抗α_vβ₆抗體的製作方法

2023-05-29 23:51:06 1

專利名稱：抗αvβ6抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，具體涉及抗ανβ6整聯蛋白抗體。
背景技術：
整聯蛋白是一個細胞表面受體超家族，介導細胞-細胞和細胞-基質粘附。這些蛋白質被認為在發育和組織損傷過程中為細胞的生長、遷移和分化提供錨定以及信號。整聯蛋白還與細胞的去分化和侵入有關，特別是在細胞失去它們的特化形態，而成為轉移的癌細胞時。整聯蛋白是由兩個非共價連接的亞基-α和β組成的異源二聚體蛋白質。整聯蛋白的結合特異性是由18種不同α鏈中的一些與8種不同β鏈中的一些組合所規定的。 ανβ6整聯蛋白能夠結合多種配基，包括纖連蛋白、腱生蛋白、玻連蛋白和最近鑑定的潛伏相關肽(LAP)，即一種278個胺基酸的肽，其作為前體TGF- β蛋白的一部分合成(Munger等人，Cell96(3) :319_328 (1999))。在分泌過程中，LAP作為N端肽從TGF-β的成熟形式上切下，但是仍然與TGF-β非共價結合，從而保持潛伏狀態。該複合物不能與TGF-β受體結合，因此無生物學活性。α νβ 6整聯蛋白能夠直接結合LAP內所含的RGD基序，導致LAP的釋放和TGF- β的激活。由於α ν β 6與LAP的結合對於TGF- β轉化為活性狀態可能非常重要，因此阻斷這種結合可導致ανβ6介導的TGF-β激活的抑制和相關的纖維化病理學。發明概述本發明是基於抗ανβ6高親和力抗體的發現和表徵，包括這些抗體的互補決定區(CDRs)中關鍵胺基酸殘基的鑑定和分析。本發明包括一種單克隆抗體，其可以(a)特異性結合α νβ 6 ; (b)抑制α νβ 6與其配體(如LAP、纖連蛋白、玻連蛋白和腱生蛋白)的結合，其IC5tl值低於10D5的IC50值(國際專利申請公開文本WO 99/07405) ； (c)阻斷TGF-β的激活；(d)含有提供ανβ6結合特異性的CDR中的某些胺基酸序列(如圖7Α和7Β所示)；(e)特異性結合β 6亞基；和/或(f)在免疫染色程序，如石蠟包埋組織的免疫染色中識別ανβ6。已經發現，與ανβ6結合的抗體可以被分類為生物物理學上不同的類和亞類。一類抗體顯示阻斷配體(如LAP)與ανβ6結合的能力(阻斷劑)。這類抗體可以被進一步分為依賴陽離子的阻斷劑和不依賴陽離子的阻斷劑之亞類。一些依賴陽離子的阻斷劑含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽序列，而不依賴陽離子的阻斷劑不含RGD序列。另一類抗體顯示與ανβ6結合的能力，並且不能阻斷ανβ6與配體的結合(非阻斷劑)。因此，在本發明的一些實施方案中，本發明的一些抗體與ανβ6的結合是依賴二價陽離子的，而有些是不依賴二價陽離子的。示例性的陽離子是Ca2+、Mg2+和Mn2+。在一些實施方案中，抗體包含與雜交瘤6. 1A8、6. 3G9、6. 8G6、6. 2Β1、6. 2Β10、
6.2Α1、6. 2Ε5、7. 1G10、7. 7G5或7. 1C5產生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的互補決定區(CDR) 1、2和3分別基本(即除了一些保守性變異之外)由SEQID NOs :1、4和7的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs :10、13和15的序列組成。
在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs :3、5和8的序列組成，該輕鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ IDNOs : 11、14和17的序列組成。在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs :3、6和9的序列組成，該輕鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ IDNOs : 12、14和18的序列組成。