促腦康的製作方法
2023-06-10 15:10:16
專利名稱：促腦康的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種神經生長刺激肽(NTPS)，臨床應用於腦外傷或腦類後遺症及各種精神、神經疾病的治療。
在本領域，具有刺激神經元突起生長和支持存活作用的生物因子主要分兩大類1、神經營養因子(NTPS)，這些因子對神經細胞具有營養和支持存活的作用，包括神經生長因子(NGF)及其基因家庭成員腦源性神經營養因子(BDNF)，神經營養素III(Neurotrophin3)以及睫狀神經營養因子(CNTF)等[1]，2、神經突起生長因子(NTPS)，它們主要能促進神經元的突起形成和生長上述因子中，NGF、BDNF、NT-3和CNTF的分子結構，胺基酸序列目前均已清楚。NGF和BDNF已有基因工程產品上市，並已取得初步的臨床效果[2、3]，但因價格昂貴而難以臨床推廣應用。腦活素，是奧地利依比威大藥廠從成年豬腦組織中製備的腦蛋白水解液，主要成分是一系列小分子多肽和胺基酸，對神經元具有一定的營養作用，現已用於治療各種神經系統疾病[4、5]。國內也有與腦活素相似的同類產品問世。以上產品均從成年豬腦中來源，而從健康幼年哺乳類動物腦中製備NTPS活性物質，目前尚未見。
本發明的目的在於提供一種從健康幼年哺乳類動物的腦中提取具有較高生物活性的神經生長刺激肽(NTPS)，供臨床上用於治療腦外傷、腦炎後遺症及多種神經系統疾病可以是口服液和肌肉注射，或與其它藥物配伍靜脈滴入。
本發明是一種穩定的神經生長刺激肽(NTPS)。具有如下特徵(1)在PH2-10範圍內穩定；(2)耐熱75-80℃，30min，活性不改變；加熱100℃，15min後活性喪失；(3)在多種蛋白水解酶，37℃，2小時條件下生物活性喪失；(4)在DNAse，RNAse，37℃，2小時條件下，生物活性喪失；(5)在加入3-8％甘露醇凍幹密封條件下，室溫貯存1年，4℃貯存2年，-20℃貯存3年，生物活性不改變；(6)用HPLC分析，主要由3個組份組成。各峰面積及保留時間分別為36.274％、2.65分，12.548％、3.90分，42.316％、4.56分；(7)經SDS-PDGE分析；顯示兩條主要色帶、分子量別為9600，8860Da；(8)經紫外光譜掃描分析；在波長250.6±2nm和230.5±2nm處有兩個吸收峰。
附
圖1為本發明的NTPS的紫外光譜掃描分析圖譜；附圖2為本發明的NTPS的HPLC的圖譜；實例一可用下述方法表現本發明藥物生物活性，取SD胚胎鼠(16-20)天，無菌分離胎鼠大腦皮層，胰酶分離神經細胞，用DMEM培養基洗滌3次後，用含10％小牛血清的DME/F12培養基接種於Costar 96孔(3596)培養板內，每孔150ul；37℃，5％CO2條件下24小時。用含5％血清的DME/F12培養基(內加阿糖胞苷2×10-5M用於抑制非神經元細胞的生長)換液後，實驗孔分別加入不同稀釋度的NTPS，使最終濃度分別為5，10，20，40ug/ml，對照孔僅加DME/F12培養基，繼續培養68小時，每孔加入5ulMTT(1.5mg/ml)，DME培養基配製)，繼續培養4-6小時，每孔加入二甲基亞碸100ul終止反應，置酶標儀570nm條件下測OD值，測定結果如下。
NTPS對神經元脫氫酶活力的影響n CD值P對照組4 0.15±0.03NTPS組(ug)5 4 0.21±0.03 ＜0.05104 0.23±0.03 ＜0.01204 0.30±0.05 ＜0.01404 0.30±0.01 ＜0.01實例二從幼年動物製備NTPS[Y]與成年動物同等條件下製備的NTPS[A]比較，NTPS[Y]活性較高，活性測定方法參見上例每毫克NTPS[Y]含活性單位為50iu，而每毫克NTPS[A]僅為12.5iu。
下面是本發明的NTPS的HPLC的數據SAMPLEMETHODMeoh∶Water＝10∶90 Flow0.8TYPEAREA PERCENT RUN NUMBER2INDEX1WAVELENTH254nmPEAK# AREA％ RT AREA BC1 2.277 0.87 811092 022 1.325 2.01 471730 023 *36.2742.65 12918549 0814 0.152 3.06 54295 055 0.078 3.31 27592 06 8 0.068 4.33 24220 069 *42.3164.56 15070735 08310 3.227 6.63 11491290511 0.283 7.89 100819 0612 1.452 8.74 517069 07TOTAL 100.00 35614071本發明藥物的藥理作用實現如下三月齡SD大鼠16隻，體重300g，1％戊巴比妥鈉麻醉後固定於腦立體定位儀上，環形鑽開顱，用自製雙刃刀在右側頂皮質切一寬2mm，深2.5mm的冠狀切口，切口坐標是前囪後3mm，旁中線1.5mm。