巨噬細胞轉染方法

2023-05-30 07:50:51

專利名稱：巨噬細胞轉染方法
技術領域：
本發明涉及單核細胞的轉染方法及其治療用途。
背景技術：
單核細胞在免疫反應中起著核心作用。單核細胞成熟後成為巨噬細胞和樹突細 胞，是機體的主要抗原呈遞細胞。此外，作為血管生成過程的組成部分，腫瘤生長時，它們產 生巨噬細胞吸引趨化因子，將單核細胞引到腫瘤。因而，一旦單核細胞被特異性地打中，就 可能立即用於將治療性基因產物遞送到腫瘤細胞或者通過其優良的抗原呈遞特性而產生 治療性或預防性免疫反應。單核細胞衍生的細胞，通常在機體內巡視以尋找外來的、非自身的結構，典型的是 微生物。單核細胞吞噬這些微生物，然後在其溶酶體中將這些被吞噬的微生物消化成較小 的抗原部分。由此形成的抗原經過循環重新回到表面，用於呈遞到免疫系統的體液和細胞支臂。巨噬細胞是組織內的細胞，起源於單核細胞。由於它們在宿主抵抗病原體的非特 異性和特異性防禦中起重要作用而尤其令人關注。最近發現，巨噬細胞在宿主中也具有支 持性重建功能。例如，Schwartz 等人(Journal of Neurotrauma，23 360-370，2006)證明， 局部移植的活化巨噬細胞促進受損脊髓的功能恢復。人們相信，初始小膠質細胞對中樞神 經系統(CNS)損傷的應答，超出了 CNS對其損傷的耐受能力。因此，基於免疫的幹預，例如 通過局部注射活化巨噬細胞，證明可將急性脊髓損傷(SCI)後的神經損害減至最小。Wagner等人的第6，875，612號美國專利(其通過引用結合到本文中)記載了微珠 載體直接進入單核細胞內可將治療性基因產物遞送到腫瘤細胞。然而，該』 612專利沒有記 載應用酵母聚糖之類的酵母細胞壁顆粒使核酸直接進入單核細胞起源的細胞內。酵母聚糖是酵母細胞壁的一種不溶性多糖成分。以前的出版物沒有揭示酵母聚 糖還參與(1)誘導細胞因子或促炎細胞因子的釋放；(2)誘導蛋白質磷酸化和肌醇磷酸形 成；(3)花生四烯酸動員；(4)補體旁路的激活；和(5)細胞周期蛋白D2水平的提高，表明細 胞周期蛋白D2在巨噬細胞活化中的作用(Miyasato等，Int. Arch. Allergy Immunol. 104 24-26,1994)。例如，據報導酵母聚糖顆粒能在巨噬細胞中通過Toll樣受體(例如TLR2 和TLR6)和dectin-1誘導炎症信號，dectin-1是一種結合0 _葡聚糖的受體，對巨噬細 胞的吞噬作用非常重要。酵母聚糖也參與誘導炎症反應，例如巨噬細胞中的TNF-a產生 和 NF-kB 活化(Underhi 11, Journal of Endotoxin Research，9 176-180，2003 ;Sato 等， J. Immunol.，171 :417_425，2003 ；Dillon 等，J. Clin. Invest. 116 :916_928，2006)。本發明的發明人預料不到地發現，相對於吞噬包含不消化顆粒或由非天然源製成的顆粒(例如鐵磁珠)的組合物，巨噬細胞可以更好地耐受吞噬包含附著於可消化顆粒 (例如酵母細胞壁顆粒)的核酸成分的組合物。因此，本發明通過利用巨噬細胞進行基因傳 遞相對於現有技術策略取得了進步。「更好的耐受性」可通過各種檢測代謝和活力的測定法 進行定量。例如，可以用四唑鐺染料(MTT染色)監控顆粒載體被攝取後巨噬細胞的存活和 活力情況，並使用臺盼藍排除分析法評價細胞死亡情況。發明概述第一方面，本發明提供一種用於直接進入單核細胞內的組合物。所述組合物包含 (1)核酸成分，(2)溶酶體規避成分(lysosome evadingcomponent), ^P (3)能被吞噬的可 fflftJSf立(digestible particle that can bephagocytosed) 。 ftH^■胃巾， 成分包括非複製和/或非感染形式的病毒，該病毒所含的核酸可編碼蛋白質。這種非複製 和/或非感染形式的病毒可作為溶酶體規避成分起作用，並因此任選額外的第二溶酶體規 避成分。在有些實施方案中，該核酸成分可以是DNA或RNA。在一個實施方案中，該核酸可 編碼蛋白質例如抗原或其它治療蛋白或RNAi構建體。在另一個實施方案中，該核酸成分包 含編碼在含有核啟動子(例如CMV啟動子或低氧誘導型啟動子)的表達載體上的核酸。在 又一個實施方案中，該核酸可編碼在胞質載體例如T7載體系統上。在其它實施方案中，溶酶體規避成分可以是病毒或病毒組分，例如腺病毒或者腺 病毒五鄰體蛋白。在某些實施方案中，所述能被吞噬的顆粒是一種可消化的顆粒，大小與單核細胞 通常攝取的微生物結構相似。在一個實施方案中，該顆粒大小為約0.05微米(ym)至約 5. Oum,約 0. 05 ii m 至約 2. 5 ii m，約 0. 1 ii m 至約 2. 5 ii m，約 1. 0 ii m 至約 2. 5 ii m，約 1. 0 ii m 至約2. 0 ii m或者約1. 0 ii m至約1. 5 ii m。術語「約」在本文指的是士0. 25 u m。優選地，該
