一種糖類物質生物晶片標記和檢測方法

2023-06-10 18:58:46 2

專利名稱：：一種糖類物質生物晶片標記和檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種糖類物質生物晶片標記和檢測方法。
背景技術：
：由於無機納米粒子(金,銀，量子點等)具有特殊的物理和化學性質，近十年來被廣泛應用於各種納米技術，生物納米技術和生物醫學檢測技術等領域(化學綜述，CtaJev.，2004，族，293-346;Oz綴to，2005,風1547-1562)。共振光散射技術(RLS)是近年迅速發展起來的新的儀器分析技術，因其靈敏度高，操作簡單等顯著特點而備受關注(科學，化^2w,1995,2眠935-939;科學，Scz'e"ce,2000,2砂，1757-1760)。生物晶片是目前基因組學，蛋白質組學研究的重要工具，具有高通量，並對檢測樣品消耗量少等優點(基因生物學，Ge畫e編.2001，2，research0004.10004.13)。但目前，糖類物質生物晶片主要以螢光為檢測手段，因而在檢測靈敏度，選擇性等方面尚具有一定的缺點；拓展糖類物質生物晶片的檢測手段對其發展有重要意義(A^we，2007，《437-444)。將金納米粒子標記糖類物質生物晶片和共振光散射光譜檢測糖類物質生物晶片方法相結合，有助於提高糖類物質生物晶片的靈敏度，重現性和選擇性。
發明內容以多肽混合物(胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨酸與胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨醯甘氨醯賴氨醯(生物素)甘氨酸)修飾金納米粒子具有合成方法簡單，快速並且穩定性好，生物相容性好等優點。而親和素-生物素(avidin-biotin)是目前發現的最穩定的配合物。本發明利用親和素-生物素反應以多肽(胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨酸與胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨醯甘氨醯賴氨醯(生物素)甘氨酸)修飾的金納米粒子標記物；通過螢光染料修飾親和素與生物素反應標記糖類物質生物晶片，並結合表面銀增強技術以RLS為檢測手段，研製一種新型的糖類物質生物晶片；並實現單糖，糖蛋白檢測以及糖類物質與相應凝集素之間相互作用的研究。本發明的目的是提供一種糖類物質生物晶片標記和檢測方法。(1)以多肽修飾的金納米粒子作為糖類物質生物晶片的標記物；(2)以共振光散射光譜法為糖類物質生物晶片的檢測手段；(3)通過親和素與生物素反應標記反應過程。實現本發明方法的具體技術方案如下1)多肽修飾金納米粒子的合成胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨酸和胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨醯甘氨醯賴氨醯(生物素)甘氨酸，按摩爾比9:1製備多肽混合物的混合溶液，將檸檬酸鈉修飾的金納米粒子與多肽混合溶液的混合物以摩爾比l:50000混合，室溫反應l-2小時後，在轉速為13000轉/分鐘的條件下通過離心提純反應產物，獲得多肽修飾的金納米粒子；將多肽修飾的金納米粒子分散在中性磷酸鹽緩衝溶液中4°C下保存；2)製作糖類物質生物晶片由北京博奧生物技術有限公司提供的SmartArrayer48晶片製作系統上製作並處理糖類物質生物晶片點樣量為lnL/點；為獲得好的陣列點並保持生物分子的活性，點樣液為含有體積濃度為40%的甘油，體積濃度為0.005%的吐溫-20(Tween-20)，pH-8.5的0.15MNaCl和0.3M磷酸鹽緩衝溶液；在溫度為25。C，溼度為75%反應12小時；用1%(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封閉晶片後得到糖類物質生物晶片；所述的糖類物質為單糖或糖蛋白；3)標記糖類物質生物晶片將步驟2)製作好的糖類物質生物晶片分別與25.6pg/ml-100iig/mL的生物素標記的凝集素，濃度為50pg/mL親和素(avidin)和濃度為2.5x10—9M的步驟1)製得的多肽修飾的金納米粒子溶液，在37。