Rbp4抗體及其製法及用途的製作方法
2023-06-10 21:04:11
專利名稱：Rbp4抗體及其製法及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種利用原核蛋白表達系統製備的視黃醇 結合蛋白，其抗體及抗體的用途。
背景技術：
視黃醇結合蛋白(Retinol Binding Proteins, RBPs)是一類在人體內負責 從肝臟轉運視黃醇至各靶細胞的運載蛋白，對視黃醇生理功能的發揮起著重要 作用。目前已發現七種不同的RBP亞型，主要分布於血液循環系統(RBP4，簡 稱RBP)、細胞(RBP1， RBP2， RBP5， RBP6， RBP7，簡稱CRBPs)和視網膜光感受 器間(RBP3，簡稱IRBP)。 1968年Kanai等首次從人體中分離發現RBP，隨後在 小鼠、大鼠及豬等動物中亦發現人RBP的同源蛋白。至今，RBP的蛋白序列、 蛋白晶體結構和生理學功能已得到充分的研究。在RBP各亞型中，RBP4的應用 性尤為顯著。
RBP4(讓一006744)的蛋白大小為21kDa，含184個胺基酸殘基和3個二硫鍵， 與全反式視黃醇結合，是a-球蛋白的一種[郭曉紅，儲明星，周忠孝，視黃醇 結合蛋白及其基因的分子生物學，遺傳，26(2)， 257-262， 2004]。 RBP4主要 在肝臟中合成。除了肝臟，腎臟、大腦、胰腺和心臟等器官也能合成RBP4。不 論其最終被轉化成視黃酸、視黃醛還是維生素A，視黃醇均以全反式視黃醇的 形式與RBP4結合，且只有視黃醇才能觸發RBP4的分泌[Helen M. Naylor and Marcia E. Newcomer, The structure of human retinol-binding protein with its carrier protein transthyretin reveals an interaction with the carboxy terminus of RBP， Biochemistry, 38， 2647-2653， 1999]。
肝臟分泌的RBP4-視黃醇與Transthyretin(TTR)形成穩定的蛋白複合物在 血液系統中循環。RBP-視黃醇-TTR複合體的形成有助於防止小分子量的RBP4 在腎臟中的損失，同時還可能降低RBP4在血液循環中對胞間組織的滲入 [Marcia E. Newcomer and David E. Ong， Plasma retinol binding protein:
structure and fucntion of the prototypic lipocalin， Biochimica et BiophysicaActa， 1482, 57-64， 2000]。 RBP4-視黃醇-TTR複合體進入血液系 統之後，隨著血流進入身體各組織，與靶細胞細胞膜上的RBP受體結合。此時， 該複合體攜帶的視黃醇被釋放，並轉運到細胞內與CRBP結合，隨後在輔酶II 介導的脫氫酶和細胞視黃醛脫氫酶的作用下轉變為視黃酸，從而調控多種基因 的表達。RBP4-視黃醇-TTR複合體在視黃醇釋放後解體，RBP4以游離的形式存 在於血液系統中，游離的RBP4在腎近曲小管被重新吸收和分解。研究表明， 人體液中RBP4的含量與一些疾病關係密切。當腎小管損傷時，尿液中RBP4含 量會有不同程度的上調。在肝臟疾病(如慢性活動性肝炎)患者中，由於肝臟蛋 白合成功能受損，與正常人(46.2士1.0iig/ml)相比，患者體內的RBP4濃度降 低了 55y。左右(21.2士46ug/ml)[楊順江，視黃醇結合蛋白的測定及其臨床意 義，國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊，11(5)， 16-19， 1990]。
目前RBP4的抗體均由天然純化的蛋白免疫動物獲得。人體中RBP4含量甚微 (正常人血液及尿液中含量分別為40-50mg/L和0. 1-0. 2mg/24小時尿，腎小管病 人尿液中含量一般大於lmg/24小時尿)，此外RBP4的純化繁瑣、得率較低(1L血 清僅純化得到12mg RBP4，僅佔RBP4總含量的30y。)、成本較高[金宏，高蘭興， 王宗印，許志勤，視黃醇結合蛋白的分離純化及其抗血清的製備，生物化學與 生物物理進展，20(6)， 1993]。因此獲得天然純化的RBP4較為困難。