顆粒來自天然源，例如微生物顆粒結構。例如，能被吞噬的顆粒是酵母細胞壁顆粒，例如酵 母聚糖、或葡聚糖或來自革蘭氏陽性菌的肽聚糖。然而，其它合適的能被吞噬的顆粒包 括瓊脂糖和菊粉。在有些實施方案中，所述組合物可能還包含核酸保護成分，例如魚精蛋白 (protamine)、多聚精氨酸、多聚賴氨酸、組蛋白、組蛋白樣蛋白、合成聚陽離子聚合物或以 適當的包裝序列包含在RNA序列中的逆轉錄病毒核心蛋白。這些成分可以任何可能的附著方式附著於可消化顆粒。在一個實施方案中，核酸 和溶酶體規避成分以抗體附著的形式附著於顆粒。在另一個實施方案中，核酸和溶酶體規 避成分以(鏈黴)抗生物素和生物素之間的相互作用形式附著於顆粒。在再一個實施方案 中，核酸用作多結合載體。在一個相關方面，本發明提供一種轉染單核細胞的方法。該方法包括使單核細胞 例如樹突細胞或巨噬細胞接觸上述組合物。另一方面，本發明提供一種將生物材料定向遞送到單核細胞中的方法，該方法包 括使單核細胞例如樹突細胞或巨噬細胞接觸上述組合物。又一方面，本發明提供一種基因治療方法，包括給有需要的病人使用上述組合物， 其中核酸成分包括編碼治療蛋白(例如抗腫瘤蛋白)的核酸。本發明提供一種基因疫苗 接種方法，包括給有需要的病人使用上述組合物，其中核酸編碼抗原，例如過敏原、病毒抗原、細菌抗原或來源於寄生蟲的抗原。本發明也提供一種癌症治療方法，包括給有需要的病 人使用上述組合物，其中核酸是抗腫瘤基因，例如抗血管生成因子、免疫調節因子或抗炎因 子。再一方面，本發明提供一種組織修複方法，例如脊髓修複方法，包括給有需要的病 人使用上述組合物。本發明也提供一種免疫調節方法。例如，本發明也考慮了通過直接向 關節注射藥物治療類風溼性關節炎等慢性炎性疾病，以及治療自身免疫性炎症等其它形式 的疾病。在以上描述的方法中，所述組合物可靜脈內或皮下給予。例如，單核細胞可以用綴 合所述顆粒的病毒(例如綴合酵母聚糖的病毒)在體外進行轉染，然後經靜脈重新輸回患 者體內。這種給藥方式可能最適合於靶向腫瘤。或者，可通過局部應用，直接注射或顯微外 科法，給予綴合所述顆粒的病毒。這種給藥方法可能最適合於脊髓修復或治療類風溼性關 節炎。本領域的技術人員應該知道哪種給藥方式將會適合於治療給定疾病。附圖簡述

圖1是含有siRNA的腺病毒載體，用於I k日基因與綠色螢光蛋白(GFP)的融合。圖2是吞噬了用於IKB的GFP-RNAi構建體的巨噬細胞(MB_GFP_RNAi和 Z-GFP-RNAi)照片。㈧鏈黴抗生物素蛋白包被的磁珠(「MB」)附著於生物素醯化GFP-RNAi 腺病毒載體上，或(B)酵母聚糖(「Z」)顆粒附著於GFP-RNAi腺病毒載體上。圖3示意用酵母聚糖綴合的腺病毒(Ad)載體轉染的巨噬細胞培養基的細胞毒活 性。這些細胞的培養基是在48小時後收集到的，濃縮後進行了抗腫瘤活性測試。這些數據 顯示，巨噬細胞被酵母聚糖綴合的siRNA載體成功地轉染並活化。發明詳述引言本發明提供一種用於轉染單核細胞的組合物及相關的使用方法。按照本發明，用 於轉染單核細胞的組合物一般由附著於可被吞噬的可消化顆粒的核酸成分和溶酶體規避 成分組成。在一個實施方案中，這種可被吞噬的可消化顆粒是來自於天然源的顆粒，優選來 源於微生物的顆粒，最優選的是酵母細胞壁顆粒。本發明的組合物在本文也稱為「含有可消 化顆粒的組合物」。在一個實施方案中，核酸成分也可以是溶酶體規避成分。本發明的組合物吸引單 核細胞起源的細胞，例如樹突細胞和巨噬細胞，這使得本發明組合物在基因醫學方法例如 基因疫苗接種、基因治療和癌症治療中非常有用。單核細胞是吞噬性免疫細胞，可攝取微生物類顆粒狀結構。本發明利用了這一特 性，因為載體在「外表」似微生物的基質上提供。可消化顆粒可消化顆粒的優選大小是近似單核細胞通常所攝取的微生物結構的大小。在一 個實施方案中，該顆粒為約0. 05 ii m至約5. 0 ii m，約0. 05 y m至約2. 5 y m，約0. 1 y m至約 2. 5um,約 1. 0 ii m 至約 2. 5 u m,約 1. 0 ii m 至約 2. 0 ii m 或約 1. 0 ii m 至約 1. 5um0 術語「約」 在本文指的是士0.25i!m。優選地，所述可消化微粒是來自於天然源的顆粒，例如來源於微 生物的顆粒。特別優選的顆粒是酵母細胞壁顆粒。在一個實施方案中，酵母細胞壁顆粒是 酵母聚糖顆粒。酵母聚糖(也稱為酵母聚糖A)已經商品化，可以從Sigma-Aldrich公司等各種公司購得。