一種植物乳桿菌n13及其用途的製作方法

2023-05-29 14:58:56

專利名稱：一種植物乳桿菌n13及其用途的製作方法
ー種植物乳桿菌NI 3及其用途
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域。更具體地，本發明涉及ー種植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)N13,還涉及所述植物乳桿菌N13的用途。
背景技木腸侵襲性大腸桿菌(EnteroinvasiveEscherichia coli. , EIEC)是一組能侵入大腸上皮細胞，使宿主腸上皮細胞發生炎症或形成潰瘍，引起痢疾樣症狀的大腸桿菌菌株。 EIEC致病毒力強，繁殖速度快，只要有10 100個EIEC細菌就可以引發疾病，它汙染食品和水源，造成爆發流行，從而引起大規模性腹瀉疾病。EIEC的毒力取決於侵入細胞的能力， 侵入過程包括原發和擴散兩個過程。EIEC入侵腸道上皮細胞分為四個過程(I)EIEC通過 M細胞到達腸黏膜下層；(2)在巨噬細胞中複製；(3)侵入到結腸細胞的基底外側；(4)侵入到結腸上皮細胞，並在其中繁殖，擴散，引發炎症和痢疾症狀反應。治療EIEC所引起的腸道疾病,通常的治療方法是使用抗生素治療。抗生素治療方法具有以下作用1、能有效控制EIEC引起的臨床和亞臨床感染；2、抗生素可以抑制腸道細胞壁的增生，從而提高腸道細胞對營養成分的吸收；3、起著選擇腸道微生物菌群的作用，主要是通過減少有害微生物對必須營養物質的消耗，増加有益細菌的大量繁殖；4、影響動物的某些生理代謝，從而影響動物的生長。抗生素治療具有見效快，治療時間短等優點，但是隨著人類大量使用和濫用抗生素，同時也給環境和社會帶來了一系列問題，這主要包括1、 抗生素能夠導致腸道菌群失調，耐藥性菌株增加，從而使得抗生素治療愈發困難；2、長期使用抗生素造成機體免疫力下降；3、易感染情況增加，引起機體二重感染；4、抗生素等藥物在畜產品和環境中的殘留，威脅人類的身體健康。為了克服抗生素的副作用，越來越多的研究選用益生菌來治療EIEC對機體的損害。Resta—Lenert 等人(Resta-Lenert, S. , &Barrett, K. E. (2006). Live probiotics protect intestinal epithelial cells irom the effects oi infection with enteroinvasive Escherichia coli (EIEC). Gut, 52,988-997.)利用活的 Streptococcus thermophilus和Lactobacillus acidophilus幹預EIEC,發現聯合使用這兩種乳酸菌能夠明顯的降低EIEC對宿主的粘附和侵襲，並降低EIEC引起的宿主生理功能障礙；Medici等人(Medici, M. , Vinderola, C. G. , Weill, R. , &Perdigon, G. (2005). Effect of fermented milk containing probiotic bacteria in the prevention of an enteroinvasive Escherichia coli infection in mice. Journal of Dairy Research,72,243-249.)