原核蛋白表達系統具備外源基因的高通量表達、易於擴大再生產、低成本、 菌體繁殖迅速、無轉錄後修飾和表達蛋白可被標記等優點[Niraj H Tolia & Leemor Joshua-Tor， Strategies for protein coexpression in Escherichia coli， Nature Methods, 55-64, Vol. 3 No. 1， Jan, 2006]。然而，目前現有技術 中根據天然蛋白、利用原核表達系統製備的重組蛋白常常存在與天然蛋白不同 的一些特點，造成用其製備的抗體難以檢測出天然蛋白，或者檢測效果不理想, 無法達到臨床的靈敏性要求。
發明內容
本發明的目的在於提供一種高效表達和純化視黃醇結合蛋白的方法。 本發明的目的還在於提供抗視黃醇結合蛋白的抗體。
在本發明的第一方面，提供一種製備視黃醇結合蛋白的方法，所述方法包
括以下步驟
(a) PCR擴增獲得視黃醇結合蛋白的編碼序列；
(b) 將(a)所述的視黃醇結合蛋白的編碼序列插入表達載體的多克隆位點
中，獲得揷入了視黃醇結合蛋白編碼序列的表達載體；
(c) 使(b)獲得的插入了視黃醇結合蛋白編碼序列的表達載體轉入宿主細
胞，獲得轉化的宿主細胞；
(d) 培養轉化的宿主細胞，從而表達出視黃醇結合蛋白；
(e) 分離獲得視黃醇結合蛋白。
在本發明的另一優選例中，所述的表達載體為pET28a載體。 在本發明的另一優選例中，所述的宿主細胞為BL21表達型大腸桿菌。 在本發明的另一優選例中，在步驟(d)中，還包括用0.5士0.2mM IPTG誘 導表達。更優選的，用O. 5mM IPTG誘導表達。
在本發明的第二方面，提供一種通過所述的方法製備的視黃醇結合蛋白。
在本發明的第三方面，提供一種多克隆抗體，所述的多克隆抗體特異性地抗 所述的視黃醇結合蛋白。
在本發明的另一優選例中，所述的多克隆抗體是如下製備的用所述的視黃
醇結合蛋白免疫動物，從動物體內分離多克隆抗體。
更優選的，所述的多克隆抗體如下製備用所述的視黃醇結合蛋白免疫兔子， 免疫量0. 5士0.2mg(更優選的，免疫量為0. 5mg)每隻每次，每隔至少2周(更 優選的，每隔3周)免疫1次，至少免疫2次(優選的為免疫3次)，從兔血清 中分離多克隆抗體。採用該步驟獲得的多克隆抗體不僅穩定，而且具有特別良 好的結合體內天然視黃醇結合蛋白的效果。
在本發明的另一優選例中，所述的多克隆抗體與標記偶聯，所述的標記選自 辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、或生物素。
在本發明的第四方面，提供一種單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由雜交 瘤細胞系S-18-16產生的。
在本發明的第五方面，提供一種試劑盒，其中含有所述的抗體。
在本發明的另一優選例中，所述的試劑盒中還含有標記或顯色劑。
本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而 易見的。
圖1顯示了 pET28a-RBP誘導純化。各泳道樣品依次為
1.低分子量蛋白marker, 2. pET28a-RBP誘導前菌體，3. pET28a-RBP IPTG(0.5mM)誘導後菌體，4.誘導後菌體超聲破碎細胞上清，5.誘導後菌體超 聲破碎細胞沉澱，6.純化的重組蛋白，7.僅轉化pET28a的BL21菌體誘導前對 照，8.僅轉化pET28a的BL21菌體IPTG(O. 5mM)誘導後對照。
圖2顯示了兔抗血清免疫印跡檢測結果。
圖3顯示了鼠單抗免疫印跡檢測結果。
圖4兔抗血清ELISA檢測結果。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛的研究，發現採用基因工程手段，將編碼視黃醇結合蛋 白(RBP4)的基因導入到適當的原核表達系統中，可製備出一種在活性上與天然 的視黃醇結合蛋白(RBP4)非常接近的重組視黃醇結合蛋白，用該蛋白免疫動物 可獲得靈敏地識別人體中天然的視黃醇結合蛋白的抗體，從而用於對相關疾病 的診斷或檢測。