酵母聚糖顆粒典型大小約2.0 μ m。另一方面，出於生產原因，優選稍微大一些的顆粒，因為它們很少粘在一起，所以用較大顆粒時清洗到沒有結合成分較容易。可消化顆粒不受形狀或質地的限制。一般而言，顆粒可以具有任何形狀、尺寸或材 質，只要含有可消化顆粒的組合物可被單核細胞例如樹突細胞和巨噬細胞吞噬即可。本發明的發明人預料不到地發現，相對於被吞噬的合成珠，被吞噬的可消化顆粒 似乎表現出被巨噬細胞更好地耐受。事實上，正如圖2所示，這種吞噬了附著於AD-GFP載 體上的酵母聚糖顆粒的巨噬細胞的外觀，比吞噬了附著於生物素醯化AD-GFP載體上的鏈 黴抗生物素蛋白包被的磁珠的巨噬細胞的外觀更自然。核酸成分本發明的可消化顆粒通常附著了核酸成分。核酸成分包括編碼蛋白質或RNAi構 建體的核酸，可以由DNA、RNA或DNA和RNA兩者組成。這種核酸成分也可包括含核酸載體。 核酸成分通常包含翻譯和/或轉錄所必需的信號(即它可最終編碼蛋白質或RNA產物)。技術人員立即就會明白，大量的蛋白質可由所述核酸編碼。一般來講，它們是抗原 或者是抗腫瘤蛋白，例如抗血管生成蛋白和白介素。該類蛋白主要通過巨噬細胞被定位在 緊靠腫瘤的位置。用於疫苗應用的示例性抗原包括過敏原、病毒抗原、細菌抗原和來源於寄生蟲的 抗原。優選的抗原包括腫瘤相關抗原，為技術人員所熟知(例如癌胚抗原、前列腺特異性膜 抗原、黑素瘤抗原、腺癌抗原、白血病抗原、淋巴瘤抗原、肉瘤抗原、MAGE-I、MAGE-2、MART-I、 Melan-A, p53、gplOO、結腸癌相關抗原、乳腺癌相關抗原、MucU Trp_2、端粒酶、PSA和腎癌 相關抗原)。病毒抗原也是優選的，合適的病毒抗原包括HIV、EBV和皰疹病毒。在一個實 施方案中，核酸編碼線性gp41表位插入片段(LLELDKWASL)，它已被鑑定為用於改進HIV-I 包膜蛋白免疫原性的有效構建體(Liang等，Vaccine，16 ；17 (22) :2862_72，1999年7月)。如上文所提供的，核酸優選編碼在表達載體上，該表達載體能夠表達核酸的蛋白 產物。該載體通常還包含與編碼序列有效連接的調節序列，包括例如啟動子。該載體還可 包含選擇標記序列，例如供體外細菌或細胞培養系統中繁殖用。優選的表達載體包含複製 起點、合適的啟動子和增強子，還包含任何必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接 供體和受體位點、轉錄終止序列和5'側翼非轉錄序列。衍生自SV40或巨細胞病毒(CMV) 的病毒基因組的DNA序列，例如SV40起點、早期啟動子、增強子、剪接和聚腺苷酸化位點，均 可用來提供所需要的非轉錄遺傳元件。對於插入的靶基因編碼序列的有效翻譯，也需要特定的起始信號。這些信號包括 ATG起始密碼子和毗鄰序列。如果核酸成分包含其自身的起始密碼子並且毗鄰序列插入到 適當的表達載體中，則可能不需要額外的翻譯控制信號。然而，如果僅僅用了一部分可讀框 (ORF)，則必須提供外源翻譯控制信號，或許包括ATG起始密碼子。而且，起始密碼子必須與 所需編碼序列的讀框相協調，從而保證整個靶標都被翻譯。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可以是不同的來源，既可以是天然的也可以 是合成的。表達效率可通過包括合適的轉錄增強子元件、轉錄終止子等而得到提高(參 見 Bittner 等，Methods in Enzymol. 153 :516_544(1987))。一些合適的表達載體參見 Sambrook 等，MolecularCloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor,N.Y. (1989)，其公開的內容通過引用結合到本文中。必要時，為提高表達和促進正確的 蛋白質摺疊，可優化序列的密碼子環境和密碼子配對，參見Hatfield等人在美國專利第 5，082，767號的解釋。啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、 來自逆轉錄病毒的LTR和小鼠金屬硫蛋白-I啟動子等。優選的啟動子是那些靶特異性的 啟動子，即允許特定基因在治療所靶向的特定區域內表達的啟動子。例如，當靶向腫瘤細胞 時，本發明所用的合適啟動子將是低氧誘導型啟動子。示例性的載體包括pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXTl、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、 pMSG和pSVL (Pharmacia)。選擇標記包括CAT (氯黴素轉移酶)。優選的載體也包括胞質載 體，如T7載體系統。