用含有乾酪乳桿菌、德氏乳桿菌的發酵牛奶來治療EIEC引起的感染，發現益生菌能夠通過增強小鼠的腸道黏膜的免疫反應來避免EIEC的感染。這些研究表明根據細菌之間的拮抗作用，主要通過不同菌株之間的競爭性抑制作用，不僅能夠控制EIEC對腸道上皮細胞的損害，還能夠有益於腸道上皮細胞上細菌群落的正常分布，更加有效地發揮腸道的生理功能。 這些研究僅從所選乳酸菌菌株對EIEC的拮抗和治療方面進行考慮，並未考察這些乳酸菌的益生菌特性。益生菌應該具有以下幾個主要特性I.能夠耐受胃腸道的極端環境；2.對機體腸道具有很好的粘附能力；3.能夠調節機體腸道的生態平衡。本發明通過體外實驗篩選出了不僅具有拮抗EIEC能力，而且還具有優良益生菌特性的乳酸菌，並考察乳酸菌對 EIEC粘附和侵襲結腸上皮細胞的抑制作用。與報導的治療EIEC感染的乳酸菌相比，本發明的植物乳桿菌N13具有更好的耐膽鹽能力和對結腸上皮細胞更高的粘附能力。鑑於益生菌對腸道病原菌具有顯著的生物拮抗抑制作用和其獨特的優點，因此篩選對腸侵襲性大腸桿菌具有抑制和拮抗作用的益生菌具有十分廣闊的應用前景。為此，本發明人在總結現有技術的基礎上進行了大量實驗研究工作，完成了本發明。

發明內容[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NI3。本發明的另ー個目的是提供所述植物乳桿菌N13的用途。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)N13,該菌菌株已於2011 年11月29日在北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 5495。植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NI3同時還保藏於江南大學食品微生物菌種保藏中心，保藏編號為CCFM 233。因此在本申請中，術語「CCFM 233」也指代植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)N13,兩者為同一株菌株。所述的植物乳桿菌N13具有下述性質(I)對致病菌腸侵襲性大腸桿菌(Enteroinvasive Escherichia coli.，EIEC, ATCC 43893)具有顯著的抑制作用；(2)具有耐酸性，在pH 2. 0的條件下可以生長；(3)具有耐膽鹽能力，在1_3%。膽鹽條件下能夠生長；(4)對腸上皮細胞株HT-29細胞具有很高的粘附能力；(5)能夠明顯抑制EIEC對腸上皮細胞株HT-29細胞的粘附；(6)能夠明顯降低EIEC對腸上皮細胞株HT-29細胞的侵襲。本發明涉及所述的植物乳桿菌N13在製備酸豆乳、燕麥發酵飲料、發酵青貯飼料、 發酵蔬菜、乳酸菌乳飲料以及發酵乳製品中的用途。所述的含植物乳桿菌N13的酸豆乳是採用下述方法製備的按照軟水與大豆的體積比2-4在溫度75_85°C下用軟水浸泡大豆l_2h，去除大豆皮，去掉浸泡水，再按照大豆與沸水的重量比I : 6-10加沸水磨漿，其漿料在溫度80-85°C 的條件下保持10-15min，然後用150目篩網過濾，得到ー種豆乳；先往該豆乳中加入以豆乳重量計5% -10%的蔗糖，再使用均質機在壓カ15-25MPa下進行均質，隨後在溫度95°C下進行殺菌處理lOmin，其溫度降至36-38°C時，再按照以豆乳重量計0. 04-0. 05%的接種量接入商業乾粉發酵劑保加利亞乳桿菌、商業乾粉發酵劑嗜熱鏈球菌和下述製備的植物乳桿菌 N13發酵劑，其重量比例為I : I : 1，在溫度35-42°C下發酵6-8小時，然後在4°C冷藏保存即得到含植物乳桿菌N13活菌的酸豆乳；
