丹酚酸b及它的鹽和其它酚酸類的醫學用途的製作方法

2023-07-02 20:35:56 2

專利名稱：丹酚酸b及它的鹽和其它酚酸類的醫學用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及從中藥提取的有效成份的醫學用途。更具體指丹參通過化學方法提取出丹酚酸B及它的鹽和其它酚酸類的醫學用途。
背景技術：
丹酚酸B及它的鎂鹽理化數據為分子式C36H28MgO16；分子量740.9154；[d]D20+126.7(C 0.73，H2O)；Uvλmax 210(ε1.92×104)，286(ε1.35×104)，306(ε1.20×104)；IR3400；1700nm；1608，1519；1363；1288cm-1均有吸收峰通過MS NMR.U.V.IR證明其結構為 1M+＝Mg2+/22M+＝NH4++K+丹酚酸B(lithospermate B)C36H28MO16 迷迭香酸(rosmarinic acid) 紫草酸(lithospermic acid)C18H16O8C27H22O12
丹參素(Danshensu)C9H10O51、MTB在高血脂動物模型主動脈條上，通過肉眼，光鏡，電鏡觀察到有明顯的抗AS作用，肉眼可見明顯減少黃色斑塊隆起，粥樣硬化程度分級明顯降低，光鏡觀察到內膜下泡沫細胞層數較少，平滑肌細胞增殖較輕，電鏡下示內皮細胞改變較輕，泡沫細胞較少，收縮型平滑肌細胞所佔比例較大，幹滑肌細胞內內質網，高爾基體，線粒體較少，究肌絲含量較多，細胞分化程度較好；2、MTB可調節血脂，降低TC，TG，LDL，LP(a)，升高HDL；抗脂質過氧化，提高SOD活性；3、MTB可提高NO，減低內皮素血漿水平，保護內皮細胞，並通過抑制動脈粥樣硬化組織Bfgf(鹼性成纖維細胞生長因子)在動脈壁的表達，調控平滑肌細胞的遷移與增殖，幹預AS的進程。
以上實驗均是硝苯地平作陽性對照性，作用於優於硝苯地平。
1、丹酚酸B對CCl4誘導的大鼠慢性肝損傷及肝纖維化形成有良好的抑制作用。
(1)有效抑制肝臟結締組織增生，降低肝臟膠原含量，其效果優於秋水仙鹼及原生藥丹參；(2)抗肝細胞損傷，丹酚酸乙各劑量組均能顯著降低模型大鼠較大幅度增高的血清ALT、AST活性及總膽紅素含量，高劑量組顯著提高血清Alb含量。綜合作用於對照藥物(丹參組對降總膽紅素的作用於不明顯，秋水仙鹼對降AST的作用不明顯)。(3)丹酚酸乙量效結果顯示以中劑量(12.5mg/Kg鼠重)為佳。
2、丹酚酸乙對已形成的DMN誘導的大鼠肝纖維化有良好的治療效果。
(1)顯著促進肝內膠原的重吸收，降低肝組織Hyp含量及I型膠原的沉積；(2)促進損傷肝細胞的修復，提高血清Alb含量，降低血清ALT、AST活性；(3)顯著降低大鼠腹水出現率；(4)作用優於秋水仙鹼及原生藥丹參；(5)具一定的量效關係，有效劑量區間為12.5mg/kg/d～25mg/kg/d。
3、丹酚酸乙有一定的促進機體體液免疫功能與細胞免疫功能作用。能促進小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能，提高小鼠血清中的溶血素含量，抑制小鼠的白細胞移動。增加小鼠抗體生成細胞的數量。
4、對體外肝星狀細胞功能的影響。能顯著抑制HSC的增殖，抑制活化HSC的TGFβ1自分泌及活化；降低I型前膠原mRNA表達與膠原蛋白的生成，抑制TGFβ1信號轉導通路中MAPK的活化。
