一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標記及其應用的製作方法

2023-06-10 16:54:46

專利名稱：一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標記及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，具體的說是一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標記及其應用。
背景技術：
哈氏弧菌(Vibrio harveyi)廣泛分布於海水環境中，能夠感染脊椎與非脊椎動物，包括魚、蝦、貝等。如同其它感染，哈氏弧菌感染的早期診斷將有利於弧菌病的防控。然 而，哈氏弧菌檢測受到下列因素的制約(1)在形態上不同菌株間存在較大的差異，(2)在 遺傳進化上該菌與數種其它弧菌，如溶藻弧菌和副溶血弧菌，非常相近。目前，已有幾種利 用分子生物學手段檢測哈氏弧菌的方法，包括通過PCR分析溶血素基因vhh、調控蛋白基因 toxR、促旋酶基因gyrB、以及16S rRNA基因。由於這些基因都不僅存在於哈氏弧菌中而且 存在於其它弧菌中，因而其檢測結果難免有假陽性和假陰性。另外，這些方法皆需要細胞培 養以及DNA提取，在操作上有一定的時間要求和技術要求。

發明內容
本發明目的在於提供一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標記及其應用。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為哈氏弧菌特異性分子遺傳標記序列表SEQ ID No. 1中的鹼基序列。特異性分子遺傳標記的應用所述遺傳標記可特異性的檢測哈氏弧菌。1)根據序列表SEQ ID No. 1中的鹼基序列所示的哈氏弧菌特異性 分子遺傳標記，涉及的引物為引物F6(5』 -TGGATGTAAATGAGTTTGG-3』 )和 R4(5' -CGTTACGATTATTTGATAG-3『)；2)待測魚血液與組織樣品的製備於無菌條件下取魚尾靜脈血和魚腎、脾臟，將 腎、脾臟加入Iml PBS進行勻漿，而後進行稀釋，待用；3)環境樣品的製備自環境中取IOml水體，用0. 45uM濾膜過濾，將濾膜用無菌水 衝洗，收集衝洗後的無菌水水樣，於100°c煮沸5min。4)取IOuM的F6和R4為引物，以2ul步驟2)或3)中的樣品為模板，進行PCR擴 增，若得到159bp PCR產物，即可確定待測魚血液與組織樣品被哈氏弧菌感染。所述步驟2)的血液和組織勻漿液用無菌水進行IOx稀釋，而後將稀釋液於100°C 煮沸5min。所述步驟3)的濾膜用0. 5ml無菌水衝洗。所述步驟4)的PCR反應體系為15ul ； PCR 過程為94°C 4min 預變性模板 DNA，然後 94°C 40s, 50°C 60s, 72°C 40s, 25-30 個循環後 再在72°C延伸反應5min。本發明具有如下優點1.準確性較高。本發明所用的遺傳標記廣泛存在於哈氏弧菌中而且具有一定的屬 內保守性，因而與其它弧菌交叉反應的可能性很小。2.快速簡單。本發明的哈氏弧菌檢測方法實施過程簡單，毋需細胞培養、DNA提取等步驟，只需常規的PCR，3小時左右即可獲得結果。3.應用範圍廣。本發明的檢測方法對樣品無特殊要求，可以檢測環境及生物源性樣品。4.本發明通過哈氏弧菌基因vhhP2，該基因廣泛存在於哈氏弧菌中，但不存在於其它弧菌中，包括上述與哈氏弧菌進化關係非常近的兩種弧菌中，因而該基因是一種特異 的哈氏弧菌遺傳標記，用其作為PCR探針可以準確、快速地從多種生物和環境樣品中檢測 哈氏弧菌。