C反應l小時，之後用磷酸鹽緩衝溶液清洗並離心甩幹，得到標記的糖類物質生物晶片；4)銀增強反應為了進一步提高檢測靈敏度，滴加即制即用的銀增強溶液使其完全覆蓋在步驟3)標記後的糖類物質生物晶片上，反應5-10分鐘，用18.2MQ水衝洗得到信號增強糖類物質生物晶片；所述的銀增強溶液是將美國西格瑪(Sigma)公司生產的銀增強溶液A與銀增強溶液B按體積比1:1混合所得；5)以RLS檢測糖類物質生物晶片將步驟4)信號增強後所得的糖類物質生物晶片放入美國TdeChem.InternationalInc.公司生產的色度陣列掃描儀(ArrayltSpotWareColorimetricMicroarrayScamier)檢測，得到糖類物質生物晶片的共振光散射光譜(RLS)有益效果(1)本發明提供的方法具有通用性，並具有靈敏度高，達到32ng/mL，選擇性好以及樣品消耗量少的特點。應用本方法可實現對單糖，糖蛋白檢測以及糖類物質與相應凝集素之間相互作用的研究。(2)本發明提供一種多肽修飾金納米粒子標記方法，與其他金納米粒子標記方法相比具有簡單，穩定，檢測限低等優點。利用這一方法所獲得的單糖(Gal-P)檢測限為8^M，凝集素(RCA120)檢測限為100pg/mL;二者的線性範圍均為3個數量級，見表l。表l.單孝軎晶片RLS檢測或螢光檢測相應的檢測限以及線性範圍tableseeoriginaldocumentpage7這一方法所獲得的糖蛋白(Asf)檢測限為32ng/ml，凝集素(RCA120)的檢測限為25.6pg/mL;二者的線性範圍均為3個數量級，見表2。表2.糖蛋白晶片RLS檢測或螢光檢測相應的檢測限以及線性範圍tableseeoriginaldocumentpage7ConA0.5ng/ml1-1000ng/ml100ng/ml0.5-10ng/ml圖1是用本發明的方法所獲得的蓖麻凝集素-120濃度為1.5^g/ml時，4-氨基苯基-p-D-半乳吡喃糖苷檢測的標準曲線圖。圖2是本發明的方法所獲得不同濃度蓖麻凝集素-120與25mMGal-|3相互作用檢測的標準曲線圖。圖3是用本發明的方法所獲得的蓖麻凝集素-120濃度為2Mg/ml時，無唾液酸胎球蛋白(Asf)檢測的標準曲線圖圖4是不同濃度蓖麻凝集素-120與250)ag/mlAsf相互作用檢測的標準曲線圖。具體實施例方式實施例1:4-氨基苯基-a-D-甘露吡喃糖苷(Man-a)的標記和檢測(1)多肽修飾金納米粒子的合成胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨酸和胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨醯甘氨醯賴氨醯(生物素)甘氨酸按摩爾比9:1製備多肽混合物的混合溶液，將檸檬酸鈉修飾的金納米粒子與多肽混合溶液的混合物以摩爾比l:50000混合，室溫反應1-2小時後，在轉速為13000轉/分鐘(16100g)的條件下通過離心提純反應產物，獲得多肽修飾的金納米粒子；將多肽修飾的金納米粒子分散在中性磷酸鹽緩衝溶液中4°C下保存；(2)製作糖類物質生物晶片由北京博奧生物技術有限公司提供的SmartArmyer48晶片製作系統上製作100nM-50mM4-氨基苯基-a-D-甘露吡喃糖苷(Man-a)單糖晶片，通過l。/。(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封閉晶片點樣量為lnL/點；為獲得好的陣列點並保持生物分子的活性，點樣液為含有體積濃度為40%的甘油，體積濃度為0.005%的吐溫-20(Tween-20)，pl^8.5的0.15MNaCl和0.3M磷酸鹽緩衝溶液；在溫度為25。C，溼度為75%反應12小時；用1%(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及O.lM乙醇胺封閉晶片後得到100^iM-50mM4-氨基苯基-a-D-甘露吡喃糖苷(Man-(x)單糖晶片；(3)標記糖類物質生物晶片將步驟(2)製作好的100pM-50mM4-氨基苯基-a-D-甘露吡喃糖苷(Man-a)單糖晶片分別依次與100pg/ml-50jag/ml生物素標記的刀豆凝集素(biotin-ConA)，50pg/mL親和素(avidin-FITC)和2.5xl(T9M多肽修飾的金納米粒子，在37。