在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs :2、46和47的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ IDNOs 48,13和16的序列組成。在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs :49、51和53的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs :55、57和59的序列組成。在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs :50、52和54的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ IDNOs :56、58和60的序列組成。在一些實施方案中，抗體包含SEQ ID NOs : 19-36和61-62中任何一個的重鏈可變域序列。在一些實施方案中，抗體分別包含下列重鏈和輕鏈可變域序列(I)SEQ ID NOs : 19 和 37 ;(2) SEQ ID NOs :20 或 21，和 SEQ ID NO 38 ；(3) SEQ ID NOs 22 和 43 ；(4) SEQ ID NOs 23 和 44 ；(5) SEQ ID NOs 24 和 45 ；(6) SEQ ID NOs 25 或 26，和 SEQ ID NOs 42 ；(7) SEQ ID N0s27、28 或 29，和 SEQ ID NOs 39 ；(8) SEQ ID NOs 34 或 35，和 SEQ ID NOs 40 ；(9) SEQ ID NOs 36 和 41 ；(IO)SEQ ID NOs 61 和 63 ;或(Il)SEQ ID NOs 62 和 64。在一些實施方案中，抗體可特異性結合ανβ6，但是不抑制ανβ6與潛伏相關肽(LAP)的結合。至少有些這樣的抗體能夠與石蠟包埋組織切片中的ανβ6結合，因此能夠用於診斷用途。示例性的抗體包括6. 2Α1和6. 2Ε5。 本發明也包括可結合與上述任何抗體相同表位的抗體。本發明也包括含有本發明的一種或多種抗體和藥學可接受的載體的組合物。在一些這樣的組合物中，抗體與細胞毒性劑(即影響細胞的存活力和/或功能的物質)如毒素或放射性核素偶聯。這些組合物中的抗體可以是依賴陽離子的抗體。這些組合物能夠對患有或者具有患ανβ6介導的疾病危險的對象(例如哺乳動物，如人)施用，以治療(例如緩解、減輕、降低、阻止、延遲發生)該疾病。這類疾病的例子包括，但不限於纖維化(例如硬皮病、結瘢、肝纖維化、肺纖維化和腎纖維化)；銀屑病；癌症(例如上皮癌；口腔、皮膚、子宮頸、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳房、腎或結腸直腸癌)；奧爾波特症候群；急性及慢性肺、肝、腎和其它內臟損傷；肺、肝、腎和其它內臟的硬化。患這些疾病的危險可能是由於遺傳誘因；某些生活方式，如吸菸和酗酒；接觸環境汙染物，如石棉；生理疾病，如糖尿病、肝炎病毒感染(例如C型肝炎病毒感染)、自身免疫病；和醫學治療，如放射治療。本發明還包括檢測來自哺乳動物(例如人)的組織標本中α ν β 6的方法，包括使組織標本接觸本發明的抗體，如6. 2Α1和6. 2Ε5。本發明還包括雜交瘤6. 1Α8、6· 2Β10、6· 3G9、6. 8G6、6. 2Β1、6· 2Α1、6· 2Ε5、7· 1G10、
7.7G5和7. 1C5的細胞；包含編碼SEQ ID NOs 19-45和61-64中任何一種的序列的分離的核酸；包含SEQ ID NOs 19-45和61-64中任何一種的胺基酸序列的分離的多肽。本發明的抗體是指完整抗體，例如，含有兩條重鏈和兩條輕鏈的抗體，或者是指完整抗體的抗原結合片段，如Fab片段、Fab』片段、F(ab』)2片段或F(V)片段。本發明的抗體 可以是鼠抗體或其同源物，或者是完整的人抗體。本發明的抗體也可以是人源化抗體、嵌合抗體或單鏈抗體。本發明的抗體可以是任何同種型和亞型的，如IgA(例如IgAl和IgA2)、IgG(如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgE、IgD、IgM，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是κ型或λ型。