表達視黃醇結合蛋白的方法
技術領域：
本發明提供了一種表達視黃醇結合蛋白的方法，所述方法包括
(a) PCR擴增獲得視黃醇結合蛋白的編碼序列；
(b) 將(a)所述的視黃醇結合蛋白的編碼序列插入表達載體的多克隆位點 中，獲得插入了視黃醇結合蛋白編碼序列的表達載體；
(c) 使(b)獲得的插入了視黃醇結合蛋白編碼序列的表達載體轉入宿主細 胞，獲得轉化的宿主細胞；
(d) 培養轉化的宿主細胞，從而表達出視黃醇結合蛋白；
(e) 分離獲得視黃醇結合蛋白。在另一優選例中，在步驟(a)和(b)之間，還包括步驟對擴增獲得的視黃 醇結合蛋白的編碼序列進行測序鑑定。
作為本發明的一種優選方式，所述的表達載體為pET28a載體(購自 Novagen公司)，其中自帶有His標籤。
將表達載體引入到基因工程化的宿主細胞中，即可表達所述的蛋白。在本 發明的優選方式中，採用的宿主細胞為大腸桿菌BL21。
視黃醇結合蛋白的純化
可採用許多蛋白純化技術來純化上述表達的視黃醇結合蛋白。包括(但不 限於)親和層析、分子篩、柱層析、或細胞超聲。
在本發明的優選方式中，為了便於蛋白純化，將所述的視黃醇結合蛋白的 編碼基因克隆於攜帶His標籤的表達載體中，在表達後，所述的視黃醇結合蛋
白攜帶His標籤，因此可通過親和層析的方法來純化所述的嗜視黃醇結合蛋白。
在更優選的方式中，將得到的蛋白初提物用分子篩進行進一步的純化，獲得所 需的純化的蛋白。
抗視黃醇結合蛋白多克隆抗體的獲得
通過將所述的視黃醇結合蛋白導入動物中來獲得，優選地將視黃醇結合蛋
白與弗氏佐劑按照適當比例(如l:l)混合後免疫動物。免疫方法可使用兔皮下 注射。兔免疫1.5-4個月(更優選的，為2個月左右)後，可從兔靜脈血中收穫 抗血清並純化，獲得抗視黃醇結合蛋白多克隆抗體。
抗視黃醇結合蛋白單克隆抗體的獲得
抗視黃醇結合蛋白單克隆抗體利用雜交瘤技術獲得。
首先準備小鼠的脾臟細胞用所述的視黃醇結合蛋白免疫小鼠，免疫1. 5-4 個月(更優選的，為2個月左右)後，取小鼠的脾臟細胞。優選的，在融合前2-5 天做回憶刺激後再進行融合。
可採用常規的聚乙二醇(PEG)細胞融合方法進行細胞融合。
抗體的鑑定和分析 可使用正常人和腎小管疾病病人(其中含有天然的視黃醇結合蛋白)的尿 液進行免疫試驗，來分析抗體對於天然的視黃醇結合蛋白的特異性和敏感性。 用免疫印跡檢測方法或ELISA檢測。
本發明的主要優點在於
(1) 首次採用原核表達系統，高效地表達了視黃醇結合蛋白，所述的蛋白 與天然的視黃醇結合蛋白(RBP4)非常接近，用該蛋白免疫動物可獲得可靈敏地 識別人體中天然的視黃醇結合蛋白的抗體。
(2) 首次採用原核表達的重組視黃醇結合蛋白獲得了可識別和結合天然視 黃醇結合蛋白的兔抗血清和鼠單抗。
(3) 以往，原料來源、純化效率、純化成本等因素直接限制了天然視黃醇 結合蛋白的純化。採用本發明的方法克服了上述的限制。而原核蛋白表達系統 具備外源基因的高通量表達、易於擴大再生產、低成本、菌體繁殖迅速、無轉 錄後修飾和表達蛋白可被標記等優點。
(4) 本發明所製備的RBP4兔抗血清能有效的用於病人尿液中RBP4的檢測， 填補了以往在RBP4抗血清製備上的空白。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說 明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方 法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造 廠商所建議的條件。
實施例l:原核蛋白表達
本發明人抽提了人肝臟組織的mRNA，以GGCGGATTCCTGGGCAAGAT (SEQIDNO: l)為正向引物，以GATGGGGAGAGAAGGGCAAA (SEQ ID NO: 2)為反向引物，並通 過RT-PCR獲得RBP4基因。克隆出的基因經測序驗證不含有義突變。通過兩端 添加BamH I和Xho I酶切位點的引物(以CGCGGATCCATGAAGTGGGTGTGGGCGCTCTT (SEQ ID NO: 3)為正向引物，以CCGCTCGAGGCTACAAAAGGTTTCTTTCTGATC (SEQ ID NO: 4)為反向引物)，本發明人將克隆的基因連接到pET28a載體的BamH I和