C分別反應lh，之後用磷酸鹽緩衝溶液清洗並離心甩幹；(4)銀增強反應為了進一步提高檢測靈敏度，滴加即制即用的銀增強溶液使其完全覆蓋在標記後的糖類物質生物晶片上，反應8分鐘，用18.2MQ水衝洗得到信號增強糖類物質生物晶片；所述的銀增強溶液是將美國西格瑪(Sigma)公司生產的銀增強溶液A與銀增強溶液B按體積比11混合所得；(5)以RLS檢測糖類物質生物晶片將信號增強後所得的糖類物質生物晶片放入美國TdeChem.InternationalInc.公司生產的色度陣列掃描儀(ArmyltSpotWareColorimetricMicroarrayScanner)檢測，得到糖類物質生物晶片的RLS檢測信號。利用這一方法所獲得的Man-a檢測限為100^M，biotin-ConA檢測限為100pg/mL;二者的線性範圍均為2個數量級。實施例2:4-氨基苯基-P-D-半乳吡喃糖苷(Gal-P)的標記和檢測(1)多肽修飾金納米粒子的合成胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨酸和胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨醯甘氨醯賴氨醯(生物素)甘氨酸按摩爾比9:1製備多肽混合物的混合溶液，將檸檬酸鈉修飾的金納米粒子與多肽混合溶液的混合物以摩爾比l:50000混合，室溫反應1-2小時後，在轉速為13000轉/分鐘(~16100g)的條件下通過離心提純反應產物，獲得多肽修飾的金納米粒子；將多肽修飾的金納米粒子分散在中性磷酸鹽緩衝溶液中4°C下保存；(2)製作糖類物質生物晶片由北京博奧生物技術有限公司提供的SmartArmyer48晶片製作系統上製作8|uM-100mM4-氨基苯基-(3-D-半乳吡喃糖苷(Gal-P)單糖晶片，通過l%(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封閉晶片點樣量為lnL/點；為獲得好的陣列點並保持生物分子的活性，點樣液為含有體積濃度為40%的甘油，體積濃度為0.005%的吐溫-20(Tween-20)，pH=8.5的0.15MNaCl和0.3M磷酸鹽緩衝溶液；在溫度為25。C，溼度為75%反應12小時；用l%(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封閉晶片後得到8pM-100mM4-氨基苯基-p-D-半乳吡喃糖苷(Gal-P)單糖晶片；(3)標記糖類物質生物晶片將步驟(2)製作好的8M-100mM4-氨基苯基-P-D-半乳吡喃糖苷(Gal-P)單糖晶片分別依次與100pg/ml-100ng/ml生物素標記的蓖麻凝集素-120(biotm-RCA120)，50貼/mL親和素(avidin-FITC)禾口2.5xl(T9M多肽修飾的金納米粒子，在37。C分別反應lh，之後用磷酸鹽緩衝溶液清洗並離心甩幹；(4)銀增強反應為了進一步提高檢測靈敏度，滴加即制即用的銀增強溶液使其完全覆蓋在標記後的糖類物質生物晶片上，反應10分鐘，用18.2M。水衝洗得到信號增強糖類物質生物晶片；所述的銀增強溶液是將美國西格瑪(Sigma)公司生產的銀增強溶液A與銀增強溶液B按體積比1:1混合所得；(5)以RLS檢測糖類物質生物晶片將信號增強後所得的糖類物質生物晶片放入美國TdeChem.InternationalInc.公司生產的色度陣列掃描儀(ArrayltSpotWareColorimetricMicroarrayScanner)檢測，得到糖類物質生物晶片的RLS檢測信號。利用這一方法所獲得的獲得的Gal-P檢測限為8nM，biotin-RCA120檢測限為100pg/mL;二者的線性範圍均為3個數量級。