在一些實施方案中，本發明的抗體可以在重鏈的一個或多個(例如2、3、4、5或6個)特定位點處含有突變(例如缺失、置換或添加)，使得該抗體的效應物功能(例如該抗體結合Fe受體或補體因子的能力)發生改變，而不影響抗體的抗原結合能力。在另外一些實施方案中，本發明的抗體可以在作為糖基化位點的胺基酸殘基處含有突變，使得糖基化位點消除。這種抗體可能具有臨床上有益的、降低的效應物功能或其它不希望的功能，而保留其抗原結合親和力。糖基化位點的突變也可能有利於工藝發展(例如蛋白質的表達和純化)。在另外一些實施方案中，重鏈或輕鏈可能含有提高親和力或效能的突變。幾種融合#6和融合#7雜交瘤根據布達佩斯條約保藏已在美國典型培養物保藏中心(ATCC ；Ρ. O. Box 1549，Manassas, VA 20108，USA)。雜交瘤克隆 6. 1Α8、6· 2Β10、6· 3G9、
6.8G6和 6· 2Β1 於 2001 年8 月 16 日保藏，保藏號分別是ATCC ΡΤΑ-3647、-3648、-3649、-3645和-3646。雜交瘤克隆 6. 2Α1、6· 2Ε5、7· 1G10、7. 7G5 和 7. 1C5 在 2001 年 12 月 5 日保藏，保藏號分別是 ATCC PTA-3896、-3897、-3898、-3899 和-3900。見下文表 I。本發明的抗體可用於治療由α νβ 6與配體(如LAP和纖連蛋白)結合介導的任何臨床上不希望的病症或疾病(如此處所述)。由於更高的親和力或親合力，以及與配體結合的陽離子依賴性或非依賴性，這些抗體可能比以前所知的α νβ 6抗體更有效。除了本發明的抗體特別是阻斷劑的治療用途之外，非阻斷劑類的抗體也能夠用於診斷目的，如用於抗原捕獲測定、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫組化等。通過下列詳述、附圖和權利要求書，本發明的其它特徵和優點將是顯而易見的。附圖簡述圖IA和IB是顯示細胞捕獲測定結果的條形圖，該試驗是測定多種抗ανβ6單克隆抗體(「mAb」)結合β 6轉染的FDC-Pl細胞的能力(未轉染的細胞作為對照)。圖2Α是顯示ELISA測定結果的圖，該試驗是測定多種純化的抗ανβ6 「融合6」單克隆抗體結合可溶性重組人ανβ6( 「hsaj6」)的能力。這些抗體通過用截短的可溶性人ανβ6免疫β6-/-小鼠產生。圖例中的數字表示克隆數。相應的克隆名稱見表2。
圖2B是顯示ELISA測定結果的圖，該試驗是測定多種純化的抗α νβ 6「融合7」單克隆抗體結合可溶性重組hsaj 6的能力。這些抗體通過用β6轉染的NIH 3Τ3細胞(融合#7)免疫β6_/_小鼠產生。圖3A-F是顯示多種抗α νβ 6單克隆抗體與hs α νβ 6結合的不同陽離子依賴性的圖。圖4Α和4Β是顯示融合#6和融合#7單克隆抗體分別抑制生物素_hs α ν β 6與LAP結合的圖。圖5A-E是顯示本發明的示例性單克隆抗體抑制β 6轉染的FDC-Pl細胞與LAP結合的圖。圖5Α和5Β顯示融合#6抗體的結果。圖5C-E顯示融合#7抗體的結果。圖6Α和6Β是顯示融合#6和融合#7抗體分別抑制α ν β 6_介導的TGF- β激活的圖，其中使用PAI-I螢光素酶報導基因測定監測TGF-β的激活。圖7Α顯示0 36單克隆抗體6.1八8、6.866(亞克隆六和抝、7.765、6.281、6.369、6. 2Β10 (亞克隆 A 和 B)、6· 2G2、6. 2Α1、6· 4Β4 (亞克隆 A、B 和 C)、7· 10Η2、7· 9Η5、7· 4Α3 (亞克隆A和Β)、7. 1C5(亞克隆A和B)和7. IGlO的重鏈可變域的胺基酸序列。抗體6. 1A8、6. 8G6和7. 7G5與α νβ6的結合是依賴陽離子的，而抗體6. 2BU6. 2AU6. 3G9.6. 2Β10、
6.4B4、7. 1C5和7. IGlO則是不依賴陽離子的(見下文)。括號中的數字代表胺基酸殘基位點。CDR在大框中，而含有斜體胺基酸的小框則代表具體抗體在不同克隆中的多態性。圖7Β 顯示 α νβ 6 單克隆抗體 6. 1A8、6. 8G6、6. 4Β4、6· 2Α1、7· 1C5、7. 1G10、6. 2B10、