Xho I位點中，獲得pET28a-RBP4重組質粒。
之後，將該重組質粒轉化到BL21表達型大腸桿菌中，在O. 5mM IPTG條件 下誘導，表達的蛋白主要存在於包涵體中。表達在包涵體中的RBP4蛋白通過 載體自帶的His標籤純化(純化介質為Araersham公司的Ni S印harose High Performance)。純化的蛋白溶於8M尿素溶液中(pH 8. 0)，濃度2mg/ml，共10ml ， 20mg。
結果見圖l。各泳道樣品依次為l.低分子量蛋白marker, 2. pET28a-RBP 誘導前菌體，3.pET28a-RBP IPTG(0. 5mM)誘導後菌體，4.誘導後菌體超聲破碎 細胞上清，5.誘導後菌體超聲破碎細胞沉澱，6.純化的重組蛋白，7.僅轉化 pET28a的BL21菌體誘導前對照，8.僅轉化pET28a的BL21菌體IPTG(0. 5mM) 誘導後對照。
實施例2:動物免疫
用實施例1中純化的RBP4免疫小鼠。Balb/c小鼠免疫劑量0. lmg每隻 每次。肌肉多點注射。免疫程序0， 3， 6周三次免疫。融合前三天取0. lmg 蛋白腹腔注射，做回憶刺激。
用實施例1中純化的RBP4免疫兔子。大耳兔免疫劑量0.5mg每隻每次。 肌肉多點注射。免疫程序0， 3， 6周三次免疫。效價測評後取血。
實施例3:雜交瘤細胞株的構建及單克隆抗體的製備
回憶刺激後三天做融合。取免疫後小鼠的脾臟細胞和鼠骨髓瘤細胞SP2/0 採用聚乙二醇(PEG)常規融合法做融合。
融合後加HAT選擇性培養基，篩選採用ELISA法，所用篩選用抗原為實施 例1中純化的RBP4蛋白。
經過三次有限稀釋法克隆化篩選得到一株單克隆抗體，命名為S-18-16。
實施例4:尿液中RBP4蛋白的免疫印跡檢測
正常人尿液共四例N1， N2， N3， N4;腎小管疾病病人尿液共五例Pl， P2， P3， P4， P5。用本發明人製備的RBP4兔抗血清和鼠單抗對其進行免疫印跡檢
免疫印跡實驗
在本實施例中，所用抗體為RBP4兔抗血清(Protein G純化)和鼠單抗(細 胞培養上清)。
實驗流程如下
1. SDS-PAGE:
樣品正常人尿液Nl， N2， N3， N4;腎小管疾病病人尿液Pl， P2， P3， P4， P5。
上樣量5ul
上層膠3.5%,下層膠12%，上層膠100V30分鐘，下層膠150V1小時。
2. 轉膜
電流200mA， 90分鐘
3. 封閉
5%脫脂奶粉封閉2小時(兔抗血清)，3%BSA封閉2小時(鼠單抗)。
4. 雜交
一抗均1:1000稀釋在相應的封閉液中，4"C雜交過夜。 二抗羊抗兔冊P(購自Santa Cruze公司)，l:5000稀釋；羊抗鼠HRP(購 自Sigma公司)，1:1000稀釋。均雜交1小時。
5. 顯色
實驗結果見圖2和圖3。結果表明，本發明人所製備的兔抗血清和鼠單抗 均能有效的識別腎小管疾病病人尿液中的RBP4，而對正常人尿液中的痕量RBP4 沒有反應(免疫印跡法一般僅能檢測lng以上的目的蛋白，而實驗時每個泳道 本發明人僅加了 5ul尿液，按照正常人尿液的RBP4水平，其中所含的RBP4不 足lng)。
實施例5:尿液中RBP4蛋白的ELISA檢測
正常人尿液共四例N1， N2， N3， N4;腎小管疾病病人尿液共四例Pl， P2， P3， P4。用本發明人製備的RBP4兔抗血清(ProteinG純化)對其進行ELISA檢
ELISA實驗 1.包被
各尿液樣本l:25稀釋於包被液中。
陰性對照BSA， 10ug/ml;陽性對照實例1中純化的RBP4， 10ug/ml。 每孔加50ul， 4。C包被過夜。
2. 封閉 封閉液5% BSA
每孔加100ul， 37°C2小時。
3. 雜交
一抗RBP4兔抗血清1:1000稀釋於封閉液中，每孔加50ul， 37°C2小時。 二抗羊抗兔服P(購自Santa Cruze公司)，1:5000稀釋於封閉液中，每 孔加50ul， 37°C1小時。
4. 顯色。
結果見圖4。實驗結果表明，本發明人製備的兔抗血清能非常有效的識別 腎小管病人尿液中的RBP4蛋白。