植物乳桿菌N13發酵劑乾粉製劑是按照如下方法製備的植物乳桿菌N13以MRS 液體培養基體積計1-3%接種於MRS液體培養基中，在溫度37°C下培養20-28h，使植物乳桿菌N13活菌數達到108Cfu/mL以上，然後其培養液在轉速3800-4200r/min與溫度2_6°C 的條件下離心8-12min，其離心沉澱物再用pH 7. 2的PBS緩衝液衝洗2_4次，然後把其菌體沉澱加到凍幹保護劑中，調整細胞濃度至109cfu/mL，混合均勻後進行真空冷凍乾燥，凍幹後得到所述的植物乳桿菌N13發酵劑乾粉製劑。所述的凍幹保護劑組成是以重量計蔗糖 1.5%、脫脂乳14%、乳糖5%、甘油1%、澱粉3%和75. 5%水。所述的燕麥發酵飲料是採用下述方法製備的A)以燕麥為原料,將燕麥揀選、去雜、去除表皮並洗浄；B)向燕麥中加入以燕麥重量計100%的50_55°C水進行混合，然後加入到打漿機中打成漿液；C)步驟B)得到的漿液用磨漿機進行磨漿，再用150目的濾網過濾，得到ー種漿液；D)向步驟C)得到的漿液中添加以漿液重量計10-15%白砂糖和1000-1200%水， 在溫度121°C下滅菌20min，冷卻至36_38°C，得到燕麥發酵基料；E)植物乳桿菌N13以MRS液體培養基體積計1_3%接種於MRS液體培養基中，在溫度37°C下培養20-24h，離心分離，棄去發酵上清液，餘下菌體沉澱物用無菌水重懸，使植物乳桿菌N13活菌濃度達到IO8CfuAiL以上，從而得到所述的植物乳桿菌N13液體發酵劑；F)按照以燕麥發酵基料的體積計6-10%接種量，把保加利亞乳桿菌液體發酵劑、嗜熱鏈球菌液體發酵劑和上述步驟E)製備的植物乳桿菌N13液體發酵劑按照體積比 1:1: I接種於在步驟D)製備的燕麥發酵基料中，在發酵溫度36-38°C下培養18-22h，使植物乳桿菌N13的濃度達到IO6CfuAiL以上，然後在溫度3-4°C下冷藏保存即得到含植物乳桿菌NI3活菌的燕麥發酵飲料。所述的發酵蔬菜是採用下述方法製備的A)選用的蔬菜經清洗與浙幹後,用0. 005-0. 01g/kg次氯酸鈉溶液浸泡7_10分鐘進行消毒，將所述的蔬菜去皮、切分，得到ー種預處理蔬菜；B)往步驟A)得到的預處理蔬菜中加入按照所述蔬菜重量計0.6-1.0%糖與 4. 0-6. 0%食鹽，攪拌均勻，在室溫預醃製20-28h，浙幹水分，得到一種預醃製蔬菜；C)稱取食用香辛料，使用以所述食用香辛料重量計8-10倍水在溫度75_85°C下浸提2-4h，冷卻後再添加以所述食用香辛料重量計7-9%白酒，混勻得到ー種香辛料汁；D)將植物乳桿菌N13以MRS液體培養基體積計1_3%接種於MRS液體培養基中， 在溫度37°C下培養20-28h，離心分離，棄去發酵上清液，餘下沉澱物用無菌水重懸，使植物乳桿菌N13活菌濃度達到108cfu/mL以上,從而得到一種菌懸液；E)往步驟B)得到的預醃製蔬菜中添加以所述預醃製蔬菜重量計12-14%在步驟 C)得到的香辛料汁與1-5%在步驟D)得到的菌懸液，混勻，裝罐，密封，在室溫下發酵，直到其發酵液的PH值達3. 6-4. 0，這樣得到所述的發酵蔬菜。其中，所述的蔬菜是ー種或多種選自捲心菜、胡蘿蔔、萵筍、甜椒、洋蔥或芹菜的蔬菜。所述的香辛料是ー種或多種選自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。所述的發酵青貯飼料是採用下述方法製備的將玉米稻杆飼料原料揉切至I 4cm後待用；稱取45_55kg玉米秸杆飼料原料，把0. 5-0. 7g上述製備的植物乳桿菌N13乾粉製劑與200-240mL無菌水混合均勻後噴灑到所述的玉米秸杆飼料原料中，翻拌混和均勻後， 裝入青貯飼料桶中壓實密封，然後在常溫條件下貯存9-12個月後即得到含植物乳桿菌N13 的玉米秸杆飼料。下面將更詳細地描述本發明。本發明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)N13,該菌菌株已於2011 年11月29日在北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 5495。所述的植物乳桿菌N13是採用下述篩選方法獲得的。該篩選方法步驟如下A、乳桿菌菌株的篩選。稱取25g傳統發酵食品、泡菜、醃肉、發酵麵團或嬰兒糞便樣品，加到225mL無菌水中，混勻後在溫度37°C下培養2h，然後取0. 5mL這種培養液加到4. 