其中8隻經腹腔注射神經營養因子0.5ml(廣州空軍醫院科研室研製)每天一次，對照組注射生理鹽水0.5ml，存活3周後經心臟主動脈插管，生理鹽水和4％多聚甲醛連續灌注、固定。取腦置於25％蔗糖磷酸緩衝液(0.1mol/l)中保存15-20小時。冰凍切片機作連續失狀切片，片厚40um，切片分兩套，一套作尼氏染色，一套按Hedreen薦的方法顯示AChE陽性纖維，具體步驟是(1)0.1mol/L醋酸緩衝液(pH5.8)洗2次；(2)室溫下孵育30分鐘(孵育液含碘化乙醯硫膽礆12.5)；(3)0.1ml/L醋酸衝液(pH5.8)洗5次；(4)1％硫化銨處理1分鐘，醋酸緩衝液洗5次；(5)0.1％硝酸銀染色1分鐘，0.1％mol/L醋酸緩衝液1洗5次。裱片，晾乾常規脫水、透明、封片，在光學顯微鏡下觀察和照相。用標準目鏡方格測試系統(10×10)在40倍物鏡下計數切口嘴側、尾側以及對照鼠相應區域的皮質、IV、V層內AChE陽性纖維的密度。以AChE陽性纖維與測式線的交點數(N)表示纖維的密度(N/10000um2)。每隻動物取切口中1/3的5張切片進行計數。結果發現損傷後三周時對照組切口兩緣基本對合，但不整齊，切口區可見明顯的疤痕組織形成，切口嘴側纖維增多，一些細的纖維向切口區靠近，切口尾側區纖維較嘴側稀少。神經營養因子處理組，損傷後三周時皮質切口已全部對合，較對照組對合整齊。切口區內疤痕組織很少，形成一條窄細的線幾乎不能辨認，嘴側區AChE陽性纖維大量增生，逼進切口區形成一密集的纖維帶，並見少數纖維跨過切口區進入尾側但這些穿過切口的纖維走行迂曲，不能做長距離的跟蹤，尾側區纖維比嘴側區稀少。纖維網格計數結果顯示，神經營養因子注射組無論是切口嘴側還是切口尾側皮質內的AChE陽性纖維的密度均較對照組明顯增多，見下表皮質損傷後三周AChE陽性纖維密度對照組 NTPS組切口嘴側 第IV層 193.04±10.21 217.34±14.37**第V層 174.23±9.48195.06±11.26**切口尾側 第IV層 134.81±9.27178.26±12.74**第V層 127.05±9.43151.34±10.89*表中數據為AChE陽性纖維與測試線交點數(N/10000um2)×±SD，n＝8；* 表示與對照組比較差異有顯著意義；**差異有高度顯著意義。
本發明藥物選取健康幼年哺乳類動物如乳豬、新生小牛及新生羊的腦。
本發明藥物在臨床上可用於治療腦外傷或腦炎後遺症、老年性痴呆、腦血管意外、少兒智力發育不良、神經衰弱以及各種精神、神經疾病的輔助治療。
本發明藥物可在臨床單獨使用，也可與其它中西藥單方或複方合用。
本發明藥物可製成一種保健食品——神腦口服液。
權利要求
1.一種神經系統疾病治療藥--促腦康，神經生長刺激肽(NTPS)是從健康幼年哺乳類動物腦中製備提取，其特徵是(1)、在PH2-10範圍內穩定；(2)、耐熱75-80℃，30min，活性不改變；加熱100℃，15min後活性喪失；(3)、在多種蛋白水解酶，37℃，2小時條件下生物活性喪失；(4)、在DNAse，RNAse，37℃，2小時條件下，生物活性不喪失；(5)、在加入3-8％甘露醇凍幹密封條件下，室溫貯存1年，4℃貯存2年，-20℃貯存3年，生物活性不改變；(6)、用HPLC分析，主要由3個組份組成。各峰面積及保留時間分別為36.274％、2.65分，12.548％、3.90分，42.316％、4.56分；(7)、經SDS-PDGE分析顯示兩條主要色帶，分子量分別為9600，8860Da；(8)、經紫外光譜掃描分析在波長250.6±2nM和230.5±2nM處有兩個吸收峰。
全文摘要
本發明涉及的是一種神經生長刺激肽(NTPs)，它是一種從健康幼年哺乳類動物的腦中提取具有較高生物活性的神經生長刺激肽(NTPs)，分子量小於1萬和/或5萬道爾頓，臨床應用於腦外傷或腦類後遺症及各種精神、神經疾病的治療；可以是口服液和肌肉注射，或與其它藥物配伍靜脈滴入。
文檔編號A61K38/17GK1120456SQ9411632
公開日1996年4月17日 申請日期1994年10月10日 優先權日1994年10月10日
發明者孔祥平 申請人:中國人民解放軍空軍廣州醫院