快速篩查P53基因外顯子5‑8突變的體外檢測方法及應用與流程
2023-05-29 14:54:47 2
本發明涉及基因檢測方法。尤其是涉及一種快速篩查P53基因外顯子5-8突變的體外檢測方法及其應用。
背景技術：
：近年來，我國惡性腫瘤的發生率和病死率呈明顯上升趨勢，已躍居我國居民死亡病因的首位。然而，對於惡性腫瘤的早期發現、早期診斷以及防治，尚無突破性研究，部分患者就診時已處於中晚期，療效較差。因此，提高惡性腫瘤的早期診斷水平，是改善惡性腫瘤診治療效的有效出路。目前臨床上，多採用血清學檢測的方法監測血清或其他體液中的腫瘤標誌物，動態地對腫瘤的存在、發生發展及預後做出判斷。然而，任何一種科學指標都不是絕對的。腫瘤標誌物的器官特異性和腫瘤特異性較差,既存在於腫瘤中也存在於正常人群和非腫瘤患者血液和體液中,每個人對於腫瘤標誌物都有各自的基礎水平,不能單憑超過參考範圍而進行診斷。有時要藉助相關輔助檢查,對檢測結果進行仔細分析後,才能提高對腫瘤的存在、發展及預後的實用價值。同時，腫瘤標誌物濃度會受到體內代謝的很多因素影響，所以準確性也會受到影響。以腫瘤標記物甲胎蛋白(AFP)為例，除絕大多數肝癌病人的血清呈陽性外，還有31％～52％的急性肝炎、15％～58％的慢性肝炎以及11％～47％的肝硬化病人的AFP也會有大幅上升，因此不必一看到「陽性」就「色變」。當然，與此同時，甲胎蛋白陰性自感不適的患者也不能掉以輕心，還要依靠大夫聯合多項檢查直至細胞學、病理學檢查等做進一步查實和鑑別。基因是具有遺傳效應的DNA片段，支持著生命的基本構造和性能。基因雖然十分穩定，能在細胞分裂時精確地複製自己，但這種穩定性是相對的。在一定的條件下基因也可以從原來的存在形式突然改變成另一種新的存在形式，就是在一個位點上，突然出現了一個新基因，代替了原有基因，這個基因叫做突變基因。無論是鹼基置換突變還是移碼突變，都能使多肽鏈中的胺基酸組成或順序發生改變，進而影響蛋白質或酶的生物功能，使機體的表型出現異常。因此，對基因的突變進行檢測，能夠在疾病發生的早期階段被檢測出，有利於實現疾病的早發現，早診斷，早治療。HRM(高解析度熔解曲線分析)是近幾年來在國外興起的一種用於突變掃描和基因分型的最新遺傳學分析方法。它是一種高效穩健的PCR技術，不受突變鹼基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結束後直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變的分析。操作簡便快速，使用成本低，結果準確，能夠實現真正的閉管操作。比起普通的技術來說有更好的靈敏性和特異性。採用這種方法進行的突變的檢測不依賴於突變在片段中所在的位置。當片段的大小在400bp或者更小時，靈敏性最高。對於目前絕大多數的突變分析方法來說，都很難鑑定出純合子序列突變。在一些不同種類的小的擴增片段中，高解析度熔解曲線則顯示出了鑑定純合子序列突變的能力，這種方法能鑑定出大多數的純合突變。美中不足的是在進行未知突變篩查、掃描時，只能檢測到有無突變，無法確定突變在DNA片段中位置。觸底PCR(Touchdown(TD)PCR)是一種特殊技術，只需要做一次正式實驗，就可能保證此次擴增試驗在即使不是最佳也是在比較理想的條件下進行的，絕大多數情況下都可以獲得理想的擴增效果。技術實現要素：本發明的技術目的是提供一種快速篩查P53基因外顯子5-8突變的體外檢測方法，其不受突變鹼基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結束後直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變的分析。操作簡便快速，使用成本低，結果準確，能夠實現真正的閉管操作。同時針對人群快速篩查，具有高通量、速度快、可試劑盒化、檢測成本低等特點。一種快速篩查P53基因外顯子5-8突變的體外檢測方法，包括以下步驟：(1)提取外周血樣品基因組DNA；(2)設計合成用於擴增P53基因外顯子5-8的特異性引物共4對；(3)使用上述引物對樣品基因組DNA進行高解析度熔解曲線分析聯合觸底PCR，95℃預變性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50個循環；95℃1min，40℃1min，從65℃開始，以0.02℃每秒的斜率採集熔解曲線，到95℃，之後40℃10s結束，用分析軟體對採集後的曲線進行分析；(4)HRM曲線分析：如相對於陰性對照出現了單獨的峰，則為陽性結果，表明發生P53基因突變。