參見Wagner等人的美國專利第5，591，601號(1997年1月7日)。溶酶體規避成分除了核酸成分以外，酵母細胞壁顆粒也常附著有溶酶體規避成分。溶酶體規避成 分的作用是幫助核酸成分逃避溶酶體的惡劣環境。除本文所公開的內容以外，技術人員應 當知道這類分子的眾多實例。當單核細胞攝取到大的抗原時，就形成了吞噬抗原的吞噬小泡(吞噬體)。接下 來，單核細胞所含的特化溶酶體就與新形成的吞噬體融合。在融合時，被吞噬的大抗原暴露 在若干高活性分子以及濃縮溶酶體水解酶混合物中。這些高活性分子和溶酶體水解酶消化 吞噬體的內含物。因此，由於溶酶體規避成分附著於顆粒上，同樣附著於所述顆粒上的核酸 就逃避了被溶酶體中的物質所消化掉，最終完好無缺地進入單核細胞的胞質中。現有的系 統沒有認識到這一特徵的重要性，因此，所獲得的表達水平要比本發明的低得多。參見Falo 等人的W097/11605 (1997)。應該注意到，術語「溶酶體規避成分」包括上文所描述的融合溶 酶體/吞噬體。溶酶體規避成分是能夠躲避或破壞溶酶體的任何成分。例如，溶酶體規避成分可 包括蛋白質、糖類、脂質、脂肪酸、仿生聚合物、微生物及其組合。應當注意到，術語「蛋白 質」包括含有任何數目的胺基酸的聚合分子。因此，本領域普通技術人員應該知道「蛋白 質」包括肽，肽一般被理解為「短的」蛋白質。優選的溶酶體規避成分包括蛋白質、病毒或病 毒部分。舉例來說，腺病毒五鄰體蛋白就是一種熟知的複合體，它能使病毒躲避/破壞溶酶 體/吞噬體。因此，完整的腺病毒或分離的五鄰體蛋白或其部分(參見例如Bal等，Eur J Biochem267 6074-81 (2000))，均可用作溶酶體規避成分。由流感病毒血凝素亞基HA-2的 N-端序列衍生而來的融合肽，也可用作溶酶體規避成分(Wagner等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 7934-7938,1992)。其它優選的溶酶體規避成分包括仿生聚合物，例如聚(2-丙基丙烯酸)(PPAAc)， 它已顯示出提高細胞轉染效率，由於增加了包含目標質粒的綴合物的核內體釋放(參見 Lackey等，Abstracts of ScientificPresentations :The Third Annual Meeting of the American Society ofGene Therapy,Abstract No. 33, May 31，2000-Jun. 4，2000，Denver， Colo.)。Stayton等人論述了本發明設想的其它溶酶體規避成分的實例(Stayton等， J.Control Release 1 ；65 (1-2) :203_20，2000)。核酸保護成分除上述通常附著於可消化顆粒上的成分以外，不管是直接附著還是通過彼此附著(例如編碼核酸的重組腺病毒)，其它成分也可以附著於顆粒上或者附著於顆粒的成分上。 例如，可將DNA保護成分任選地加入到上文所述的含有可消化顆粒的組合物中，尤其是在 核酸成分沒有與病毒或其部分締合的情況下。通常，這種DNA保護成分不直接地附著在可消化顆粒上。核酸保護成分包括任何可保護可消化顆粒結合DNA或RNA在溶酶體破壞之前 或溶酶體破壞期間、在短暫暴露於水解酶期間不被消化的成分。優選的核酸保護成分包括 魚精蛋白、多聚精氨酸、多聚賴氨酸、組蛋白、組蛋白樣蛋白、合成聚陽離子聚合物和以適當 的包裝序列包含在RNA序列中的逆轉錄病毒核心蛋白。在本發明的一個實施方案中，含有可消化顆粒的組合物包含(1)重組病毒，任選 非複製和/或非感染形式，含有編碼蛋白的核酸；和(2)能被吞噬的可消化顆粒。病毒可以 是RNA病毒(如逆轉錄病毒)或DNA病毒(如腺病毒)。在這個實施方案中，病毒本身優 選能夠使溶酶體破壞。換句話說，核酸和溶酶體規避成分均為病毒的膜內在部分。或者，病 毒可能不能夠使溶酶體破壞。在這樣的一種情況下，自然應當加入單獨的溶酶體規避成分。 優選的病毒包括HIV、腺病毒、新培斯病毒(Sindbis virus)以及它們的雜合和重組形式。 特別優選的病毒是HIV-腺病毒雜合體，該雜合體基本上是經工程改造來表達HIV抗原的重 組腺病毒。可以採用常規的方法，使這類病毒直接附著於可消化顆粒上。參見Hammond等， Virology, 254 37-49, (1999)。在本發明中，由於病毒感染對於核苷酸成分到達單核細胞的胞質內並不是必不可 少的，因此，病毒也可以是複製/感染缺陷型的。由本發明提出的一種產生複製/感染缺陷 型腺病毒的方法，是改變病毒纖維蛋白。本發明中可以使用這樣一種病毒，該病毒的纖維蛋 白通過特異性突變進行了工程改造，使得該纖維蛋白與抗體結合而不與其同源(cognate) 細胞受體結合。