圖1為本發明從魚血液、組織中檢測哈氏弧菌的電泳圖譜(其中泳道1 分子量 marker ；泳道2，陽性對照；泳道3、4、5分別為以注射過T4的魚血液、脾臟、肝臟為模板所 得的PCR產物；泳道6、7、8分別為以注射過PBS的魚血液、脾臟、肝臟為模板所得的PCR產 物。)。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而 非以任何形式對本發明進行限制。在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均採用如下方法1.質粒提取、DNA(PCR)產物純化皆使用「天根生化科技(北京)有限公司」的相 應試劑盒。2. PCR反應各種組分皆購於「天根生化科技(北京)有限公司」。實施例1哈氏弧菌特異性分子遺傳標記由序列表SEQ ID No. 1中的vhhP2鹼基序列組成。序列表SEQ ID No. 1 為:ATGAAGAGAAGGAATCCTCAAGGCCTTACCCTACTAGAACTTATCATTGCGATAGTCATTCTCGGCATC CTAGCTGTTGTTGCAGCTCCCCGTTTTTTAAACCTCCAAGACGATGCGTATCAAGCAAAAATGGAATCCATCGCTGACCA ATTCGMACAGGCGTGCGATTTACCCAAAGCCAATGGTTAGTCAATGGTGGAACACAGGAAGCTCAAACAGATATCGATG GATATGGTGGTGGCGAACTGGATGTAAATGAGTTTGGCTTTCCGCTTGGCACTAACAAGGGCAACAGAAATGGCGTGATT GGCAACCCGTATAACATAGGACAAGGGAATGCTGGTTGTATTGCCGTGTGGCAAGCTTTACTCGGCAACGAATACTCTCT ATCAAATAATCGTAACGCGAACGATAGGTTTGATTTTATTACCCGACGAGTCCAAGACAAAGAATCCCACCAATCTGTTT GTTATTATACCTTTACTAAAAAAGGTTACGATCGCAATCCTGATAACTCTAGCTTCGTCATATGGTATGACTCAAAAACA GGCAGCGTCACGACATCAAAACCAACTAGATTGAAATAA
(a)序列特徵·長度588bp·類型鹼基序列·鏈型單鏈·拓撲結構線性(b)分子類型雙鏈DNA(c)假設否(d)反義否 (e)最初來源哈氏弧菌T4(f)特異性名稱vhhP2哈氏弧菌特異性分子遺傳標記的應用，其遺傳標記可特異性的檢測哈氏弧菌。魚血液與組織中哈氏弧菌的檢測1)牙鮃的人工感染在液體LB培養基中培養哈氏弧菌T4 (保存於CGMCC，保藏編號為CGMCCNo. 1985) 至OD6tltl為0.6，離心(500(^，4°0101^11，收集菌體，將其懸浮於？83中至終濃度為51106(^11/ ml。將10條牙鮃(每條重約12g)隨機分為2組，每組5條。將這2組分別命名為A和B。 將A組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述哈氏弧菌懸浮液。將B組的每條魚分別腹腔注射 lOOulPBS。其中LB液體培養基組成成分按重量百分比計1.0%蛋白腖，0.5%酵母膏， 1.0% NaCl, 97. 5% H20 ；PBS 組成成分按重量百分比計0. 8% NaCl,0. 02% KCl,0. 358% Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO4 ；2)牙鮃血和組織樣品製備在上述步驟1)牙鮃感染48h時，於無菌條件下取魚尾靜脈血，置於1. 5ml離心管。 同時取魚腎、脾臟，置於玻璃勻漿器中，加入Iml PBS進行勻漿。將血液和組織勻漿液用無 菌水進行IOx稀釋。將稀釋液於100°C煮沸5min。3) PCR 檢測在0. 5ml PCR管中，加入下列成分2ul上述步驟2)高溫處理後的 血液或組織稀釋液，IOuM引物F6(5，-TGGATGTAAATGAGTTTGG-3，)，IOuM弓丨物 R4(5，-CGTTACGATTATTTGATAG-3，)，1.5μ 1 PCR buffer(200mM Tris-NCl(pH 8. 4),200mM KCl, 15mM MgCl2), 1. 5μ 1 IOmM dNTP,0. 25 μ 1 Taq DNA 聚合酶，加水至總體積為 15ul。其中引物F6和R4為vhhP2特異性引物，其PCR產物大小為159bp。按下列條件進行PCR 94 °C 4min預變性模板DNA，然後94 °C 40s, 50 °C 60s， 72°C 40s, 25-30個循環後再在72°C延伸反應5min。取IOul PCR產物於0. 8%瓊脂糖凝膠 電泳，電泳後凝膠用溴化乙錠染色觀察。結果表明(見附圖1)，只有用注射哈氏弧菌的牙鮃 血液和組織做模版的PCR擴增出一條159bp的陽性條帶，而用注射PBS的牙鮃血液和組織 做模版的PCR則無任何條帶。實施例2養殖蝦池中哈氏弧菌的檢測1)水樣採集和處理