例如附圖1、圖2、圖3中箭頭所示，相對於陰性對照出現一個單獨的峰，為陽性結果，可以表明存在P53基因突變。所述步驟(2)中的特異性引物，是針對P53基因外顯子5-8特別設計的引物，經過反覆試驗篩選和驗證，最終篩選得到，具有特異性強、擴增效率高等優點，優選的核苷酸序列分別是：所述步驟(3)中PCR的反應體系優選的是：總體積為15μL的反應體系包含：mastermix10μL；MgCl22.4μL；GCenhancer0.5μL；正向引物1μL；反向引物1μL，其餘為RNasefreeH2O。反應時，向所述反應體系中加入樣品基因組DNA、陰性對照、空白對照進行觸底PCR反應，其中陰性對照是P53野生型序列，空白對照是無DNA模板。本發明的檢測方法，還有一個明顯的技術特徵是，所述步驟(1)中外周血樣品採用幹血片收集。只需要0.5mL的外周血即可，對於待檢者來說，具有可長途運輸、保存時間長、採血簡單等優點，是基因檢測技術中一項重大的改進。同時步驟(1)中樣品基因組DNA的提取可採用商品化試劑盒提取。操作簡單易行，也方便高通量檢測時使用。本發明的檢測方法可用於快速篩查P53基因外顯子5-8突變。利用HRM聯合觸底PCR的方法，能夠實現在同一實驗條件下，對幹血片中提取得到的待檢人群的DNA中P53基因多個外顯子的突變進行檢測。實驗顯示，通過對200例實驗人群血液中P53基因5-8外顯子進行檢測，能夠成功檢測到3例受檢者血液DNA中P53基因存在突變，之後運用一代測序法對PCR產物進行檢測並與人類基因組序列進行比對後證實，這3例樣本確實存在DNA序列上的改變。證明了本發明方法的正確性。本發明的檢測方法可以應用在任意一種快速篩查P53基因突變檢測試劑盒中。優選包含用於擴增P53基因外顯子5-8的特異性引物共4對，其核苷酸序列分別如上表所示。檢測試劑盒還含有PCR試劑、陰性對照、空白對照，其中陰性對照是P53野生型序列，空白對照是無DNA模板。本發明的試劑盒具有如下優點：(1)全部引物能在同一溫度下進行穩定的PCR反應，獲取特異性的P53基因片段；(2)檢測靈敏度高，特異性強；(3)小反應體系(15μL)，標本和試劑用量少；(4)採用檢測樣本為外周血幹血片，採集容易，保存時間長，運輸容易；(5)反應簡便迅速，2小時即可獲得實驗結果，便於大樣本高通量處理；(6)試劑價格低廉，成本低。附圖說明圖1為實施例2中第68號樣本的HRM溶解曲線圖；圖2為實施例2中第105號樣本的HRM溶解曲線圖；圖3為實施例2中第160號樣本的HRM溶解曲線圖；圖4為實施例2中第68號樣本的測序結果圖；圖5為實施例2中第105號樣本的測序結果圖；圖6為實施例2中第160號樣本的測序結果圖；圖7為實施例2中陰性樣本的HRM溶解曲線圖。具體實施方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1一種快速篩查P53基因外顯子5-8突變的體外檢測方法，包括以下步驟：(1)幹血片DNA的提取總DNA提取按照磁珠法幹血斑基因組DNA提取試劑盒(天根)說明書進行，如下：1、取一塊新的96孔深孔板，然後在每孔加入三片3*3mm的幹血斑樣品。在96深孔板中加入200μL的緩衝液GA。2、加入20μL蛋白酶K溶液，渦旋震蕩10秒混勻後，放入預熱至56度的恆溫振蕩器中，900rpm恆溫震蕩裂解30分鐘。3、在上一步樣品裂解期間，向新的96孔深孔板中加入10μL磁珠懸浮液G，200μL緩衝液GB和200μL無水乙醇，抽打混勻或震蕩混勻10秒。4、樣品裂解後，將步驟3中深孔板短暫離心，冰箱裂解液完全移至步驟4中的深孔板，然後將其放入恆溫振蕩器，室溫900rpm震蕩3分鐘。5、將深孔板放置於磁力架上靜置1分鐘，待磁珠完全吸附時小心去除液體。6、將深孔板放置於磁力架上靜置1分鐘，待磁珠完全吸附時小心去除液體。7、將深孔板從磁力架上取下，加入500μL緩衝液GD，抽打混勻或震蕩混勻。8、將深孔板放置於磁力架上靜置1分鐘，待磁珠完全吸附時小心去除液體。9、將深孔板從磁力架上取下，加入500μL漂洗液PW，抽打混勻或振蕩混勻3分鐘。10、將深孔板放置於磁力架上靜置1分鐘，帶磁珠完全吸附時小心去除液體，使磁珠繼續被吸附。11、緩慢加入750μL漂洗液PWIII，儘量不要衝起磁珠，靜置20秒後用移液器小心去除液體，取下深孔板。12、加入50-100μL洗脫緩衝液TB或去離子水，抽打混勻或振蕩混勻，置於56度，孵育5-10分鐘。