5、一般藥理研究本品劑量為3.8、7.5和15mg/kg灌胃對麻醉Beagle犬的呼吸和循環系統的功能無明顯的影響；本品劑量15、30和60/kg灌胃對小鼠爬杆試驗和Iruin行為分級試驗均無影響。

發明內容
本發明的目的是提供一類具有對肺纖維化抑制作用的藥物質(化合物)本發明涉及的化合物為丹酚酸B及它的鹽包括鎂、銨、鉀鹽(DS-1)和丹酚酸B鹽與其它酚酸類包括迷迭香酸、紫草酸、丹參素及/或它的鹽的組合物(DS-2)的醫學用途。
丹酚酸B及鎂鹽對心血管的作用及對肝損傷，肝纖維化已作了大量試驗，特別是對心血管的作用具有調節血脂，降低TC，TG，LDL，LP及升高HDL作用。本發明對丹酚酸B及它的鹽進行肺纖維化抑制作用的試驗，通過體外、體內的試驗，證明丹酚酸B及它的鹽具有對肺纖維化抑制作用。


圖1是DS-1對TGF-β1刺激的WI-38細胞I型膠原合成增加的影響。
圖2是DS-2對TGF-β1刺激的WI-38細胞I型膠原合成增加的影響。
圖3是DS-1對WI-38細胞增殖的影響(*p＜0.05vs.培養液對照(Con))。
圖4是DS-2對WI-38細胞增殖的影響(*p＜0.05vs.培養液對照(Con))。
圖5是體內實驗28天時大鼠病理解剖所見，其中A.空白對照組；B.BLM模型組，肺表面出血、纖維化病灶明顯；C.DS-12.5mg/kg治療組，肺表面出血、纖維化病灶明顯減少、減輕；D.DEX組，肺表面出血、纖維化病灶減少、減輕。
圖6是體內實驗28天時大鼠病理組織學檢查所見，其中A.空白對照組；B.BLM模型組，肺組織大面積纖維化，肺泡間隔明顯增厚，炎症、出血病變明顯；C.DS-1 2.5mg/kg治療組，肺組織炎症、出血明顯減輕，纖維化病變程度明顯改善；D.DEX組，肺組織炎症、出血明顯減輕，纖維化病變程度改善。
具體實施例方式
試驗物質丹酚酸B及它的鹽，包括鎂、銨、鉀鹽(DS-1)，丹酚酸B鹽與其他酚酸類包括迷迭香酸、紫草酸、丹參素及/或它的鹽的組合物(DS-2)。它們的含量以重量百分比計，丹酚酸B鹽含60-75％，迷迭香酸5-20％，紫草酸為5-16％，丹參素為3-10％。
藥理試驗分為體外試驗和體內試驗二部分一、體外試驗DS-1和DS-2對W1-38細胞增殖及TGF-β1刺激的膠原合成的影響1.實驗目的評價DS-1和DS-2體外對WI-38細胞增殖及TGF-β1刺激的膠原合成的影響。
2.材料與方法2.1受試藥物及試劑DS-1和DS-2由中國科學院上海藥物研究所天然藥物化學研究室提供。
重組人TGF-β1購自美國RD公司。
人I型膠原檢測ELISA試劑盒購自美國Chondrex公司。
細胞增殖檢測試劑盒，CCK-8購自日本Dojindo公司。
2.2細胞培養WI-38，人胚胎肺成纖維細胞系購自美國ATCC。細胞培養條件為DMEM培養液(10％胎牛血清(FCS))，37℃、5％CO2空氣中貼壁孵育2h，更換培養液去除未貼壁之雜細胞。待細胞生長至70％融合時，用胰酶消化，按1∶4傳代。實驗用10-15代的細胞。用胎盤蘭拒染方法判斷細胞存活率。
用DMEM培養液(10％FCS)製成2×105cell/ml的細胞懸液，按每孔100μl加入96孔板中，用於細胞增殖率測定。
用DMEM培養液(10％FCS)製成7.5×104cell/ml的細胞懸液，按每孔1ml加入24孔板中，24h後去培養液，加入含0.4％FCS和50μg/ml抗壞血酸鹽的培養液，繼續培養24h後加入TGF-β1(10ng/ml)和不同濃度的DS-1/DS-2，用於I型膠原合成的檢測。
2.3人I型膠原檢測人I型膠原檢測應用ELISA方法，按試劑盒說明書進行操作。讀取490nm吸光度值。結果表示為微克I型膠原每毫克蛋白(μg/mg)。