由本發明提出的另一種產生複製/感染缺陷型病毒的方法，是旨在引起病毒中負 責感染性的成分發生變性。以腺病毒為例，纖維蛋白可以在病毒的製備過程中被破壞；對於 HIV來講，被破壞的可能是包膜(env)蛋白。由本發明提出的一種產生複製/感染缺陷型逆 轉錄病毒的方法，需要去除逆轉錄病毒的外膜，使得僅逆轉錄病毒的核心顆粒保留下來。如 果按上述方法製備的複製/感染缺陷型病毒附著於酵母細胞壁顆粒上，則如上所述的RNA 保護成分也可附著於所述顆粒上。在一些治療性實施方案中，核酸保護成分對於使載體穩定地整合到靶細胞的染色 體上是有益的。舉例來說，一種用於達到穩定整合的方式是通過利用腺病毒雜合體。這樣的 腺病毒雜合體包括例如攜帶逆轉錄病毒5'和3'長末端重複(LTR)序列(該序列側接編 碼治療性或抗原性核酸或蛋白質的DNA成分)和逆轉錄病毒整合酶基因的腺病毒載體(參 見Zheng等，Nature Biotechnology，18 176-180，2000)。在其它實施方案中，優選瞬時表 達，並且可以使用胞質病毒如新培斯病毒。在這樣的情況下，若病毒沒有天然存在的溶酶體 規避成分，則需要加入溶酶體規避成分。例如，對於新培斯病毒或其它類似病毒，為了這一 目的，可以對其進行工程改造以表達全部或部分腺病毒五鄰體蛋白。各成分附著於顆粒的方法以上論述的各成分附著於載體顆粒綴合物上是以各種方式完成的。基於上述觀 點，不同的「成分」包括核酸和溶酶體規避成分，二者可能同時存在於一個病毒中。優選的 附著方法包括抗體附著、生物素_(鏈黴)抗生物素相互作用和化學交聯。載體顆粒綴合物可採取化學方法附著的抗體、(鏈黴)抗生物素或者其它選擇性附著位點來製備。抗體附著可以通過任何抗體相互作用來實現。這些抗體包括但不限於多克隆抗 體、單克隆抗體(HiAb)、人源化抗體或嵌合抗體、單鏈抗體(包括單鏈Fv(SCFv)片段)、Fab 片段、F(ab' )2片段、由Fab表達文庫產生的片段、抗獨特型抗體(抗Id抗體)、表位結合 片段和上述任何一種抗體的人源化形式。一般而言，多克隆抗體和單克隆抗體的製備技術以及產生所需抗體的雜交瘤 的製備技術均為本領域所熟知(Campbell，A.M.，Monoclonal Antibody Technology Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands(1984) ；St. Groth 等，J. Immunol. Methods35 1-21(1980) ；Kohler 禾口 Milstein， Nature 256 :495_497(1975))， thetrioma technique,
the human B-cell hybridoma technique (三重雜交瘤技術-人體B細胞雜交瘤技術)
(Kozbor 等，Immunology Today 4:72(1983)) ；Cole 等，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體與癌症治療)，Alan R. Liss，Inc. (1985)，第 77-96 頁)。本發明所包括的抗體附著的一個實例，包括單一抗體以化學方法附著於可消化顆粒上，可消化顆粒包含在組合物中。該抗體對待附著於顆粒的成分有特異性。或者，可以使 用兩種抗體。在這種情況下，附著於可消化顆粒的第一種抗體對第二種抗體來說有特異性， 而第二種抗體對附著於可消化顆粒的成分來說有特異性。因此，這種成分特異性抗體與成 分結合，抗體反過來又被顆粒結合抗體所結合。例如，山羊抗小鼠抗體或兔抗小鼠抗體可以 與顆粒結合，而小鼠單克隆抗體則用來結合特異性成分。在抗體附著的另一個實例中，使用A蛋白或任何類似的對抗體具有親和力的分 子。在該實例中，可消化顆粒用結合抗體的A蛋白包被，而該抗體反過來又被待附著於顆粒 的成分所結合。通過生物素_(鏈黴)抗生物素相互作用的附著例如可以通過以下方法來實現把 抗生物素附著到可消化顆粒並把生物素附著到待附著於顆粒的成分。化學交聯也可通過技 術人員已知的常規方法來實現。另一種附著機制包括把核酸作為多結合載體。合成的夾子(gripper)蛋白核酸 (PNA)寡核苷酸設計用來特異性結合不同的核酸序列。PNA是一種具有肽主鏈而非脫氧 核糖磷酸主鏈的多核酸類似物。它們可以直接地附著於可消化顆粒或衍生化後方便附著， 從而提供附著核酸的序列特異性工具。每個寡核苷酸夾子都可以衍生化或附著於不同的 配體或分子，並設計用於結合不同的核酸序列。人們相信，PNA通過Hoogsteen鹼基配對 相互作用而與DNA相互作用，從而形成了穩定的PNA-DNA-PNA三鏈體鉗(triplex clamp) (Zelphati 等，BioTechniques，28 :304_316，2000)。