5mL無菌水中，得到的稀釋培養液再在溫度37°C下培養2h，這樣得到的培養液重複進行上述稀釋培養操作，使該樣品濃度稀釋至10_4，取稀釋度分別為10—1 10_4的菌懸液各50 y L分別塗布於MRS固體培養基上，在溫度37°C下厭氧培養46-50h後，挑選典型單菌落，採用平板劃線法，得到純乳酸菌菌株，具體情況見表I。B、分離菌株拮抗EIEC的試驗將篩選得到的和其他來源的乳酸菌菌株(見表I)各自接種於MRS液體培養基中， 在溫度37°C下進行厭氧培養24h，然後離心分離，得到的發酵上清液進行常規的拮抗EIEC 試驗；將指不菌大腸桿菌 EIEC (Enteroinvasive Escherichia coli ATCC 43893,購自美國典型培養物保藏中心ATCC)活化後接種於LB液體培養基中，於溫度37°C下培養24h，然後測定其培養液在600nm處的吸光度OD6tltl值，並用無菌LB液體培養基將其OD值調節至
0.66-0. 70，以pH 3. 2的MRS液體培養基作為陰性對照，320 u g/mL的慶大黴素作為陽性對照，重複實驗3次，篩選具有拮抗EIEC能力的乳桿菌。其拮抗EIEC試驗結果列於表2。表I :本發明使用的乳酸菌編號、菌株名稱和來源
權利要求
1.一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)N13,該菌菌株已於2011年11月29 日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，其保藏號為CGMCC 5495。
2.根據權利要求I所述的植物乳桿菌N13，其特徵在於它具有下述性質(1)對致病菌腸侵襲性大腸桿菌(EnteroinvasiveEscherichia coli. , EIEC, ATCC 43893)具有顯著的抑制作用；(2)具有耐酸性，在pH2. O的條件下可以生長；(3)具有耐膽鹽能力，在1_3%。膽鹽條件下能夠生長；(4)對腸上皮細胞株HT-29細胞具有很高的粘附能力；(5)能夠明顯抑制EIEC對腸上皮細胞株HT-29細胞的粘附；(6)能夠明顯降低EIEC對腸上皮細胞株HT-29細胞的侵襲。
3.根據權利要求I所述的植物乳桿菌N13在製備酸豆乳、燕麥發酵飲料、發酵青貯飼料、發酵蔬菜、乳酸菌乳飲料以及發酵乳製品中的用途。
4.根據權利要求3所述的用途，其特徵在於所述的含植物乳桿菌N13的酸豆乳是採用下述方法製備的按照軟水與大豆的體積比2-4在溫度75-85°C下用軟水浸泡大豆l_2h，去除大豆皮，去掉浸泡水，再按照大豆與沸水的重量比I : 6-10加沸水磨漿，其漿料在溫度80-85°C的條件下保持10-15min，然後用150目篩網過濾，得到一種豆乳；先往該豆乳中加入以豆乳重量計 5%-10%的蔗糖，再使用均質機在壓力15-25MPa下進行均質，隨後在溫度95°C下進行殺菌處理lOmin，其溫度降至36-38°C時，再按照以豆乳重量計O. 04-0. 05%的接種量接入商業乾粉發酵劑保加利亞乳桿菌、商業乾粉發酵劑嗜熱鏈球菌和下述製備的植物乳桿菌N13發酵劑乾粉製劑，其重量比例為I : I : 1，在溫度35-42°C下發酵6-8小時，然後在4°C冷藏保存即得到含植物乳桿菌N13活菌的酸豆乳；植物乳桿菌N13發酵劑乾粉製劑是按照如下方法製備的植物乳桿菌N13以MRS液體培養基體積計1-3%接種於MRS液體培養基中，在溫度37°C下培養20-28h，使植物乳桿菌 N13活菌數達到108cfu/mL以上，然後其培養液在轉速3800_4200r/min與溫度2_6°C的條件下離心8-12min，其離心沉澱物再用pH 7. 2的PBS緩衝液衝洗2_4次，然後把其菌體沉澱加到凍幹保護劑中，調整細胞濃度至109cfu/mL，混合均勻後進行真空冷凍乾燥，凍幹後得到所述的植物乳桿菌N13發酵劑乾粉製劑；所述的凍幹保護劑組成是以重量計蔗糖I. 5%, 脫脂乳14%、乳糖5%、甘油I %、澱粉3%和75. 5%水。
