一種高效對蝦免疫調節劑的製作方法

2023-06-10 14:14:31 1

專利名稱：一種高效對蝦免疫調節劑的製作方法
技術領域：
本發明利用巴菲蛤加工廠下腳料水解降解得到活性寡肽，江蘺菜提取得到活性硫酸酯多 糖，複合製成免疫增強劑。屬於水產養殖業營養添加劑產業。
二. 研究背景及目的
水產養殖事業的快速發展，創造了顯著的社會效益和經濟效益，與此同時，水環境曰趨 惡化的現實，亦為水產養殖中疾病控制帶來了難題。水產養殖水域廣闊，養殖動物水下患病 不易被發現，難以及時施治。因此，業內專家早已提出"防重於治"。如何提高水產動物免疫 抗病能力，是水產養殖業急需解決的問題。
我國飼料添加劑工業發展潛力巨大，飼料添加劑資源的開發與應用對飼料產品質量、飼
料飼養效果起著決定性作用。針對單一添加劑對基礎料匹配的專業性不夠高，複合型添加劑 巳經開始普及使用。免疫調節劑也屬於添加劑範疇。
免疫調節劑是一類非特異性地增強機體免疫功能的藥物，且選擇性不高，往往一種藥物 具有多種功能，也可以屬於伺料添加劑範圍。
1、活性肽
現代營養學研究發現動物攝食蛋白質經消化道的酶作用後，大多是以低肽形式消化吸 收的，以游離胺基酸形式吸收的比例很小。進一步的試驗又揭示了肽比游離胺基酸消化更快、 吸收更多，表明肽的生物效價和營養價值比游離胺基酸更高。這也正是活性肽的無窮魅力所 在。生物活性肽是蛋白質中20個天然胺基酸以不同組成和排列方式構成的從二肽到複雜的線 性、環形結構的不同肽類的總稱，是源於蛋白質的多功能化合物。
活性肽具有多種體內代謝和生理調節功能，易消化吸收，有促進免疫、激素調節、抗菌、 抗病毒、降血壓、降血脂等作用，食用安全性極高，是當前國際食品界最熱門的研究課題和 極具發展前景的功能因子。
巴菲蛤濃縮液汁
該濃縮液為廣西某巴菲哈加工廠下腳料濃縮而成，它含有豐富蛋白質、複合胺基酸及活 性多肽等營養物質，能為對蝦等水產動物提供豐富營養物質，主要包括最重要的必需氮基酸(賴氨酸、穀氨酸)，其中穀氨酸、核苷酸和肽類物質可做為鮮味劑，而甘氨酸、L-精氨酸、 L一丙氨酸等複合胺基酸作為飼料風味劑，引誘對蝦進食，提高食慾和促進生長，提高對蝦產 量，同時提高對蝦免疫能力，減少對蝦病產生，節約成本。 2、免疫活性多糖
多糖是一類重要的天然活性物質，具有廣譜的非特異性免疫促進作用，能夠明顯增強機 體的細胞免疫和體液免疫功能。
江籬(Gmcilaria)是大型底棲海藻，屬紅藻門(Rhodophyta).自古以"龍鬚菜"、"鹿角菜"、"鳳 尾菜"等名稱入藥，古代藥著描述該藥生於東南海邊石上，味甘性寒，有軟堅化痰、清熱利水 的功效。江蘺菜不僅是一種天然補碘飼料添加劑，而且含有多種胺基酸、維生素、礦物質、 還含有大量的非含氮具有生物活性的有機化合物(海藻多糖等)以及刺激動物生長的活性物 質。同時又是工業生成瓊脂的原料。
江蘺菜是紅藻中一類巨型的經濟藻，產量巨大，目前基本上都是作為飼料或食品使用， 沒有深加工產品，附加值低。本發明利用的海洋藻類原料來源廣泛，又兼為藥食兩用品種， 安全性好，生產工藝簡便高效。
