一種用於抗體清除的血液淨化吸附劑及其製備方法

2023-06-10 20:32:21

專利名稱：：一種用於抗體清除的血液淨化吸附劑及其製備方法
技術領域：
：.本發明涉及生物醫學領域中用於抗體清除的血液淨化吸附劑及其製備方法。
背景技術：
：自身抗體和免疫複合物已被證實與一系列疾病的產生和發展密切相關，如免疫反應(過敏，移植排斥)、自身免疫性疾病(系統性紅斑狼瘡，類風溼等)，甚至於癌症。因此，臨床上需要一種能夠從人血液中選擇性地清除自身抗體和循環免疫複合物的吸附劑，以緩解急性症狀，遏制病情發展進而對疾病起到治療作用。隨著此類疾病尤其是自身免疫性疾病發病率的逐年提高，這種需求也越來越大。基於上述考慮，目前已有多家機構開發出不同性質的吸附劑材料，其中一些已經應用到臨床。應用於血液淨化的吸附劑一般由兩部分組成作為吸附劑基質的高分子載體材料和利用化學交聯固定在載體表面的配基分子，其中配基分子的結構和性質決定了吸附劑的作用效果。目前，臨床中主要採用的兩種用於抗體吸附的血液淨化吸附劑分別以蛋白A和疏水胺基酸作為配基分子。蛋白A是某些金黃色葡萄球菌細胞壁的一種蛋白組分，它對人類和其他哺乳動物的多種免疫球蛋白具有可逆的親和作用，特別是對免疫球蛋白G(IgG)的Fc區具有較強的結合能力。同時，Phillips等人也發現蛋白A對循環免疫複合物(Circulatingimmunecomplexes)也具有較強的特異性相互作用(T.M.Phillips,AnalyticalTechniquesinImmunochemistry;NewYork:MarcelDekker,Inc.,1992,p.75)。目前，蛋白A作為一種典型的生物親和配基已被用於臨床中上述疾病患者體內自身抗體和免疫複合物的清除。Prosorba和Immunosorba(Fresenius,Germany)是兩種目前應用最為廣泛的蛋白A吸附劑，分別以矽膠和瓊脂糖作為載體基質。國內也有同類產品(中國專利99112880.X)。對於這一類採用蛋白A作為配基的吸附劑，其優點在於利用生物分子間天然的親和作用，能夠實現對目標分子的特異性識別，從而達到較高的吸附選擇性。但其缺點在於蛋白A作為具有生物活性的蛋白質分子，需要從金黃色葡萄球菌或基因工程菌中獲得，其生產成本很高。目前Prosorba吸附柱的市場價約為1000歐元，而一對可切換使用的Immunosorba吸附柱市場價約為10000歐元。同時，蛋白質配基在固定化和保存過程中不穩定，易失活；雖然能夠再生，重複使用，但也存在難以在線清洗滅菌的問題和配基分子脫落的隱患。以上這些缺點限制了蛋白A免疫吸附劑在臨床中的使用。NorikoHirata報導了兩種分別採用苯丙氨酸和色氨酸作為吸附基團，固定在載體基質上，用作吸附血液中抗體類組分和免疫複合物的吸附劑材料(NorikoHirata,ToshijiKuriyama,andNaokuniYamawaki，I咖usorbaTRandPH;TherapeuticApheresisandDialysis,2003，7(1):85-90)。中國專利200410021373.3中也涉及一種利用組氨酸作為吸附基團的吸附劑材料。除此以外，亦有採用聚胺基酸作為吸附基團用在此領域的報導(中國專利03130403.6)。在吸附劑的設計合成中採用胺基酸，尤其是疏水性胺基酸作為吸跗基團，以此替代蛋白A，是新一代血液淨化吸附劑的特徵之一。採用人工合成的小分子化合物基團的好處在於產品價格低廉，結構相對穩定。但是，採用什麼樣的化合物分子，以及如何提高小分子吸附基團的作用效果，是這一領域所面臨的新問題。上述固定化小分子的吸附材料普遍存在的缺點在於吸附劑在實際病人血漿中對目標分子吸附容量不高。這是由所選用吸附基團的性質決定的。