實施例6含有抗視黃醇結合蛋白抗體的試劑盒
所述的試劑盒中含有前述製備的抗視黃醇結合蛋白抗體。
此外，所述的試劑盒中還含有羊抗兔HRP或羊抗鼠服P。
此外，所述的試劑盒中還含有相應於羊抗兔HRP或羊抗鼠HRP的顯色劑。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後， 本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申 請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表
中國科學院上海生命科學研究院
RBP4抗體及其製法及用途
065776
4
Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211〉 20
DNA 人工序列
<220〉
raise—feature
<223〉 引物
1
ggcggattcc tgggcaagat 20
<210〉 2
<211〉 20
DNA
人工序列
〈220>
<221〉 misc—feature
引物
2
gatggggaga gaagggcaaa 20
3
〈211〉 32
DNA
<213〉 人工序列
<221〉 raise—feature
引物
3
cgcggatcca tgaagtgggt gtgggcgctc tt 32
4
33
DNA
〈213> 人工序列
<221〉 misc一feature 引物
4
ccgctcgagg ctacaaaagg tttctttctg atc 3權利要求
1.一種製備視黃醇結合蛋白的方法，其特徵在於，包括以下步驟(a)PCR擴增獲得視黃醇結合蛋白的編碼序列；(b)將(a)所述的視黃醇結合蛋白的編碼序列插入表達載體的多克隆位點中，獲得插入了視黃醇結合蛋白編碼序列的表達載體；(c)使(b)獲得的插入了視黃醇結合蛋白編碼序列的表達載體轉入宿主細胞，獲得轉化的宿主細胞；(d)培養轉化的宿主細胞，從而表達出視黃醇結合蛋白；(e)分離獲得視黃醇結合蛋白。
2. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述的表達載體為pET28a載體。
3. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述的宿主細胞為BL21表達型 大腸桿菌。
4. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在步驟(d)中，還包括用O. 5 ±0. 2mM IPTG誘導表達。
5. —種通過權利要求l所述的方法製備的視黃醇結合蛋白。
6. —種多克隆抗體，其特徵在於，所述的多克隆抗體特異性地抗權利要求5 所述的視黃醇結合蛋白。
7. 如權利要求6所述的多克隆抗體，其特徵在於，所述的多克隆抗體與標 記偶聯，所述的標記選自-辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、或生物素。
8. —種單克隆抗體，其特徵在於，所述的單克隆抗體是由雜交瘤細胞系 S-18-16產生的。
9. 一種試劑盒，其特徵在於，含有權利要求6-8任一所述的抗體。
10. 如權利要求9所述的試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒中還含有 標記或顯色劑。
全文摘要
本發明公開了一種製備視黃醇結合蛋白的方法，本發明還公開了用所述方法獲得的視黃醇結合蛋白，以及特異性抗本發明的視黃醇結合蛋白以及天然視黃醇結合蛋白的抗體。本發明首次高效地表達了視黃醇結合蛋白，所述的蛋白與天然的視黃醇結合蛋白(RBP4)非常接近，用該蛋白免疫動物可獲得可靈敏地識別人體中天然的視黃醇結合蛋白的抗體，填補了以往在RBP4抗血清製備上的空白。
文檔編號C12N15/09GK101165178SQ200610117198
公開日2008年4月23日 申請日期2006年10月17日 優先權日2006年10月17日
發明者唐琳娜, 兵 孫, 敏 羅, 蔡興鋒 申請人:中國科學院上海生命科學研究院