7.7G5、6. 2B1和6. 3G9的輕鏈可變域的胺基酸序列。圖8是一張散布圖，顯示人乳腺癌和人鱗狀癌組織切片中α νβ 6的表達。正常人組織只顯不可以忽略的ανβ6表達水平。圖9Α和9Β是二次曲線圖，顯示兩種抗α νβ 6抗體6. 8G6和6. 3G9分別對可溶性α νβ6的溶液結合親和力。圖IOA和IOB是兩張條形圖，證實純化的單克隆抗體與生物素化的6. 3G9和生物素化的6. 8G6分別競爭結合α ν β 6的能力。

圖11是一張條形圖，顯示在用抗α νβ6單克隆抗體治療處理的UUO動物的腎臟中，平滑肌肌動蛋白染色的百分比。圖12顯示根據FACS分析，腫瘤細胞系上α ν β 6的表達(圖右側)，以及單克隆抗體6. 3G9和6· 4Β4對腫瘤細胞系與LAP配體結合的抑制(圖左側)。圖13是一張條形圖，證實抗0 36單克隆抗體6.369、6.866和6.484對三種腫瘤細胞系與LAP配體結合的抑制。單克隆抗體的結合與不添加試驗單克隆抗體的總結合(TB)並與單獨BSA對照的非特異性結合(NSB)相比較。圖14Α和14Β顯示在33天的研究期內，抗α ν β 6單克隆抗體6. 3G9和6. 4Β4分別對皮下植入Detroit 562細胞產生的腫瘤的作用。圖15A-C顯示抗α νβ 6單克隆抗體對博來黴素誘導的肺纖維化的作用。㈧使用6. 3G9單克隆抗體的抗體治療在第O天施用博來黴素時開始，監測30天；(B)使用6. 3G9單克隆抗體的抗體治療在博來黴素治療15天後開始，監測30天；(C)使用6. 3G9、6. 8G6和6. 4B4單克隆抗體的抗體治療在博來黴素治療15天後開始，監測延長的60天。在圖15A和15B中，左側的條圖代表yg羥脯氨酸/肺，而右側的條圖顯示與鹽水處理的小鼠(無博來黴素)相比，羥脯氨酸的增加百分數。在圖15C中，該圖顯示每個肺的羥脯氨酸含量。發明詳述本發明表徵了對於整聯蛋白ανβ6特異的抗體的類和亞類。至少一類抗體(阻斷劑)能夠阻斷α ν β 6與LAP的結合或者阻止TGF- β的激活。以下描述了製備本發明的抗體的多種方法。本領域公知但是在此沒有具體描述的方法也包含在發明的範圍內。例如，本發明的抗體也能夠用噬菌體展示抗體文庫鑑定，如 Smith, Science 228 1315-7 (1985);美國專利 5，565，332,5, 733，743,6, 291，650和6，303，313所述。本發明的另外一些抗體能夠如下製備將此處鑑定的重鏈與非相關(noncognate)輕鏈(例如通過曬菌體展示技術鑑定的輕鏈)相偶聯。
非人雜交瘤抗體本發明的單克隆抗體能夠通過眾所周知的雜交瘤技術產生。為此，β 6-/_動物(例如小鼠、大鼠或兔)用如下材料免疫純化的或粗ανβ6製品，用編碼αν、β6或這兩種抗原的cDNA構建體轉染的細胞，組成型表達ανβ6的細胞，等等。可以作為純化的蛋白質、在細胞上表達的蛋白質、其蛋白質片段或肽，或者作為裸DNA或編碼該蛋白質、蛋白質片段或肽的病毒載體遞送這些抗原。然後檢測免疫動物的血清中抗ανβ6抗體的存在。從檢測為陽性的動物中分離B細胞，用這些B細胞製備雜交瘤。篩選雜交瘤分泌的抗體，這是根據它們特異性結合ανβ6(例如結合@6轉染的細胞，而不結合未轉染的親本細胞)的能力，和其它任何希望的特徵，例如含有希望的CDR共有序列，以低於已知抗ανβ6抗體10D5的IC5tl值抑制(或者對於非阻斷劑，不抑制)LAP與α ν β 6的結合，或抑制TGF- β的激活。篩選實驗中檢測為陽性的雜交瘤細胞於使細胞向培養基內分泌單克隆抗體的條件下在營養培養基中培養。然後收集條件雜交瘤培養上清液，純化上清液中所含的抗體。另外，希望的抗體也可以通過向未免疫的動物(例如小鼠)的腹腔內注射雜交瘤細胞產生。雜交瘤細胞在腹腔內增殖，分泌抗體，積累為腹水。然後可以用注射器從腹腔中吸出腹水，收集抗體。單克隆抗體也能夠如下產生從希望的雜交瘤中分離編碼抗體的cDNA，用此cDNA轉染哺乳動物宿主細胞(例如CHO或NSO細胞)，培養轉染的宿主細胞，從培養基中回收抗體。嵌合抗體本發明的單克隆抗體也能夠通過工程構建相關(cognate)雜交瘤(例如鼠、大鼠或兔)抗體產生。例如，可以通過重組DNA技術改變相關抗體，使得重鏈和/或輕鏈的部分或全部鉸鏈區和/或恆定區被替換為來自另外一個種(例如人)的抗體的相應成分。通常，工程化抗體的可變域與相關抗體的可變域相同或基本相同。這種工程化抗體被稱為嵌合抗體，當對作為鉸鏈區和/或恆定區來源的種(例如人)的個體施用時，抗原性低於相關抗體。製備嵌合抗體的方法在本領域公知。本發明包括的嵌合抗體可包含一個重鏈可變域和/或一個輕鏈可變域，重鏈可變域含有與SEQ ID NOs : 19-36中任何一個相同(或基本相同)的序列，輕鏈可變域含有與SEQ ID NOs : 37-45中任何一個相同(或基本相同)的序列。優選的人恆定區包括來源於IgGl和IgG4的恆定區。