因此，在一個實施方案中，一個夾子被用於使核酸成分與顆粒結合，另一個夾子被 用於使溶酶體規避成分與核酸成分結合。多次這樣的重複都是可行的。例如，包含生物素 的「夾子」可以是在一個位點與核酸特異性結合的序列。通過生物素-抗生物素相互作用 而發生附著到用抗生物素包被的顆粒。在核酸的另一個位點上，另一個具有溶酶體/吞噬 體規避成分的「夾子」是特異地結合的序列。任選地，具有DNA保護成分的「夾子」可以是 在又一個位點與核酸特異地結合的序列。示例性的寡核苷酸夾子現有技術已有描述。對於病毒附著到可消化顆粒而言，這可通過對病毒進行工程改造以在其表面表達某些蛋白來完成。例如，HIV包膜蛋白可被腺病毒五鄰體蛋白或其部分替代。重組病毒則 可通過抗五鄰體抗體而附著，其中，例如附著到另一抗體或A蛋白所介導的顆粒。在這個實 施方案中，五鄰體蛋白也可用作溶酶體規避成分。劑型含有可消化顆粒的組合物可製成用於胃腸外給藥的劑型，胃腸外給藥例如局部使 用(直接注射或者顯微外科法)、肌內或皮下注射。或者，將單核細胞用含有可消化顆粒的 組合物在體外進行轉染，然後再經靜脈重新輸回患者體內。注射用劑型可為單位劑型，例如安瓿或多劑量容器，任選加有防腐劑。組合物可以 製成在油或水溶媒中的混懸劑、溶液劑或乳劑等劑型，並且可以含有懸浮劑、穩定劑和/或 分散劑等配方劑(formulatoryagent)。含有可消化顆粒的組合物也可使用藥學上可接受的 賦形劑製成。這樣的賦形劑為本領域所熟知，但通常為生理上可耐受的水溶液。生理上可 耐受的溶液基本上是無毒的溶液。優選的賦形劑不是惰性的就是增強性的。治療方法本發明的含有可消化顆粒的組合物能吸引單核細胞。因此，它們可用於任何應用， 包括將核酸成分選擇性導入單核細胞中，包括基因疫苗接種、癌症治療和基因治療。典型的 方法需要使單核細胞接觸含有可消化顆粒的組合物。含有可消化顆粒的組合物可以在體內或體外接觸單核細胞。因此，既考慮了體內 (in vivo)方法又考慮了先體外後體內(ex vivo)方法。就體內方法而言，含有可消化顆粒 的組合物一般是通過胃腸外，通常為靜脈內、肌內、皮下或皮內給予。例如，可以通過快速推 注或連續滴注進行給藥。就先體外後體內方法而言，單核細胞先在體外進行接觸，然後再將 接觸後的細胞給予患者。這類細胞同樣也是經胃腸外、典型的是通過滴注給予。在疫苗接種領域，單核細胞，包括樹突細胞和巨噬細胞在內，被認為是「專職」抗原 呈遞細胞(APC)，因此，它們是基因疫苗表達的理想部位。眾所周知，抗原在APC內的表達要 比在任何其它細胞類型內的表達，在產生非常強的細胞免疫應答方面有效得多。因此，本發 明的含有可消化顆粒的組合物指導表達接種抗原至「專職」抗原呈遞細胞(單核細胞)的 能力顯著地提高了基因疫苗的效率。本發明相對於現有技術疫苗具有顯著的進步，這是因為巨噬細胞吞噬可消化顆粒 的耐性優於吞噬磁珠。同樣，含有可消化顆粒的組合物可以直接注射到患者體內或單核細 胞來源的靶細胞，如巨噬細胞和樹突細胞。因此，含有可消化顆粒的組合物可以像常規疫苗 一樣使用，因為所需的技術水平較低，所以顯著地降低了成本。而且，可以預見，改變給藥途 徑也可以改變單核細胞靶向。典型的基因疫苗接種方法(包括本發明組合物)，包括給予患者含有可消化顆粒 的組合物，一般是皮下或靜脈內注射。或者，可以使單核細胞先在體外接觸本文所述的含有 可消化顆粒的組合物，然後將接觸後的單核細胞本身經胃腸外給予患者。另外，這種先體外 後體內方法可通過分離的T淋巴細胞進行改進，即利用經過接觸的單核細胞先在體外產生 抗原特異性細胞毒性T細胞，然後可以將其給予患者。技術人員對這樣的策略十分熟悉。除疫苗接種策略得到改進以外，採用本發明的含有可消化顆粒的組合物將基因表 達靶向單核細胞譜系，對癌症治療來說是有效的。本發明所涵蓋的一種癌症治療類型包括 將治療基因靶向腫瘤。眾所周知，由於腫瘤，原發性腫瘤和轉移腫瘤類似，長到直徑超出幾個毫米就開始缺氧，因此它們會分泌信號蛋白來引發一些必要事件使其繼續存活。這些事 件包括分泌出誘導血管生成的信號物。作為血管生成誘導機制的一部分，缺氧的腫瘤分泌 出一種其功能是將單核細胞吸引到腫瘤的信號傳導趨化因子蛋白。單核細胞被吸引到生長 中的腫瘤部位，在此變成巨噬細胞並協助誘導腫瘤的血管生成作用。因此，治療基因靶向腫 瘤的有效方法，包括給予癌症患者有效量的、含有抗腫瘤基因的含可消化顆粒組合物，或者 直接給予或者通過離體(ex vivo)接觸後的單核細胞給予。含有被吞噬的含可消化顆粒組 合物的單核細胞將被吸引到腫瘤生長發育部位，並且將治療性腫瘤基因選擇性地遞送到腫 瘤。在一個實施方案中，治療基因處於低氧誘導型啟動子的控制之下。在另一個實施方案中，抗腫瘤基因編碼抗血管生成因子，如內皮抑制素或血管生 成抑制素。