自兩個不同對蝦養殖池(命名為A和B)中分別取IOml水體，分別用0. 45uM濾膜 過濾，去掉過濾後的水體。將濾膜用0. 5ml無菌水衝洗，分別收集衝洗後的無菌水水樣，即 為A和B衝洗液。將A和B衝洗液於100°C煮沸5min。2) PCR 檢測在0. 5ml PCR管中，加入下列成分2μ 1上述步驟1)高溫處理過的A或B衝洗液， IOuM 引物 F6 (5，-TGGATGTAAATGAGTTTGG-3，)，IOuM 引物 R4 (5，-CGTTACGATTATTTGATAG-3，)， 1. 5 μ 1 PCR buffer (200mM Tris-HCl (ρΗ8· 4)，200mM KCl，15mM MgCl2)，1· 5 μ 1 IOmM dNTP, 0. 25 μ 1 Taq DNA聚合酶，加水至總體積為15ul。PCR條件同實施例1步驟3)。結果表明，只有蝦池A的水樣擴增出一條159bp的 陽性條帶，蝦池B的水樣無任何PCR條帶，說明蝦池A含有哈氏弧菌，蝦池B不含有哈氏弧菌。3)上述步驟2) PCR結果的分子驗證為了檢驗上述步驟2) PCR結果的正確性，將IOOul上述步驟1)沒有經過高溫處理 的衝洗液A和B塗布於TCBS平板(購於「海博生物技術有限公司」)，28°C培養24_32h後， 每個平板挑取20個菌落，於LB液體培養基中過夜培養。在0. 5ml PCR管中，加入下列成分 1 μ 1 細菌培養液，IOuM 引物 8F(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)，IOuM 引物 1492R(5，-GG TTACCTTGTTACGACTT-3，)，1. 5 μ 1 PCR buffer(200mM Tris-HCl(pH 8. 4)，200mM KCl,15mM MgCl2)，1. 5μ 1 IOmM dNTP，0. 25 μ 1 Taq DNA聚合酶，加水至總體積為15ul。PCR條件同實 施例1步驟3)。其中8F和1492R為16SrRNA基因特異性引物。將PCR產物測序，結果表明來自蝦池A水樣的菌落中有15 %為哈氏弧菌，而來自蝦 池B水樣的菌落皆非哈氏弧菌。由此證明上述步驟2)的PCR結果正確。以上結果表明，本發明的哈氏弧菌檢測方法可以快速準確地檢測血液、組織以及 環境樣品中的哈氏弧菌。序列表.txtSEQUENCE LISTING中國科學院海洋研究所 一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標記及其應用2PatentIn version 3. 11588DNA 哈氏弧菌 T4CDS(1). . (588)
1atg aag aga agg aat cct caa ggc ctt acc cta cta gaa ctt ate att 48Met Lys Arg Arg Asn Pro Gln Gly Leu Thr Leu Leu Glu Leu lie lie151015