在NorikoHirata的報導中(NorikoHirata，ToshijiKuriyama,andNaokuniYamawaki，ImmusorbaTRandPH;TherapeuticApheresisandDialysis,2003，7(1):85-90)可以看到，吸附劑基於免疫球蛋白表面廣泛分布的疏水位點和整體的正電性，在不溶性親水載體上固定化有機小分子，利用其表面分布的負電基團和疏水基團兩部分共同作用吸附抗體類分子和免疫複合物。這種吸附劑對人血清白蛋白等主要蛋白沒有明顯的吸附作用，但是問題在於帶電基團弱化了疏水作用強度，使吸附劑與目的蛋白之間的作用力減弱，造成吸附容量不高，約7mgIgG/mL吸附劑，從而單次治療效果不明顯。
發明內容本發明的目的和任務是要克服此領域現有技術所存在的問題(1)蛋白A吸附劑價格高昂，病人購買一支國產吸附柱需要承擔的費用高達3萬元以上，適用範圍有限；(2)以疏水胺基酸作為配基的吸附劑治療效率不高，單柱清除抗體量約2.2g，治療效果不明顯。進而提出一種新型血液淨化的吸附材料，它對血漿中的目標組分具有選擇性的吸附作用，單位體積吸附劑對抗體的吸附容量能達到10mg以上；並具有化學和物理性質穩定，成本相對低廉的優點。特提出本發明一種用於抗體清除的血液淨化吸附劑。本發明採用的技術方案是血液淨化吸附劑是採用交聯多糖作為多孔載體基質，以苯甲酸分子作為固定化配基；通過化學偶聯固定在載體基質上的苯甲酸分子的偶合密度在1.0-2.6mmol/g幹基質；多孔載體基質是球形顆粒，其膠孔透過分子量為150000-5000000。交聯多糖選用瓊脂糖。本發明包括一種用於抗體清除的血液淨化吸附劑的製備方法，該方法包括如下步驟第一步，活化，用羰基二咪唑活化載體基質，反應在丙酮中進行，羰基二咪唑加入量為0.8-1.2g/10mL溼基質，15-30。C反應l-2h，產物用丙酮洗滌;第二步，接臂，選用己二胺作為間隔臂，將其一端偶合到活化位點上，向羰基二咪唑活化的載體基質一丙酮等體積的懸液中添加5-10倍過量的己二胺，20-35'C反應2-3h，然後分別用丙酮和去離子水分多次反覆清洗；第三步，偶聯配基，將苯甲酸共價鍵合到載體表面，反應條件為把苯甲酸加入到體積比為l:3的丙酮/2-(N-嗎啉基)乙磺酸緩衝液的混合體系中，其中2-(N-嗎啉基)乙磺酸緩衝液為0.1M溶解，pH4.5，加入活化接臂後的載體基質，用0.1MNaOH溶液調pH值為4.5-6.5，加入羧合劑1-乙基一3-(3-二甲氨丙基)-碳醯二亞胺，20-35'C反應3-4h，依次用去離子水、0.1MNaOH溶液、去離子水洗滌；第四步，後處理，用pH10-13的NaOH溶液水解剩餘咪唑。本發明吸附劑的多孔載體基質可以是任何合適的材料，在一個實施方案中，載體由交聯多糖材料構成，例如瓊脂糖、瓊脂、纖維素、葡聚糖、殼聚糖等等。本發明吸附劑的載體基質應該具有良好的親水性，基質本身不應對蛋白質產生吸附，同時，應具有良好的血液相容性，不會造成凝血機制激活等不良反應。因此，在本發明載體基質的一個具體的實施方案中，選用了交聯瓊脂糖凝膠。本發明吸附劑的多孔載體基質是球形顆粒，它們需要有足夠的通透性和相對穩定的空間結構，其膠孔的透過分子量最好在150，000到5，000,000。因為材料要吸附的目的分子中IgG的分子量為150,000，而免疫複合物，尤其是IgM免疫複合物分子量則要大得多。本發明吸附劑的苯甲酸分子在多孔載體基質上的偶合密度最好在lmmol/g幹基質到2.6mmol/g幹基質之間，此數據以元素分析檢測結果為準。本發明吸附劑的特點在於利用抗體類分子表面相對平坦，疏水位點小而分散的結構特徵，所以對吸附基團的偶合密度有著特殊的要求，密度過低則作用強度不夠，在中性溶液和生理鹽濃度下吸附材料對血液中的自身抗體和免疫複合物之間很難產生有效的吸附；但另一方面，如果疏水性基團的偶合密度過大，則很容易導致血清白蛋白等其他血漿組分的過量吸附，從而影響吸附選擇性和材料的血液相容性，嚴重的可能會引起機體的免疫反應。