其中硫瓊脂長期以來被看作是提取瓊膠糖的廢棄物。隨著對海藻硫酸多糖生物學功能的 深入研究，發現江蘺屬硫酸酯多糖在體內外均具有抗凝血作用、抗病毒、抗腫瘤等生理活性。 多糖具有多方面的生物活性，諸如抗病毒、抗腫瘤與免疫調節等；而且對機體正常細胞沒有 毒副作用，可能成為理想的藥物來源。利用江蘺菜硫酸酯多糖的免疫調節功能，可應用於水 產養殖中，提高對蝦免疫能力，減少對蝦病產生，節約成本。
本發明的主要目的是充分利用巴菲蛤濃縮液汁和江蘺菜硫酸酯多糖的活性成分複合製備 成一種具有促進對蝦生長發育，減少對蝦病產生的免疫增強劑。

發明內容
本發明技術要點充分利用巴菲蛤加工廠下腳料，通過酸水解，嚴格控制水解程度，保
持水解程度為30-40%，降解成平均肽鏈長度為3左右的具有免疫調節作用的小肽；通過工藝 優化製備江蘺菜硫酸酯多糖。
高效對蝦免疫調節劑，按重量百分比由以下組分組成巴菲蛤水解胺基酸及活性寡肽 70-80%
江蘺菜硫酸酯多糖 4-5% 複合維生素 3-4% 增氧劑 3-4% 褐藻酸鈉 適量 防腐劑 適量
具體步驟
1、巴菲蛤水解胺基酸及活性寡肽製備
(1) 工藝流程巴菲蛤濃縮膏一一鹽酸水解一一趕酸一一鹼中和一一透析除鹽一一脫苦 ——濃縮成膏
(2) 蛋白質水解度測定茚三酮比色法，水解度的計算公式為
A N
DH = _ x廳o
TN
式中DH為水解度；A N為酶解物中的氨基態氮含量；TN為樣品的總氮量。
(3) 胺基酸種類即含量測定胺基酸直接分析法(DIONEX ICS-2500離子色譜儀)
表l.巴菲蛤下腳料濃縮汁乾粉中胺基酸種類及含量
胺基酸含量(ug/g)胺基酸含量(ug/g)
精氨酸5.45組氨酸3.37
賴氨酸5.66纈氨酸6.06
丙氨酸7.61異亮氨酸6.40
蘇氨酸5.28亮氨酸17.71
甘氨酸13.84蛋氨酸1.95
穀氨酸29.04酪氨酸1.51
天冬氨酸11,81苯基丙氨酸0.93
(4)平均肽鏈長度-1/DH 通過研究酸度，水解時間，物料比，水解溫度四個因素對酸水解混合蛋白質程度的影響， 確定因素因素水平表，通過1^34正交實驗確定最佳水解工藝，控制水解程度為34%—40%， 平均多肽長度為3左右。2、 通過酸水超聲波提取分離得到江蘺菜硫酸酯多糖。
(1) 工藝流程江蘺菜一一乙醚/無水乙醇脫色脫脂一一酸水熱提取一一離心分離一一 減壓濃縮一一乙醇沉澱一一丙酮、乙醚、無水乙醇洗滌一一真空乾燥一一粉碎成乾粉
(2) 多糖含量的測定(苯酚一硫酸法)
(3) 硫酸基的Dodgson法定量測定
稱取江蘺菜，在功率500W超聲波作用下分別以不同濃度的HC1、提取時間、物料比和提取 溫度進行單因素試驗。為了確定超聲酸提的最佳工藝條件，根據單因素實驗結果，設計U34 正交實驗。
3、 按照中國對蝦對維生素的需求量添加各維生素在lkg混合膏中添加，LAPP (維生素C 多聚磷酸酯)4g，肌醇4g，膽鹼4g， Va1萬IU， Vd 5000IU, VE 350mg， VB5 40mg， VB3 100mg， VB11 10mg
4、 加入其他輔料，直接研磨添加充分混合製成瓶裝產品，低溫保存。 實施案例一
1、 巴菲蛤水解胺基酸及活性寡肽製備