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1952195PRT 哈氏弧菌T42Met Lys Arg Arg Asn Pro Gln Gly Leu Thr Leu Leu Glu Leu lie lie151015Ala lie Val lie Leu Gly lie Leu Ala Val Val Ala Ala Pro Arg Phe202530Leu Asn Leu Gln Asp Asp Ala Tyr Gln Ala Lys Met Glu Ser lie Ala354045Asp Gln Phe Glu Thr Gly Val Arg Phe Thr Gln Ser Gln Trp Leu Val505560Asn Gly Gly Thr Gln Glu Ala Gln Thr Asp lie Asp Gly Tyr Gly Gly65707580Gly Glu Leu Asp Val Asn Glu Phe Gly Phe Pro Leu Gly Thr Asn Lys859095Gly Asn Arg Asn Gly Val lie Gly Asn Pro Tyr Asn lie Gly Gln Gly100105110Asn Ala Gly Cys lie Ala Val Trp Gln Ala Leu Leu Gly Asn Glu Tyr115120125Ser Leu Ser Asn Asn Arg Asn Ala Asn Asp Arg Phe Asp Phe lie Thr130135140Arg Arg Val Gln Asp Lys Glu Ser His Gln Ser Val Cys Tyr Tyr Thr145150155160Phe Thr Lys Lys Gly Tyr Asp Arg Asn Pro Asp Asn Ser Ser Phe Val165170175lie Trp Tyr Asp Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr Ser Lys Pro Thr180185190Arg Leu Lys19權利要求
一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標記，其特徵在於序列表SEQ ID No.1中的鹼基序列。
2.一種按權利要求1所述的哈氏弧菌特異性分子遺傳標記的應用，其特徵在於所述 遺傳標記可特異性的檢測哈氏弧菌。
3.按權利要求2所述的哈氏弧菌特異性分子遺傳標記的應用，其特徵在於1)根據序列表SEQID No. 1中的鹼基序列所示的哈氏弧菌特異性分子遺傳標記，涉及 的引物為引物 F6(5，-TGGATGTAAATGAGTTTGG-3，)和 R4(5，-CGTTACGATTATTTGATAG-3，)；2)待測魚血液與組織樣品的製備於無菌條件下取魚尾靜脈血和魚腎、脾臟，將腎、脾 髒加入Iml PBS進行勻漿，而後進行稀釋，待用；3)環境樣品的製備自環境中取IOml水體，用0.45uM濾膜過濾，將濾膜用無菌水衝 洗，收集衝洗後的無菌水水樣，於100°C煮沸5min。4)取IOuM的F6和R4為引物，以2ul步驟2)或3)中的樣品為模板，進行PCR擴增，若 得到159bp PCR產物，即可確定待測魚血液與組織樣品被哈氏弧菌感染。
4.按權利要求3所述的哈氏弧菌特異性分子遺傳標記的應用，其特徵在於所述步驟2)的血液和組織勻漿液用無菌水進行IOx稀釋，而後將稀釋液於100°C煮沸5min。
5.按權利要求3所述的哈氏弧菌特異性分子遺傳標記的應用，其特徵在於所述步驟3)的濾膜用0.5ml無菌水衝洗。
6.按權利要求3所述的哈氏弧菌特異性分子遺傳標記的應用，其特徵在於所述步驟4)的PCR反應體系為15ul；PCR過程為94°C 4min預變性模板DNA，然後94°C 40s，50°C 60s， 72°C 40s, 25-30個循環後再在72°C延伸反應5min。
全文摘要
本發明涉及分子生物學領域，具體的說是一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標記及其應用。具體為所述哈氏弧菌遺傳標記具有序列表SEQ ID No.1中的鹼基序列，其應用為利用遺傳標記可特異性的檢測哈氏弧菌；本發明基於該標記可快速、準確檢測哈氏弧菌，並且應用範圍廣泛，並且簡單易行，無需細胞培養、DNA提取等步驟。
文檔編號C12Q1/68GK101818191SQ20091001451
公開日2010年9月1日 申請日期2009年2月27日 優先權日2009年2月27日
發明者孫鯤, 孫黎 申請人:中國科學院海洋研究所