同時，親水性吸附劑載體基質過量偶連疏水性化合物，會引起其空間網狀結構的變化，孔隙減小，甚至結構坍塌。在一個具體的實施方案中，苯甲酸偶合密度達到2.1mmol/g幹基質時，材料對人IgG的動態結合容量已經超過30mg/ml溼材料，但對HSA仍沒有明顯吸附作用，隨密度增加結合容量並沒有進一步增長，說明在此體系下吸附已達到飽和，但隨著配基密度的增加，HSA的結合量有增高的趨勢，故以此為依據確定偶合密度的上限。實驗表明配基密度降低時，材料對IgG的結合容量呈下降趨勢，當偶合密度降至lmraol/g幹基質時，材料對IgG的動態結合容量降至17mg/mL，以此作為偶合密度的下限。任何標準固定化方法都可以使用，參見例如ImmobilizedAffinityLigandTechniques,Hermanson等，AcademicPress,INP，1992禾卩BioconjugateTechniques,GregT.HermansonAcademicPress,INP，1996。在本發明吸附劑的一個製備方案中，交聯瓊脂糖被選作載體基質，羰基二咪唑(CDI)用作活化試劑。本領域技術人員會發現當需要高密度活化多糖載體時，CDI活化是一種非常合適的方法，它能夠很容易使活化密度達到3mmol/g幹基質以上，而且反應快速，條件也不苛刻。未完全反應的CDI活化位點需要用水解的方式釋放活性，否則很容易和蛋白質表面的氨基基團反應，造成非特異性的吸附，鹼性條件會加速其活化位點基團的水解，優選pH12的NaOH溶液。己二胺作為雙功能團試劑，反應物不足量會增加發生交聯反應的機率，同時出於節約的考慮，本合成方案中己二胺用量5-10倍摩爾數過量於活性基團數。苯甲酸分子不溶於2-(N-嗎啉基)乙磺酸緩衝液(MES緩衝液)，但能夠溶於丙酮，本合成方案中採用丙酮作為苯甲酸的助溶劑，其用量加至l:3的比例時能夠全部溶解反應體系中的苯甲酸。本發明採用苯甲酸分子作為血液淨化吸附材料的吸附基團，它是一種價格低廉且性質穩定的小分子化合物。在吸附劑的合成設計中迴避了靜電作用，高密度活化親水性多孔載體基質後在其表面偶合上疏水性吸附基團，呈空間網狀結構。因為結構的特點，這種吸附劑對白蛋白幾乎沒有吸附作用，但對免疫球蛋白G的動態結合容量大於17mg/mL吸附劑。同時，對其他血漿組分非特異性吸附有限，而且製備成本低、性能相對穩定，可用作血液淨化裝置的吸附填料用作血漿中自身抗體和免疫複合物的清除，其優點在實施例部分的具體評價結果中將會得到進一步展現。附表說明表l苯甲酸吸附劑對類風溼因子的去除效果本表縱向列出了8種不同的血清樣品，在橫向分別列出了此8種血清樣品在經吸附劑處理前後類風溼因子的濃度，以及在此過程中單位體積吸附劑對類風溼因子的吸附容量和清除率。具體實施方式實施例1取充分沉降(過夜)後體積為10mL的凝膠，用200mL無水丙酮分多次洗滌以除去膠內含水，然後把瓊脂糖凝膠均勻分散在等體積的丙酮中，並保證整個體系無水。稱取0.8gCDI與凝膠懸液混合，將所得混合物於15'C懸槳攪拌1小時。反應結束後，凝膠用200mL無水丙酮分多次清洗。得到帶有咪唑氨基甲酸鹽活性基團的交聯瓊脂糖凝膠，元素分析得到取代度為1.6國ol/g幹膠，lg幹膠折合35mL溼體積。將10mLCDI活化的凝膠均勻分散在等體積的丙酮中，往凝膠體系中按5倍過量添加己二胺，將所得混合物於20'C懸槳攪拌2小時。反應結束後，分別用lOOmL無水丙酮，100mL去離子水分多次洗滌。得到帶有己二胺的交聯瓊脂糖凝膠。稱取0.8g苯甲酸溶解於4mL丙酮中，繼續向此溶液中添加6mLMES緩衝液。將pH4.6lOmLCDI活化後以己二胺接臂的凝膠抽乾成溼餅狀，加入到苯甲酸溶液中，混合均勻後用1MNaOH溶液調節體系pH到4.5，然後稱取lg1-乙基一3-(3-二甲氨丙基)-碳醯二亞胺(EDC)加入混合體系中2(TC懸槳攪拌3小時。