這樣的治療將會被認為是非常高效的，因為它利用了單核細胞作為抗血管生成 因子的傳遞載體。在再一個實施方案中，抗腫瘤基因可以是免疫調節因子或抗炎因子。可以預見 IL-2和IL-12等免疫調節因子。此外，抗炎因子不僅可用於治療腫瘤，而且可用於治療關節 炎等慢性炎性疾病。本發明的抗炎作用，和抗腫瘤作用一樣，依賴於單核細胞到達特定組織 的能力。眾所周知，單核細胞是被吸引到炎症反應部位的，同在關節炎中的一樣。其它示例 性的免疫調節因子和抗炎因子包括GM-CSF和可溶性TNF- a受體。本文所描述的本發明組合物的另一種用途是傳統的基因治療。包括本發明在內的 典型的基因治療方法，包括給予患者包含附著於蛋白質編碼核酸的酵母細胞壁顆粒的組合 物，或者給予含有該組合物的單核細胞(例如巨噬細胞或樹突細胞)。下面的非限制性實例僅用於說明，不應視為是對本發明的限制。在本發明範圍內 有許多明顯的變化。實施例1本實施例證明用與顆粒攜帶物偶聯的腺病毒_載體轉染巨噬細胞。1.腺病毒載體與鏈黴抗生物素蛋白_磁珠的偶聯腺病毒(Ad)顆粒(懸浮於PBS中)用Sulfo-NHS-LC-生物素進行生物醯化，以Ad 顆粒與磁珠之比約為10的比例加入到鏈黴抗生物素綴合的磁珠(MB)中達2小時。Ad-MB 綴合物用PBS充分洗滌後貯存於4°C備用。2.腺病毒載體與酵母聚糖的偶聯2. 1.用於綴合的酵母聚糖的衍生化酵母聚糖的糖基被偏高碘酸鈉輕度氧化，再加入乙二酸二醯胼(ADH)引入氨基。 所得綴合物因加入氰基硼氫化鈉而穩定。經ADH改性的酵母聚糖與SPDP(3-(2-吡定基二 硫)丙酸 N-琥珀醯亞胺酯(N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate))進一步 反應，每個顆粒引入大約106活性保護巰基，用PBS充分洗滌後貯存於4°C備用。2.2.用於綴合的腺病毒載體對酵母聚糖的改性Ad顆粒與SPDP反應2小時引入保護巰基，隨後採用旋轉層析和Zeba旋轉柱 (Pierce)，從反應副產物中純化出來。2. 3.腺病毒載體與改性酵母聚糖的偶聯如步驟2. 1所述的改性酵母聚糖中的保護巰基被二硫蘇糖醇輕度還原30分鐘，充 分洗滌以去除殘留的試劑。隨後，每個酵母聚糖顆粒加入10個左右的如步驟2. 2所述改性的Ad顆粒，反應過夜，在酵母聚糖和Ad顆粒間形成了穩定的二硫鍵。Ad-z (酵母聚糖)綴 合物用PBS充分洗滌後貯存於4°C備用。3.小鼠腹膜巨噬細胞用顆粒Ad-載體轉染將巰基乙酸酯(鹽)誘發的小鼠腹膜巨噬細胞接種到裝有無血清培養基的96孔 培養板各孔中，密度為105個細胞/孔，貼壁培養3個小時，然後洗滌去除非貼壁細胞。其 後，按照每個巨噬細胞約4個顆粒的比例加入Ad-MB或Ad-Z綴合物(大約相當於40個Ad 顆粒)，在37°C下孵育24小時。此後，用螢光顯微鏡法監測轉染效率，即由Ad-載體引入的 GFP轉基因的表達。實施例2本實施例證明由腺病毒介導的基因轉移刺激巨噬細胞抗腫瘤活性的分泌。巰基乙酸酯(鹽)誘發的小鼠腹膜巨噬細胞用Ad-Z(酵母聚糖)_載體轉染48小 時，比例為每個巨噬細胞約4個酵母聚糖顆粒(大約相當於40個Ad-顆粒)。此後，收集培 養基，經過濾(0. 22 u m)澄清，經超濾(截止點為lOkDa)濃縮50倍，對HEPES緩衝鹽水溶液 (HBS)透析。將經濃縮的巨噬細胞培養上清液的連續稀釋液與YAC-1小鼠淋巴瘤細胞一起 孵育40小時。其後，活的腫瘤細胞用MTT染色，用光度法測定樣品的相對細胞毒性(相對 於與HBS —起孵育的對照)。細胞毒性表示為單位/毫升(U/ml)，lU/ml定義為導致50% 細胞毒性的濃度。未刺激和未轉染的巨噬細胞的培養上清液、或者用細菌脂多糖(LPS)刺 激的巨噬細胞的培養上清液，分別用作陽性對照或陰性對照。結果顯示，對於I k B，用兩種 不同的RNAi構建體的混合物(Z-Ad406和Z-Ad407)轉染後，腫瘤細胞毒活性的分泌顯著增 強了，而缺乏RNAi構建體(Z-AdGFP)的對照Ad-Z-載體僅僅使巨噬細胞腫瘤細胞毒活性的 分泌略微增強。
權利要求
一種直接進入單核細胞內的方法，該方法包括使所述單核細胞接觸包含以下成分的組合物(1)核酸成分，(2)溶酶體規避成分，和(3)能被吞噬的可消化顆粒。
2.權利要求1的方法，其中所述能被吞噬的可消化顆粒來自天然源。
3.權利要求2的方法，其中所述能被吞噬的可消化顆粒來自微生物源。
4.權利要求2的方法，其中所述能被吞噬的可消化顆粒是酵母細胞壁顆粒。
5.權利要求1的方法，其中所述單核細胞是巨噬細胞。
6.權利要求1的方法，其中所述單核細胞是樹突細胞。
7.權利要求1的方法，其中所述核酸選自DNA和RNA。
8.權利要求1的方法，其中所述核酸編碼在表達載體上。