通過研究酸度2-6mol/L，水解時間l-5小時，物料比l: 5-8，水解溫度50-90'C四個因素對 酸水解混合蛋白質程度的影響，確定因素因素水平表，通過1^934正交實驗得出結論對水解 度影響順序是時間>溫度>酸度>物料比。其最佳工藝製備:水解酸度(鹽酸)濃度為4-5mol/L, 時間為4-5小時，，溫度為70-80。C，最終把水解度控制在30-40%，即平均肽鏈長度約等於3。按 照最佳工藝條件製備巴菲蛤胺基酸活性寡肽濃縮膏1000-1200克，水解、趕酸、鹼中和、透析 除鹽、活性炭脫苦，最後減壓濃縮成與原料相當總量的灰黃色膏狀物。
2、 通過超聲波酸法從江蘺菜提取硫酸酯多糖，由單因素試驗，考察了酸濃度、時間、物 料比及溫度對硫酸酯多糖提取率的影響，確定正交試驗方案，得出最佳工藝條件為酸度(鹽 酸)為0.01-0.02mol/L，超聲波提取時間為20-25min，溫度為60-7(TC，乙醇分級沉澱值得多糖 含量為20-21.70%，硫酸根含量為10-10.23%的江蘺菜硫酸酯多糖。按照最佳工藝條件，取500g 脫脂江籬菜粉，在功率500W的超聲波提取器中酸水熱提取，離心分離，減壓濃縮加入乙醇濃 度達到60-70%沉澱，丙酮、乙醚、無水乙醇洗滌，真空乾燥，粉碎得到灰褐色的江蘺硫酸酯多糖約為45g。江蘺硫酸酯多糖是一類含有硫酸基團的非還原性糖，無澱粉和非多酚類物質的 雜多糖。
3、 按照中國對蝦對維生素的需求量添加各維生素取LAPP (維生素C多聚磷酸酯)4g， 肌醇4g，膽鹼4g， Va1萬IU， Vd 5000IU， VE 350mg， VB5 40mg， VB3 100mg， VB11 10mg等混 合，再少量的褐藻酸鈉和防腐劑混合研磨。
4、 將實施案例2和3製備的混合料分別加入到巴菲蛤水解後的膏狀物，充分攪拌均勻，裝 如500ml的塑膠瓶中，成品。
實施案例二
選擇健康、大小均勻的中國對蝦3.5-4.5g，設5個試驗組和2個對照組，每組放蝦20尾，分 養於100cmx50cmx60cm的水族箱內，試驗組分別投餵含有l %本發明免疫增強劑，對照組投 餵基礎飼料。試驗期控制水溫在25-28'C， 24h充氣，每天吸汙換水一次。飼養15天後進行有 關免疫指標的測定。
1、免疫調節劑對對蝦免疫功能的影響 (1)血細胞的吞噬作用
每組取奸20尾，用lml無菌注射器吸取抗凝劑0.2ml，插入對4下圍心臟取血0.2ml，加入氯 化鈉溶液製成抗凝血，參照陳昌福(1995)等方法改進檢測。結果見表2。
表2.免疫增強劑對中國對蝦血細胞吞噬活力的影響
組別對蟲下/尾細胞個數/個吞噬百分比％
試驗組20100x2072.34 ±3.20
對照組20100x2052.68±3.12
(2)血清酚氧化酶活力測定 每組取蝦20尾，用lml無菌注射器自對蝦圍心臟取血0.2ml，置於lml指管中，離心，取上 層血清，參照Ashida的方法進行檢測，結果如表3。
表3.免疫增強劑對中國對蝦溶菌酶活力和酚氧化酶活力的影響
組別溶菌酶活力酚氧化酶活力
試驗組0.212±0.126.58±0.23
對照組0.183±0.154.21±0.33
7(3)攻毒試驗
在投餵餌料15d後進行。嗜水氣單胞菌的攻毒濃度為6xl05個/mL,在沼蝦的第2-3腹節進行 肌肉注射(0.02mL/尾),攻毒後,將蝦分別充氣養於桶中，隨時觀察並記錄結果。保護率計算公 式:(對照組死亡率-試驗組死亡率)/對照組死亡率><100%。結果見表4。