2.4細胞增殖測定融合的WI38細胞用胰酶消化，洗滌，離心後，用DMEM培養液(含10％FCS)製成2×105cell/ml的細胞懸液，存活率＞95％，按每孔100μl加入96孔板中，在37℃、5％CO2培養24h後，棄上清，每孔加入不同處理因素的濃度的DS-1或DS-2，繼續培養21h，加入WST10μl，繼續培養3h，讀取OD450值。結果以OD 450表示。
2.5數據分析及統計方法各檢查指標數據錄入SPSS進行統計學分析。結果用mean±SD表示。計量指標，若方差齊用ANOVA過程進行分析，最小顯著級差法(LSD)進行各組間比較，方差不齊的用Student t test進行顯著性檢驗。計數資料用卡方檢驗進行比較。顯著性水準為p＜0.05。
3、結果3.1 DS-1、DS-2對I型膠原合成的影響為了檢測DS-1、DS-2對人肺成纖維細胞膠原合成的直接作用，進行了體外實驗。結果見圖1和2。TGF-β1對WI-38細胞的I型膠原合成有明顯的促進作用。而DS-1和DS-2對TGF-β1誘導的I型膠原合成增加有明顯的抑制作用，並呈依劑量關係。
3.2 DS-1、DS-2對細胞增殖的影響DS-1和DS-2對細胞增殖的影響見圖3和4。DS-1和DS-2在100μg/ml的濃度下對WI-38細胞的細胞增殖有一定的抑制作用(p＜0.05).但在10，和1μg/ml濃度下對WI-38細胞的細胞增殖有促進作用(p＜0.05)。
4、小結實驗結果表明DS-1、DS-2在體外可以抑制由TGF-β1刺激的WI-38細胞I型膠原合成的增加；另外在DS-1和DS-2在100μg/ml的濃度下對細胞增殖均有抑制作用。這些結果與體內試驗的組織病理學檢查所觀察到的DS-1，DS-2對BLM誘導的SD大鼠肺纖維化的抑制作用相一致。
二、體內試驗DS-1和DS-2對博來黴素A5誘導的SD大鼠肺纖維化的作用1.實驗目的觀察DS-1，DS-2對博來黴素A5(BLMA5)誘導的SD大鼠肺纖維化是否具有抑制作用。
2.受試藥物受試藥物1DS-1受試藥物2DS-2提供單位中國科學院上海藥物研究所天然藥物化學研究室含量＞99％對照樣品名稱醋酸地塞米松片提供單位上海信宜藥業有限公司批號020601含量0.75mg/片其他藥品與試劑注射用平陽黴素(BLMA5)，白色或淡黃色凍乾粉，批號021002，天津太河製藥有限公司，用0.9％生理鹽水配製成注射液。
3.動物3.1來源、種屬、品系及試驗前處理SPF級SD大鼠由由中英合資西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。許可證號SCXK(滬)2003-0002。實驗前經中國科學院上海藥物研究所SPF級動物房1周適應性飼養，飼養合格證號SYXK(滬)2003-0029。動物房條件控制溫度23±2℃，溼度60±10％，光照12h/24h，黑暗12h，動物飼料由西普爾必凱公司提供。適應期間動物每2隻1籠。
3.2動物周齡、體重、性別實驗開始時動物10周齡左右，70隻，每組10隻，體重200-250g，雄性。
4.實驗方法4.1 BLMA5誘導SD大鼠肺纖維化模型複製採用一次性氣管內滴注BLMA5的方法複製大鼠肺纖維化動物模型。大鼠麻醉後在頸部正中切口，剝離皮下組織及肌肉，暴露氣管用1ml注射器將BLMA5/生理鹽水緩慢注入氣管，BLMA5劑量為5mg/kg。生理鹽水對照組氣管滴注等體積生理鹽水。造模後連續給藥28天後處死，進行各項指標的檢測和評價。