過濾反應混合物後，凝膠依次用50mL去離子，50mL0.1MNaOH溶液，50mL去離子水洗滌。將清洗乾淨的凝膠溼餅加入到50mLpH12的NaOH溶液中3(TC搖床中130rmp震蕩過夜。過濾反應混合物後，凝膠依次用50mL去離子，50mLlMNaCl溶液，50mL去離子洗滌。得到以苯甲酸作為吸附基團的交聯瓊脂糖凝膠吸附劑。元素分析其偶合密度為lmmol/g幹膠。實施例2具體步驟同實施例l，區別在於CDI用量增至1.2g/10mL溼膠，活化反應在3(TC進行2小時。活化結束後元素分析測得取代度為3.6mmol/g幹膠。接臂反應時己二胺用量為IO倍過量，接臂反應在35t:進行3小時，偶聯苯甲酸時，反應在pH6.5的緩衝液中，35°C進行4小時。水解剩餘咪唑活化基團時採用pH13的Na0H溶液。其產品經元素分析得偶合密度為2.6mmol/g幹膠。實施例3具體步驟同實施例1，區別在於CDI用量為1.0g/10mL溼膠，活化反應在3(TC進行1小時。活化結束後元素分析測得取代度為3.lmmol/g幹膠。接臂反應時己二胺用量為10倍過量，接臂反應在30'C進行2.5小時，偶聯苯甲酸時，反應在pH6.5的緩衝液中，30°C進行3小時。其產品經元素分析得偶合密度為2.1mmol/g千膠。實施例4具體步驟同實施例3，區別在於CDI用量為0.5g/10mL溼膠，活化結束後元素分析測得取代度為1.l鵬ol/g幹膠。其產品經元素分析得偶合密度為0.75mmol/g幹膠。實施例5具體步驟同實施例3，區別在於水解剩餘咪唑活化基團時採用pH13.5的NaOH溶液。其產品經元素分析得偶合密度為1.5mmol/g幹膠。實施例6:偶合密度為2.6mmol/g幹膠的苯甲酸吸附劑材料對IgG和HSA動態吸附容量的評價為了測試本發明吸附劑材料對人免疫球蛋白的吸附能力，實驗以人免疫球蛋白G(IgG)和人血清白蛋白(HSA)作為模型蛋白，在相同條件下分別檢測了吸附劑材料對這兩種血漿高豐度蛋白的動態結合容量。實驗方法如下用1mL吸附材料填充長徑分別為30mra和6mra的玻璃層析柱，並將層析柱連入配套有恆流蠕動泵和紫外檢測器的色譜系統，紫外檢測器在280nm波長監測信號。用磷酸鹽緩衝液(10mM，pH7.4，0.154MNaCl)平衡層析柱，評價材料動態吸附容量時，IgG和HSA的上樣蛋白濃度均為5mg/mL，50%流穿，流速為1mL/min。收集流穿液，分別檢測蛋白濃度，對照上樣前的蛋白量確定吸附材料分別對兩種蛋白的動態吸附容量。結果顯示，在此評價條件下苯甲酸吸附劑材料對IgG的動態結合容量為31.6mg/mL溼材料，對HSA的動態結合容量為2.12mg/mL溼材料。實施例7:偶合密度為2.1mmol/g幹膠的苯甲酸吸附劑材料對IgG和HSA動態吸附容量的評價具體操作步驟如實施例6，結果顯示此材料對IgG的動態結合容量為30.2mg/mL溼材料，對HSA的動態結合容量為1.13mg/mL溼材料。實施例8:偶合密度為1mmol/g幹膠的苯甲酸吸附劑材料對IgG和HSA動態吸附容量的評價具體操作步驟如實施例6，結果顯示此材料對IgG的動態結合容量為17.25mg/mL溼材料，對HSA的動態結合容量為0.98mg/mL溼材料。實施例9:蛋白A材料對IgG和HSA動態吸附容量的評價具體操作步驟如實施例6，結果顯示，相同條件下蛋白A吸附劑對IgG的動態結合容量為22.4mg/mL溼材料,對HSA的動態結合容量為1.55mg/mL溼材料。實施例10:偶合密度為2.1mmol/g幹膠的苯甲酸吸附劑材料對血漿中抗體類組分及白蛋白的動態吸附評價用1mL吸附材料填充長徑分別為30mm和6mm的玻璃層析柱，並將層析柱連入配套有恆流蠕動泵和紫外檢測器的色譜系統，紫外檢測器在280nm波長監測信號。