9.權利要求5的方法，其中所述表達載體含有核啟動子。
10.權利要求6的方法，其中所述啟動子是低氧誘導型啟動子。
11.權利要求1的方法，其中所述核酸編碼蛋白質或RNAi構建體。
12.權利要求8的方法，其中所述蛋白質是抗原。
13.權利要求1的方法，其中所述溶酶體規避成分是非感染性病毒或病毒的非感染性 組分。
14.權利要求10的方法，其中所述病毒是腺病毒。
15.權利要求10的方法，其中所述病毒是非複製型的。
16.權利要求10的方法，其中所述溶酶體規避成分是仿生聚合物。
17.權利要求1的方法，其中所述可消化顆粒大小在約0.05 y m至約5. 0u之間。
18.權利要求1的方法，其中所述可消化顆粒大小在約1.0 y m至約2. 5um之間。
19.權利要求4的方法，其中所述酵母細胞壁顆粒是酵母聚糖。
20.權利要求1的方法，還包含核酸保護成分。
21.權利要求17的方法，其中所述成分選自魚精蛋白、多聚精氨酸、多聚賴氨酸、組蛋 白、組蛋白樣蛋白、合成聚陽離子聚合物和以適當的包裝序列包含在RNA序列中的逆轉錄 病毒核心顆粒。
22.權利要求1的方法，其中所述核酸和所述溶酶體規避成分通過抗體附著的形式附 著於所述顆粒。
23.權利要求1的方法，其中所述核酸和所述溶酶體規避成分是通過(鏈黴)抗生物素 和生物素之間的相互作用附著於所述顆粒。
24.權利要求1的方法，還包含結合所述核酸的多結合載體。
25.權利要求1的方法，其中所述溶酶體規避成分是腺病毒五鄰體蛋白。
26.權利要求1的方法，其中所述組合物是含有合適的藥用賦形劑的藥物組合物。
27.權利要求23的方法，其中所述核酸編碼抗原。
28.一種組合物，所述組合物包含(1)核酸成分，(2)溶酶體規避成分，和(3)能被吞 噬的可消化顆粒。
29.權利要求25的組合物，其中所述能被吞噬的可消化顆粒來自天然源。
30.權利要求25的組合物，其中所述能被吞噬的可消化顆粒來自微生物源。
31.權利要求25的組合物，其中所述能被吞噬的可消化顆粒是酵母細胞壁顆粒。
32.權利要求25的組合物，其中所述單核細胞是巨噬細胞。
33.權利要求25的組合物，其中所述單核細胞是樹突細胞。
34.權利要求25的組合物，其中所述核酸選自DNA和RNA。
35.權利要求25的組合物，其中所述核酸編碼在表達載體上。
36.權利要求29的組合物，其中所述表達載體含有核啟動子。
37.權利要求30的組合物，其中所述啟動子是低氧誘導型啟動子。
38.權利要求25的組合物，其中所述核酸編碼蛋白質或RNAi構建體。
39.權利要求32的組合物，其中所述蛋白質是抗原。
40.權利要求25的組合物，其中所述溶酶體規避成分是非感染性病毒或病毒的非感染 性組分。
41.權利要求34的組合物，其中所述病毒是腺病毒。
42.權利要求34的組合物，其中所述病毒是非複製型的。
43.權利要求34的組合物，其中所述溶酶體規避成分是仿生聚合物。
44.權利要求25的組合物，其中所述可消化顆粒大小在約0.05 y m至約5. 0 y m之間。
45.權利要求25的組合物，其中所述可消化顆粒大小在約1.0 y m至約2. 5 y m之間。
46.權利要求31的組合物，其中所述酵母細胞壁顆粒是酵母聚糖。
47.權利要求25的組合物，還含核酸保護成分。
48.權利要求41的組合物，其中所述成分選自魚精蛋白、多聚精氨酸、多聚賴氨酸、組 蛋白、組蛋白樣蛋白、合成聚陽離子聚合物和以適當的包裝序列包含在RNA序列中的逆轉 錄病毒核心顆粒。
49.權利要求25的方法，其中所述核酸和所述溶酶體規避成分通過抗體附著的形式附 著於所述顆粒。
50.權利要求25的方法，其中所述核酸和所述溶酶體規避成分通過(鏈黴)抗生物素 和生物素之間的相互作用附著於所述顆粒。
51.權利要求25的方法，還包含結合所述核酸的多結合載體。
52.權利要求25的方法，其中所述溶酶體規避成分是腺病毒五鄰體蛋白。
53.權利要求25的方法，其中所述組合物是含有合適的藥用賦形劑的藥物組合物。
全文摘要
本發明描述了一種用於治療目的的單核細胞轉染方法及其組合物以及它們的用途。該組合物由核酸成分、溶酶體規避成分和能被吞噬的可消化顆粒組成。優選地，所述單核細胞是巨噬細胞，所述可消化顆粒來自天然源，例如來自微生物源。更優選地，所述可消化顆粒是酵母聚糖之類的酵母細胞壁顆粒。所述組合物本身或用所述組合物預處理後的細胞均可用於所有基因醫學應用，例如基因治療、基因疫苗接種、癌症治療以及免疫調節和組織修復。
文檔編號A61K31/713GK101801417SQ200880021488
公開日2010年8月11日 申請日期2008年4月25日 優先權日2007年4月25日
發明者G·施瓦姆伯格, T·E·沃納, X·於 申請人:託馬斯·E·華格納