4.2實驗分組與處理1)生理鹽水對照組(即空白對照)2)模型組(BLMA5組)3)DS-1 2.5mg/kg治療組(DS-1高劑量組)4)DS-1 1.25mg/kg治療組(DS-1低劑量組)5)DS-2 2.5mg/kg治療組(DS-2高劑量組)6)DS-2 1.25mg/kg治療組(DS-2低劑量組)7)地塞米松0.5mg/kg治療對照組(DEX組)空白對照組和模型組每日1次灌胃滅菌雙蒸水，DEX組給予0.5mg/kg地塞米松。
給藥體積為10ml/kg體重。
5.劑量設置及理由大鼠灌胃DS-1，DS-2 2.5，1.25mg/kg對CCl4和DMN誘導的大鼠慢性肝損傷和纖維化形成有良好的抑制作用。為此設DS-1，DS-2預實驗的高劑量均為2.5mg/kg，每日1次灌胃，低劑量減半，為1.25mg/kg 2個劑量組，共4個治療組。
6.觀察指標6.1一般臨床表現主要觀察造模後大鼠是否出現發紺，呼吸急促等呼吸困難表現，其它如毛松，精神萎靡等一般毒性表現。
6.2病理解剖觀察6.2.1肉眼觀察肺組織的顏色、病變部位和程度；6.2.2肺溼重及臟器係數大鼠麻醉後，開胸，行右心室插管，PBS灌流衝去肺組織中的血液。取左肺稱溼重，並計算臟器係數。取左肺，10％中性福馬林固定，做病理組織學檢查。右肺在-80℃冰箱冰存，做組織生化學檢測。
6.3肺組織生化學檢查肺組織羥脯氨酸(HP)含量採用改進的氯胺T法。
6.4病理學組織學檢查病理組織學檢查肺組織經固定，常規石蠟包埋、切片，HE染色。顯微鏡下觀察肺組織炎症、出血和纖維化等病變，並進行圖像分析，對肺泡炎和纖維化程度進行評價。
7.數據及統計學分析各檢查指標數據錄入SPSS進行統計學分析。結果用mean±SD表示。體重，肺溼重及相對重，肺組織羥脯氨酸含量，肺組織切片圖像分析結果等計量指標，若方差齊用ANOVA過程進行分析，最小顯著級差法(LSD)進行各組間比較，方差不齊的用Student t test進行顯著性檢驗。計數資料用卡方檢驗進行比較。
8.實驗結果8.1死亡情況一些大鼠造模後給藥期間出現死亡，BLMA5組死亡3隻。DS-1 1.25mg/kg組死亡1隻。DS-2 2.5和1.25mg/kg組分別有3隻，4隻大鼠死亡。各組死亡率總結見表1。
表1各組大鼠死亡率

8.2臨床表現模型組大鼠氣管內滴注BLMA5後出現萎靡，少動，毛松，第3天至第9天呼吸急促，發紺等呼吸道症狀表現明顯，並伴有消瘦、體重減輕。第10天之後上述症狀逐漸稍有改善，但至給藥28天時仍有以上臨床表現。DS-1各劑量和DS-2高劑量組治療組上述的臨床表現與模型組相比明顯減輕，約10天左右症狀明顯改善，約15天左右，與空白對照相比，無明顯差別。DEX治療組大鼠也出現相似的臨床表現，但呼吸急促，發紺的程度較模型組輕。
8.3左肺溼重與相對重％DS-1，DS-2對BLMA5誘導肺纖維化的SD大鼠肺溼重和相對重的影響見表1。結果顯示，與模型組相比，各治療組左肺溼重和相對重量略有下降，且DS-1各治療組的下降有統計學意義。
表2各組大鼠肺溼重和相對重

*p＜0.05**p＜0.01vs.空白對照組；#p＜0.05，##p＜0.01vs.BLM組；ap＜0.05vs.DEX組；相對重％＝左肺溼重(g)/體重(g)×100％8.4肺組織生化學檢查HP含量是衡量組織膠原蛋白含量的特異性生化指標。灌胃DS-1，DS-2對肺組織膠原蛋白含量的影響見表3。結果顯示BLM模型組及各治療組的HP含量均顯著高於空白對照組(p＜0.05)。DS-1各治療組和DS-22.5mg/kg劑量組的HP含量低於BLM組，差別有統計學意義。