用磷酸鹽緩衝液(10mM,pH7.4，0.154MNaCl)平衡層析柱，取5mL新鮮人血漿，以1mL/min的流速泵入血漿樣品，流穿後收集未被吸附的血漿蛋白，檢測樣品中主要抗體組分和白蛋白含量變化以確定單位體積吸附材料的作用效果。實驗結果表明，在此模擬血漿循環的評價體系中，1mL溼體積的吸附材料對白蛋白的吸附量為3.62mg;對IgG的吸附量為18.06mg;對IgM的吸附量為2.3mg;對IgA的吸附量為3.98rng，此實驗結果證明了苯甲酸吸附材料在血漿體系中對免疫球蛋白的吸附能力和選擇性，尤其對IgG吸附量可觀。實施例11:偶合密度為1mmol/g幹膠的苯甲酸吸附劑材料對血漿中抗體類組分及白蛋白的動態吸附評價具體操作同實施例IO，結果顯示此材料在血漿中對白蛋白的吸附量為2.5mg;對IgG的吸附量為12.7mg;對IgM的吸附量為2.6mg;對IgA的吸附量為2.2mg。實施例12:偶合密度為2.1mmol/g幹膠的苯甲酸吸附材料對人血液中類風溼因子的清除取8份類風溼因子(RF)超標的人血清樣品，分別以1:5的膠血比往血清樣品中添加偶合密度為2.1mmol/g幹膠的苯甲酸吸附劑，37'C搖床中溫育120分鐘,恆溫搖床轉速為130rpm。8000轉離心10分鐘，取上清液，分析樣品中類風溼因子含量變化。結果如表1所示，苯甲酸吸附材料對血漿中的類風溼因子具有普遍的吸附能力。附表表l苯甲酸吸附劑對類風溼因子的去除效果tableseeoriginaldocumentpage10權利要求1.一種由載體基質和配基組成用於抗體清除的血液淨化材料，其特徵在於血液淨化吸附劑是採用交聯多糖作為多孔載體基質，以苯甲酸分子作為固定化配基；通過化學偶聯固定在載體基質上的苯甲酸分子的偶合密度在1.0-2.6mmol/g幹基質；多孔載體基質是球形顆粒，其膠孔透過分子量為150000-5000000。2.按照權利要求1所述的血液淨化吸附劑，其特徵在於所述的交聯多糖選用瓊脂糖。3.—種按照權利要求1所述血液淨化吸附劑的製備方法，其特徵在於該方法包括如下步驟第一步，活化，用羰基二咪唑活化載體基質，反應在丙酮中進行，羰基二咪唑加入量為0.8-1.2g/10mL溼基質，15-30。C反應l-2h，產物用丙酮洗滌；第二步，接臂，選用己二胺作為間隔臂，將其一端偶合到活化位點上，向羰基二咪唑活化的載體基質一丙酮等體積的懸液中添加5-10倍過量的己二胺，20-35"C反應2-3h，然後分別用丙酮和去離子水分多次反覆清洗；第三步，偶聯配基，將苯甲酸共價鍵合到載體表面，反應條件為把苯甲酸加入到體積比為1:3的丙酮/2-(N-嗎啉基)乙磺酸緩衝液的混合體系中，其中2-(N-嗎啉基)乙磺酸緩衝液為0.1M溶解，pH4.5，加入活化接臂後的載體基質，用0.1MNaOH溶液調pH值為4.5-6.5，加入羧合劑1-乙基一3-(3-二甲氨丙基)-碳醯二亞胺，20-35。C反應3-4h,依次用去離子水、0.1MNa0H溶液、去離子水洗滌；第四步，後處理，用pH10-13的Na0H溶液水解剩餘咪唑。全文摘要本發明涉及生物醫學材料領域中一種用於抗體清除的血液淨化吸附劑及其製備方法。血液淨化吸附劑包括載體基質和配基兩個部分，其中配基通過化學偶聯固定在載體基質上，其特徵在於採用苯甲酸分子作為血液淨化吸附劑的固定化配基。血液淨化吸附劑的製備方法是以瓊脂糖等交聯多糖作為載體基質，經過活化、接臂、偶聯配基、後處理四個步驟製備此吸附劑材料。其優點在於能夠高載量地吸附血漿中的抗體組分，對血清白蛋白等其他血漿組分非特異性吸附有限，而且製備成本低、物理化學性質穩定。此材料可作為血液淨化裝置的吸附填料用於血漿中自身抗體和免疫複合物的清除。文檔編號B01J20/22GK101185880SQ20071001258公開日2008年5月28日申請日期2007年8月22日優先權日2007年8月22日發明者軍任,張丹妮,健謝,賈凌雲申請人:大連理工大學