於螢光微球信號系統的檢測人體血液中的cd4+t細胞數量的側向層析試紙條檢測系統包括反應管1、樣品墊2、濾血層3、層析膜4、檢測線5、質控線6、吸水墊7、底板8。

反應管1加入50μl全血樣品處理液，然後用微量移液器量取1μl螢光微球標記的cd4抗體加入到反應管1中；把羊抗鼠igg(1mg/ml)和稀釋14倍的fnps-兔igg用噴金劃膜儀以1μl/cm的量包被到層析膜(硝酸纖維素膜)4上，作為檢測線5和質控線6，並且在37℃烘箱烘3h。在底板8上順次相互搭接樣品墊2、濾血層3、層析膜4和吸水墊7，得到的試紙板按要求切割成3.51mm(寬度)的試紙條。再裝進塑料卡殼(塑料卡殼開有加樣孔和檢測孔，加樣孔的位置位於樣品墊位置；檢測孔的位置位於檢測線所在區域)組成完整的基於螢光微球信號系統的的cd4+t細胞數量檢測的免疫層析試紙條。

一個效果更佳的試紙條，是濾血層3為三層，長度為1.25cm的濾膜、長度為1cm的濾膜和長度為0.75cm的濾膜從上到下依次疊加，其中挨著層析膜層的濾血層一端是平整的。

6、基於螢光試紙條檢測cd4細胞數量

6.1試紙條檢測流程

取50μl抗凝全血加入到樣品處理管中，輕微吸打混勻，反應15min；從樣品處理管中取75μl反應後的液體加入到試紙條的加樣孔，15min用螢光讀卡儀判讀。

6.2檢測比例稀釋的血液樣本

將正常人的全血樣本進行比例稀釋到不同百分濃度(0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，相應細胞也會隨此呈現出不同的濃度梯度，然後按照試紙檢測流程操作。結果如圖2所示：通過計算檢測線上螢光強度和質控線上螢光強度的比值，繪製曲線，並擬合。本試紙條條可以明顯的區分不同比例稀釋下的全血樣本。

6.3檢測不同cd4細胞濃度數量的稀釋樣本

a：絕對計數：1)、用肝素鈉真空抗凝管抽取正常人的靜脈血樣本；2)、用移液器吸取20μl螢光抗體混合染色液(流式絕對計數自帶的流式抗體染色液cd3cd4cd45三色流式抗體)加到bdtrucounttmtubes上方，請勿接觸到顆粒；3)、用移液器吸取50μl抗凝全血加到bdtrucounttmtubes上方，請勿接觸到管壁；4)、蓋上計數管蓋，並輕輕地進行渦旋混合，在室溫(20～30℃)避光環境下孵育15min；5)、向計數管中添加450μl的1×facs溶血素，蓋上計數管蓋，並輕輕地進行渦旋混合，在室溫避光反應15min；6)、將樣本上流式細胞儀進行分析。

b：試紙條檢測：1)、通過流式得到的數據進行分析計算，得到樣本的細胞數為689個細胞/μl；2)、按照cd4細胞數量梯度(0個細胞/μl、50個細胞/μl、100個細胞/μl、200個細胞/μl、300個細胞/μl、400個細胞/μl、500個細胞/μl、600個細胞/μl)對樣本進行稀釋，製備得到不同的cd4細胞數量的全血樣本；3)、按照試紙條檢測流程進行檢測。檢測結果如圖3所示：通過計算檢測線上螢光強度和質控線上螢光強度的比值，繪製曲線，並得到相關標準曲線，相關性良好可用於全血中cd4細胞數量的定量分析。

7、結果觀察

陽性結果為檢測線和質控線出現螢光，陰性結果為只有質控線出現螢光；若質控線沒有螢光，則該試紙條無效。膠體金試紙條的靈敏度太低無法滿足檢測要求，螢光試紙條在50～500個細胞/μl的範圍內具有良好的相關性，滿足檢測要求。

實施例2濾血膜的設計優化

首先從市場上挑選了幾種常見的濾血膜，進行了材料性價比的評價，最後選定上海捷寧生物科技有限公司的v-9型濾血膜。將v-9型濾血膜裁剪成不同長度(0.5cm、0.75cm、1.0cm、1.25cm、1.5cm、1.75cm、2.0cm)，按實施例1進行試紙條組裝，然後加入75μl全血樣本，當濾血膜長度達到2.0cm能將75μl全血樣本中的血細胞過濾乾淨，nc膜上不會出現血細胞的幹擾免疫反應和信號發生。然而實驗室的試紙條全長只有6.0cm，吸水墊長1.5cm、nc膜長2.5cm、前端(樣品墊、濾血層)只剩2.0cm，這種試紙條結構無法滿足要求。因此採用了一種一端對齊的三層疊加結構(0.75cm、1.0cm、1.25cm)，疊加後的濾血層長度為1.25cm，結構滿足要求，同時能將75μl全血樣本中的血細胞過濾乾淨，不會干擾免疫反應和信號發生

實施例3對樣品墊及全血樣品墊處理液進行優化

(1)樣品墊的處理和組裝

①選擇4種廣泛使用得血液檢測樣品墊處理液配方配置樣品墊處理液，用選用玻璃纖維膜(上海捷寧公司提供)作為樣品墊原材，用全血樣品墊1處理液、全血樣品墊2處理液、全血樣品墊3處理液和全血樣品墊4處理液分別處理玻璃纖維膜，得到4種全血樣品墊(樣品墊1、2、3、4)，同時設置空白組，即不用處理液處理的玻璃纖維膜。

全血樣品墊處理液處理玻璃纖維膜的步驟如下：玻璃纖維膜按照每條長×寬＝30cm×2cm的切割成空白樣品墊，每條空白樣品墊對應加入5ml全血樣品墊處理液，37℃乾燥過夜，溼度低於30％、常溫保存。

②按實施例1組裝成試紙條。

③按實施例1中6.1試紙條檢測流程，進行試紙條測試，檢測血漿樣本得到的螢光強度最強為最優。結果如圖4a所示，4種樣品墊處理處理後的樣品墊的效果比較，樣品墊4的效果最優，可見，全血樣品墊4的處理液的效果較優。接著對全血樣品墊4處理液的各組分進一步優化。

(2)全血樣品墊4處理液的優化

對全血樣品墊4處理液的配方進行優化，第一組是肝素鈉的濃度分別設置為0、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％，其他成分和濃度同全血樣品墊4處理液；第二組是peg-4000的濃度分別設置為0、0.5％、1％、1.5％、2％，其他成分和濃度同全血樣品墊4處理液；第三組是bsa的濃度分別設置為0、0.5％、1％、1.5％、2％，其他成分和濃度同全血樣品墊4處理液；第四組是tween-20的濃度分別設置為0、0.5％、1％、1.5％、2％，其他成分和濃度同全血樣品墊4處理液；第五組是海藻糖的濃度分別設置為0、0.5％、1％、1.5％、2％，其他成分和濃度同全血樣品墊4處理液。結果如圖4b～f所示，得到了優化後的全血樣品墊處理液：0.015m、ph＝7.4的pbs緩衝液中加入0.5％(w/v)bsa、2％(w/v)海藻糖、2％(w/v)peg-4000、0.5％(w/v)tween-20、0.1％(w/v)肝素鈉、0.02％(w/v)nan3。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。