實施例3:核糖核酸酶B(RNaseB)的標記和檢測(1)多肽修飾金納米粒子的合成胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨酸和胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨醯甘氨醯賴氨醯(生物素)甘氨酸按摩爾比9:1製備多肽混合物的混合溶液，將檸檬酸鈉修飾的金納米粒子與多肽混合溶液的混合物以摩爾比l:50000混合，室溫反應1-2小時後，在轉速為13000轉/分鐘(~16100g)的條件下通過離心提純反應產物，獲得多肽修飾的金納米粒子；將多肽修飾的金納米粒子分散在中性磷酸鹽緩衝溶液中4°C下保存；(2)製作糖類物質生物晶片由北京博奧生物技術有限公司提供的SmartArrayer48晶片製作系統上製作0.16ng/ml-lmg/ml核糖核酸酶B(RNaseB)的糖蛋白晶片，通過1%(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封閉晶片點樣量為lnL/點；為獲得好的陣列點並保持生物分子的活性，點樣液為含有體積濃度為40%的甘油，體積濃度為0.005。/。的吐溫-20(Tween-20)，pH-8.5的0.15MNaCl和0.3M磷酸鹽緩衝溶液；在溫度為25。C，溼度為75%反應12小時；用1%(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及O.lM乙醇胺封閉晶片後得到0.16jLig/ml-lmg/ml核糖核酸酶B(RNaseB)的糖蛋白晶片；(3)標記糖類物質生物晶片將步驟(2)製作好的0.16pg/ml-lmg/ml核糖核酸酶B(RNaseB)的糖蛋白晶片分別依次與0.5ng/ml-10pg/ml生物素標記的刀豆凝集素(biotin-ConA)，50pg/mL親和素(avidin-FITC)和2.5xl(T9M多肽修飾的金納米粒子，在37。C分別反應lh，之後用磷酸鹽緩衝溶液清洗並離心甩幹；(4)銀增強反應為了進一步提高檢測靈敏度，滴加即制即用的銀增強溶液使其完全覆蓋在標記後的糖類物質生物晶片上，反應5分鐘，用18.2MQ水衝洗得到信號增強糖類物質生物晶片；所述的銀增強溶液是將美國西格瑪(Sigma)公司生產的銀增強溶液A與銀增強溶液B按體積比1:1混合所得；(5)以RLS檢測糖類物質生物晶片將信號增強後所得的糖類物質生物晶片放入美國TeleChem.InternationalInc.公司生產的色度陣列掃描儀(ArrayltSpotWareColorimetricMicroarrayScanner)檢測，得到糖類物質生物晶片的RLS檢測信號。利用這一方法所獲得的RNaseB檢測限為0.16pg/mL，biotin-ConA的檢測限為0.5ng/mL;二者的線性範圍均為3個數量級。實施例4:無唾液酸胎球蛋白(Asf)的標記和檢測(1)多肽修飾金納米粒子的合成胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨酸和胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨醯甘氨醯賴氨醯(生物素)甘氨酸按摩爾比9:1製備多肽混合物的混合溶液，將檸檬酸鈉修飾的金納米粒子與多肽混合溶液的混合物以摩爾比l:50000混合，室溫反應1-2小時後，在轉速為13000轉/分鐘(~16100g)的條件下通過離心提純反應產物，獲得多肽修飾的金納米粒子；將多肽修飾的金納米粒子分散在中性磷酸鹽緩衝溶液中4°C下保存；(2)製作糖類物質生物晶片由北京博奧生物技術有限公司提供的SmartArrayer48晶片製作系統上製作32ng/ml-lmg/ml無唾液酸胎球蛋白(Asf)的糖蛋白晶片，通過1%(wAO牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封閉晶片點樣量為lnL/點；為獲得好的陣列點並保持生物分子的活性，點樣液為含有體積濃度為40%的甘油，體積濃度為0.005%的吐溫-20(Tween-20)，pH-8.5的0.15MNaCl和0.3M磷酸鹽緩衝溶液；在溫度為25。