13、將深孔板放置於磁力架上靜置2分鐘，待磁珠完全吸附時小心將DNA溶液轉移至收集板，並於適當條件保存。(2)高解析度熔解曲線分析聯合觸底PCR高解析度熔解曲線分析的P53基因外顯子5-8的特異性引物共計4對，序列如下表所示：P53外顯子5正向引物TTACTCTTCAAGCTGTCCTC如SEQIDNo.1所示P53外顯子5反向引物CTTATGGTCATTATTACTTT如SEQIDNo.2所示P53外顯子6正向引物TACTGGAAGTTATTCGATCT如SEQIDNo.3所示P53外顯子6反向引物TGTTTACCACTAGATCTCTG如SEQIDNo.4所示P53外顯子7正向引物GTACTAATTCCTAGGTGGGC如SEQIDNo.5所示P53外顯子7反向引物CTTGTCGATCCTGACCTGTA如SEQIDNo.6所示P53外顯子8正向引物TGTATCCTGAGTATTGGTCT如SEQIDNo.7所示P53外顯子8反向引物ATCTGCTTGCGGCTCTCGCT如SEQIDNo.8所示配製總體積為15μL的PCR反應體系；體系包含：mastermix10μL；MgCl22.4μL；GCenhancer0.5μL；引物F1μL；引物R1μL，其餘為RNasefreeH2O。將配好的反應體系加入96孔板內，之後按照加樣順序，取5μL樣品、陰性對照、空白對照依次加入相應孔內，在96孔板上封膜，振蕩混勻，之後短暫離心。高解析度熔解曲線分析聯合觸底PCR反應條件：95℃預變性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50個循環；95℃1min，40℃1min，從65℃開始，以0.02℃每秒的斜率採集熔解曲線，到95℃，之後40℃10s結束，用LightCycler480所配分析軟體對採集後的曲線進行分析。如相對於陰性對照出現了單獨的峰，則為陽性結果，表明發生P53基因突變。(3)直接測序法進行驗證(此為可選步驟)用高解析度熔解曲線分析聯合觸底PCR的方法得到陽性結果的樣本，即發生P53基因突變。將發生突變的樣本剩餘的DNA進行基因測序，驗證其有無假陽性。實施例2：臨床樣品檢測採用實施例1的方法對200例體檢人群血液中P53基因5-8外顯子進行檢測，能夠成功檢測到3例受檢者血液DNA中P53基因存在突變，之後運用一代測序法對PCR產物進行檢測並與人類基因組序列進行比對後證實，這3例樣本確實存在DNA序列上的改變。200例體檢人群血液樣本，其中有3例(第68號，105號，160號)出現突變(出現了單獨的峰)，第68號樣本P53基因外顯子7疑似出現核酸序列變化(圖1)；第105號樣本P53基因外顯子6疑似出現核酸序列變化(圖2)；第160號樣本P53基因外顯子5疑似出現核酸序列變化(圖3)。經一代測序檢測，結果顯示第68號樣本P53基因coden244出現GGC/GGT同義變(圖4)；第105號樣本P53基因12759位出現C/G變異(圖5)，此變異對P53蛋白功能無影響；第160號樣本P53基因coden163出現TAC/TGC(酪氨酸/半胱氨酸)變異(圖6)。另圖7是檢測樣本中的陰性樣本的HRM溶解曲線圖，相對於陰性對照，陰性樣本的檢測曲線未出現明顯的差異。結果表明，本發明提供的檢測方法可快速檢測P53基因5-8外顯子的多種突變，適用於臨床早期腫瘤患者篩查。具有檢測靈敏度高，特異性強，反應簡便迅速，2小時即可獲得實驗結果，便於大樣本高通量處理等特點，篩查出的陽性結果再經過基因測序法確定，可以大為減少早期腫瘤篩查的困難度和檢測成本。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。序列表北京青航基因科技有限公司快速篩查P53基因外顯子5-8突變的體外檢測方法及應用P16102488PatentInversion3.5120DNA人工序列1ttactcttcaagctgtcctc20220DNA人工序列2cttatggtcattattacttt20320DNA人工序列3tactggaagttattcgatct20420DNA人工序列4tgtttaccactagatctctg20520DNA人工序列5gtactaattcctaggtgggc20620DNA人工序列6cttgtcgatcctgacctgta20720DNA人工序列7tgtatcctgagtattggtct20820DNA人工序列8atctgcttgcggctctcgct20當前第1頁1 2 3