表4.免疫增強劑對中國對蝦免疫保護作用的影響
組別對蟲下/尾死亡/尾死亡率/%保護率/%
試驗組2021086.67
對照組201575
本發明製得的免疫增強劑能激活中國對蝦機體的非特異免疫系統，有效地增強免疫抵抗 能力,達到防禦病害入侵的目的。
2、免疫調節劑對中國對蝦生長發育的影響
選用體長為12-14mm的蝦苗，從第一天開始分別餵養有l %本發明免疫增強劑和普通飼 料，15天後測量奸苗體長，結果見表5。
表5.免疫增強劑對中國對蝦幼苗生長發育的影響
開始前對蝦體長/mm第15天後對奸體長/mm生長速度mm/天
試驗組12±1.0024.3±1.020.82
對照組12±1.0018.75±1.230.45
本發明製得的免疫增強劑能促進幼蝦的生長發育。
3、免疫調節劑對對蝦水質的影響
表6.免疫增強劑對中國對蟲下臥池水質的影響
溶氧量mg/LPH透明度cm氨態氮mg/L
試驗組8.788.1026.000.12
對照組6.457.9024.500.08
本發明製得的免疫增強劑還能改善奸塘的水質
權利要求
1、高效對蝦免疫調節劑，按重量百分比由以下組分組成巴菲蛤水解胺基酸及活性寡肽70-80％江蘺菜硫酸酯多糖 4-6％複合維生素4-6％增氧劑3-5％褐藻酸鈉 適量防腐劑適量
2、 根據專利要求書l所述的處方設計，其特徵在於巴菲蛤水解胺基酸及活性寡肽按照以 下最佳工藝製備水解酸度(鹽酸)濃度為4-5mol/L，時間為4-5小時，溫度為70-8(TC,最終把水 解度控制在30-40%，即平均肽鏈長度約等於3.
3、 根據專利要求書l所述的處方設計，其特徵在於江蘺菜硫酸酯多糖按照以下最佳工藝 製備酸度(鹽酸)為0.01-0.02mol/L，超聲波提取時間為20-25min，溫度為60-7(TC，乙醇 分級沉澱值得多糖含量為20-21. 70%，硫酸根含量為10-10. 23%的江蘺菜硫酸酯多糖。
4、 根據專利要求書l所述的處方設計，其特徵在於利用具有營養成分和免疫調節作用 的巴非蛤複合胺基酸及寡肽，具有活性的江蘺菜硫酸酯多糖配製而成的粘稠狀膏狀物。
5、 根據專利要求書l所述的處方設計，其特徵在於本發明製成的是一種飼料風味劑， 能引誘對蝦進食，提高食慾和促進生長，提高對蝦產量，同時提高對蟲下免疫能力，減少對蟲下 病產生，節約成本。
全文摘要
本發明充分利用巴菲蛤加工廠下腳料，通過正交實驗確定明顯影響因素，控制水解程度為34％-40％，平均多肽長度為3左右；通過超聲波法優化提取得到活性江蘺菜硫酸酯多糖，並根據處方設計原理添加複合維生素和其他輔料，製成一種複合胺基酸作為飼料風味劑、活性寡肽和多糖複合免疫調節劑，引誘魚蝦進食，提高食慾和促進生長，提高魚蝦產量，同時提高魚蝦免疫能力，減少魚(蝦)病產生，節約成本，且能直接攪混添加於飼料中，方便投料。
文檔編號A23K1/16GK101664107SQ20081019829
公開日2010年3月10日 申請日期2008年9月4日 優先權日2008年9月4日
發明者宋文東, 活 李, 林海生, 浩 王, 紀麗麗, 董曉慧, 顏建斌, 馬德運, 黃翔鵠 申請人:黃翔鵠