C，溼度為75%反應12小時；用1%(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封閉晶片後得到32ng/ml-lmg/ml無唾液酸胎球蛋白(Asf)的糖蛋白晶片；(3)標記糖類物質生物晶片將步驟(2)製作好的32ng/ml-lmg/ml無唾液酸胎球蛋白(Asf)的糖蛋白晶片分別依次與25.6pg/ml-100ng/mL生物素標記的蓖麻凝集素-120(biotin-RCA120)，50貼/mL親和素(avidin-FITC)和2.5xl0'9M多肽修飾的金納米粒子，在37。C分別反應lh，之後用磷酸鹽緩衝溶液清洗並離心甩幹；(4)銀增強反應為了進一步提高檢測靈敏度，滴加即制即用的銀增強溶液使其完全覆蓋在標記後的糖類物質生物晶片上，反應8分鐘，用18.2MQ水衝洗得到信號增強糖類物質生物晶片；所述的銀增強溶液是將美國西格瑪(Sigma)公司生產的銀增強溶液A與銀增強溶液B按體積比1:1混合所得；(5)以RLS檢測糖類物質生物晶片將信號增強後所得的糖類物質生物晶片放入美國TeleChem.InternationalInc.公司生產的色度陣列掃描儀(ArrayltSpotWareColorimetricMicroarrayScanner)檢測，得到糖類物質生物晶片的RLS檢測信號。利用這一方法所獲得的Asf檢測限為32ng/ml，biotin-RCA120的檢測限為25.6pg/mL;二者的線性範圍均為3個數量級。1權利要求1、一種新型糖類物質生物晶片標記與檢測方法，其步驟和條件為1)多肽修飾金納米粒子的合成胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨酸和胱氨醯丙氨醯亮氨醯天門冬氨醯天門冬氨醯甘氨醯賴氨醯(生物素)甘氨酸，按摩爾比9∶1製備多肽混合物的混合溶液，將檸檬酸鈉修飾的金納米粒子與多肽混合溶液的混合物以摩爾比1∶50000混合，室溫反應1-2小時後，在轉速為13000轉/分鐘的條件下通過離心提純反應產物，獲得多肽修飾的金納米粒子；將多肽修飾的金納米粒子分散在中性磷酸鹽緩衝溶液中4℃下保存；2)製作糖類物質生物晶片由北京博奧生物技術有限公司提供的SmartArrayer48晶片製作系統上製作並處理糖類物質生物晶片點樣量為1nL/點；為獲得好的陣列點並保持生物分子的活性，點樣液含有體積濃度為40％的甘油，體積濃度為0.005％的吐溫-20，pH＝8.5的0.15MNaCl和0.3M磷酸鹽緩衝溶液；在溫度為25℃，溼度為75％反應12小時；用重量體積濃度為1％的牛血清蛋白以及0.1M乙醇胺封閉晶片後得到糖類物質生物晶片；所述的糖類物質為單糖或糖蛋白；3)標記糖類物質生物晶片將步驟2)製作好的糖類物質生物晶片分別與25.6pg/ml-100μg/mL的生物素標記的凝集素，濃度為50μg/mL親和素和濃度為2.5×10-9M的步驟1)製得的多肽修飾的金納米粒子溶液，在37℃反應1小時，之後用磷酸鹽緩衝溶液清洗並離心甩幹，得到標記的糖類物質生物晶片；4)銀增強反應為了進一步提高檢測靈敏度，滴加即制即用的銀增強溶液使其完全覆蓋在步驟3)標記後的糖類物質生物晶片上，反應5-10分鐘，用18.2MΩ水衝洗得到信號增強糖類物質生物晶片；所述的銀增強溶液是將美國西格瑪(Sigma)公司生產的銀增強溶液A與銀增強溶液B按體積比1∶1混合所得；5)以共振光散射光譜檢測糖類物質生物晶片將步驟4)信號增強後所得的糖類物質生物晶片放入美國TeleChem.InternationalInc.公司生產的色度陣列掃描儀檢測，得到糖類物質生物晶片的共振光散射光譜檢測信號。全文摘要本發明提供了一種糖類物質生物晶片標記和檢測方法。該方法以多肽修飾的金納米粒子作為糖類物質生物晶片的標記物；以共振光散射光譜法為糖類物質生物晶片的檢測手段；通過親和素與生物素反應標記反應過程。該方法具有通用性，並具有靈敏度高，達到32ng/mL；選擇性好以及樣品消耗量少的特點。該方法獲得的單糖檢測限為8μM，凝集素檢測限為100pg/mL；二者的線性範圍均為3個數量級；得的糖蛋白檢測限為32ng/ml，凝集素檢測限為25.6pg/mL；二者的線性範圍均為3個數量級。該方法可實現對單糖，糖蛋白檢測以及糖類物質與相應凝集素之間相互作用的研究。文檔編號G01N33/50GK101493455SQ200910066559公開日2009年7月29日申請日期2009年2月24日優先權日2009年2月24日發明者劉殿駿,王振新,高晶清申請人:中國科學院長春應用化學研究所