5.根據權利要求3所述的用途，其特徵在於所述的燕麥發酵飲料是採用下述方法製備的A)以燕麥為原料，將燕麥揀選、去雜、去除表皮並洗淨；B)向燕麥中加入以燕麥重量計100%的50-55°C水進行混合，然後加入到打漿機中打成漿液；C)步驟B)得到的漿液用磨漿機進行磨漿，再用150目的濾網過濾，得到一種漿液；D)向步驟C)得到的漿液中添加以漿液重量計10-15%白砂糖和1000-1200%水，在溫度121°C下滅菌20min，冷卻至36_38°C，得到燕麥發酵基料；E)植物乳桿菌N13以MRS液體培養基體積計1-3%接種於MRS液體培養基中，在溫度37°C下培養20-24h，離心分離，棄去發酵上清液，餘下菌體沉澱物用無菌水重懸，使植物乳桿菌N13活菌數達到108cfu/mL以上，從而得到植物乳桿菌N13液體發酵劑；F)按照以燕麥發酵基料的體積計6-10%接種量，把保加利亞乳桿菌液體發酵劑、嗜熱鏈球菌液體發酵劑和上述步驟E)製備的植物乳桿菌N13液體發酵劑按照體積比I : I : I 接種於在步驟D)製備的燕麥發酵基料中，在發酵溫度36-38°C下培養18-22h，使植物乳桿菌N13的濃度達到106cfu/mL以上，然後在溫度3_4°C下冷藏保存即得到含植物乳桿菌N13 活菌的燕麥發酵飲料。
6.根據權利要求3所述的用途，其特徵在於所述的發酵蔬菜是採用下述方法製備的A)選用的蔬菜經清洗與浙幹後，用O.005-0. 01g/kg次氯酸鈉溶液浸泡7-10分鐘進行消毒，將所述的蔬菜去皮、切分，得到一種預處理蔬菜；B)往步驟A)得到的預處理蔬菜中加入按照所述蔬菜重量計O.6-1. 0%糖與4. 0-6. 0% 食鹽，攪拌均勻，在室溫預醃製20-28h，浙幹水分，得到一種預醃製蔬菜；C)稱取食用香辛料，使用以所述食用香辛料重量計8-10倍水在溫度75-85°C下浸提 2-4h，冷卻後再添加以所述食用香辛料重量計7-9%白酒，混勻得到一種香辛料汁；D)將植物乳桿菌N13以MRS液體培養基體積計1-3%接種於MRS液體培養基中，在溫度37°C下培養20-28h，離心分離，棄去發酵上清液，餘下沉澱物用無菌水重懸，使植物乳桿菌N13活菌濃度達到108cfu/mL以上，從而得到一種菌懸液；E)往步驟B)得到的預醃製蔬菜中添加以所述預醃製蔬菜重量計12-14%在步驟C)得到的香辛料汁與1-5%在步驟D)得到的菌懸液，混勻，裝罐，密封，在室溫下發酵，直到其發酵液的PH值達3. 6-4. 0，這樣得到所述的發酵蔬菜。
7.根據權利要求3或6所述的用途，其特徵在於所述的蔬菜是一種或多種選自捲心菜、 胡蘿蔔、萵筍、甜椒、洋蔥或芹菜的蔬菜。
8.根據權利要求6所述的用途，其特徵在於所述的香辛料是一種或多種選自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。
9.根據權利要求3所述的用途，其特徵在於所述的發酵青貯飼料是採用下述方法製備的將玉米稻杆飼料原料揉切至I 4cm後待用；稱取45-55kg玉米秸杆飼料原料，把O. 5-0. 7g根據權利要求4所述的植物乳桿菌N13 乾粉製劑與200-240mL無菌水混合均勻後噴灑到所述的玉米秸杆飼料原料中，翻拌混和均勻後，裝入青貯飼料桶中壓實密封，然後在常溫條件下貯存9-12個月後即得到含植物乳桿菌N13的玉米秸杆飼料。
全文摘要
本發明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)N13及其用途。本發明植物乳桿菌N13具有耐酸性、耐膽鹽能力，對腸上皮細胞株HT-29細胞具有很高的粘附性，具有抑制EIEC生長、抑制EIEC對腸上皮細胞株HT-29細胞的粘附和侵襲的能力。用本發明植物乳桿菌N13製備的酸豆乳、發酵燕麥飲料、發酵蔬菜、發酵青貯飼料、乳酸菌乳飲料以及發酵乳具有非常好的應用前景。
文檔編號C12R1/25GK102586155SQ20121005782
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月7日 優先權日2012年3月7日
發明者劉小鳴, 劉文玉, 宋元達, 張灝, 張秋香, 王剛, 田豐偉, 範大明, 趙建新, 陳衛, 陳海琴 申請人:江南大學