表3各組大鼠右肺組織HP含量

*p＜0.05**p＜0.01vs.空白對照組；#p＜0.05，##p＜0.01vs.BLM組；ap＜0.05vs，DEX組8.5病理解剖和病理組織學檢查實驗第28天，各組動物解剖時可見，DS-1各治療組和DS-22.5mg/kg組與模型組相比，肺組織表面出血點和纖維化病灶有不同程度減少(5)。病理組織學檢查顯示，模型組大鼠肺組織可見出血，較多淋巴細胞、單個核細胞浸潤，肺泡壁明顯增厚並可見較多成纖維細胞，部分肺泡腔消失，或被淋巴細胞、成纖維細胞團和膠原纖維填塞。與模型組相比，DS-12.5mg/kg組動物肺組織出血、炎細胞浸潤明顯減少，肺纖維化病變程度明顯減輕(圖6)。DS-11.25mg/kg治療組和DS-22.5mg/kg組劑量組肺組織出血、炎症和纖維化程度減輕不如DS-12.5mg/kg組明顯，並與地塞米松組的結果相似。
對各組大鼠肺組織切片進行圖像分析，結果顯示，DS-1各治療組、DS-22.5mg/kg組和DEX治療對照組淺染區面積百分比明顯較模型組減少，說明在該劑量下對BLM引起的肺纖維化有一定的抑制作用；各治療組肺泡炎病變程度(見深染區面積百分比)與模型組相比有不同程度的減輕。
表4各組大鼠肺組織切片圖像分析結果

*p＜0.05**p＜0.01vs.空白對照組；#p＜0.05，##p＜0.01vs.BLM組；ap＜0.05vs.DEX組淺染區代表肺間質纖維化程度，深染區代表炎症區域，代表炎症反應程度，無染區為肺泡腔。
9.小結SD大鼠灌胃DS-1對BLMA5誘導的肺纖維化的作用為●DS-1可以明顯減少BLMA5引起的大鼠死亡●對存活大鼠的一般臨床表現有改善作用；●降低BLMA5引起的肺溼重增加；●對BLMA5誘導的肺組織HP含量增加有一定的抑制作用，病理組織學檢查顯示與模型組相比，DS-1各治療組對肺纖維化病變有不同程度的改善，呈依劑量關係DS-1高劑量組的抑制作用優於地塞米松治療對照組。
SD大鼠灌胃DS-2對BLMA5誘導的肺纖維化的作用為●對存活大鼠的一般臨床表現有改善作用，但沒有DS-1明顯；●降低BLMA5引起的肺溼重增加；●對BLMA5誘導的肺組織HP含量增加有一定的抑制作用。病理組織學檢查顯示，與模型組相比，肺纖維化病變有所改善。高劑量組於地塞米松治療對照組相當，而低劑量組的抑制作用不明顯。
權利要求
1.丹酚酸B及它的鹽或丹酚酸B鹽和丹參酸類化合物組成的組合物的醫學用途，作為在製備預防、治療人的肺纖維化藥物中應用。
2.根據權利要求1所述的丹酚酸B及它的鹽或丹酚酸B鹽和丹參酸類化合物組成的組合物的醫學用途，其特徵在於丹酚酸B及它的鹽、迷迭香酸、紫草酸、丹參素鈉鹽組成的組合物作為製備預防、治療人的肺纖維化藥物中應用。
3.根據權利要求1所述的丹酚酸B及它的鹽或丹酚酸B鹽和丹參酸類化合物組成的組合物，其特徵在於該組合物為(以重量百分比計)丹酚酸B鹽 60-75％迷迭香酸5-20％紫草酸為3-16％丹參酸為3-10％。
全文摘要
本發明公開了丹酚酸B及它的鹽和由丹酚酸B及它的鹽、迷迭香酸、紫草酸、丹參素鈉鹽組成的組合物的醫學用途。通過動物體內、體外實驗證明丹酚酸B及它的鹽具有對肺纖維化抑制作用，該作用與地塞米松治療對照組相當。
文檔編號A61P11/00GK1768738SQ20041006790
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月5日 優先權日2004年11月5日
發明者朱大元, 任進, 蔣山好, 宮麗昆 申請人:中國科學院上海藥物研究所