完全人抗體本發明的單克隆抗體還包括完全人抗體。它們可以用體外免疫(prime)的人脾細胞製備，如Boerner等人，J. Immunol. 147 86-95 (1991)所述,或者用曬菌體展示抗體文庫製備，如美國專利6，300，064所述。生產完全人抗體的其它一些方法包括使用含有滅活的內源Ig基因座並且對於未重排的人抗體重鏈和輕鏈基因而言是轉基因的非人動物。這些轉基因動物可以用ανβ6免疫，然後由來源於它們的B細胞製備雜交瘤。這些方法在下列文獻中描述，例如關於含有人Ig小基因座的轉基因小鼠的多篇GenPharm/Medarex(Palo Alto, CA)公開文本/專利(例如，Lonberg 美國專利 5，789，650);關於 XEMOMICE 的多篇 Abgenix (Fremont, CA)公開文本 / 專利(例如，Kucherlapati 美國專利 6，075，181,6, 150，584 和 6，162，963 ；Green等人，Nature Genetics 7:13-21(1994);和 Mendez 等人，15 (2) 146-56 (1997);和關於「transomic」小鼠的多篇Kirin(日本)公開文本/專利(例如，EP 843961,和Tomizuka等人，Nature Genetics 16:133-1443(1997))。 人源化抗體本發明的單克隆抗體還包括來源於其它種的人源化形式的相關抗α νβ 6抗體。人源化抗體是通過重組DNA技術產生的抗體，其中用抗原結合不需要的人免疫球蛋白輕鏈或重鏈的一些或全部胺基酸(例如可變域的恆定區和框架區)置換來自相關非人抗體的輕鏈和重鏈的相應胺基酸。例如，針對特定抗原的一種人源化鼠抗體在其重鏈和輕鏈上均含有(I)人抗體的恆定區；⑵來自人抗體的可變域的框架區；和(3)來自鼠抗體的CDR。必要時，能夠將人框架區中的一個或多個殘基改變為鼠抗體相應位點的殘基，以保持人源化抗體與抗原的結合親和力。這種改變有時被稱為「回復突變」。人源化抗體在人體中引發免疫反應的可能性通常低於嵌合人抗體，因為前者含有相當少的非人成分。製備人源化抗體的方法在下列文獻中描述，例如Winter EP 239400 Jones等人，Nature 321 :522_525 (1986) ;Riechmann 等人，Nature332 :323_327 (1988);Verhoeyen 等人，Science 239 :1534-1536 (1988) ；Queen 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA86 10029 (1989);美國專利 6，180，370 ；和 Orlandi 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86 3833(1989)。鼠(或其它非人)CDR向人抗體上的移植通常如下實現。從雜交瘤中分離編碼重鏈和輕鏈可變域的cDNA。可變域，包括⑶R的DNA序列通過測序測定。編碼⑶R的DNA通過定點誘變轉移到人抗體重鏈或輕鏈可變域編碼序列的相應區。然後添加希望的同種型的人恆定區基因片段(例如對於CH添加Y1，對於CL添加K)。人源化重鏈和輕鏈基因在哺乳動物宿主細胞(例如CHO或NSO細胞)中共表達，產生可溶性人源化抗體。為了促進抗體的大規模生產，通常希望在含有抗體表達細胞的生物反應器中生產這些人源化抗體，或者生產在乳汁中表達該抗體的轉基因哺乳動物(例如山羊、母牛或綿羊)(參見，例如美國專利 5，827，690)。有時，CDR向人框架的直接轉移導致獲得的抗體丟失抗原結合親和力。這是因為在有些相關抗體中，框架區內的某些胺基酸與CDR相互作用，從而影響抗體的總抗原結合親和力。在這種情況下，為了保留相關抗體的抗原結合活性，在接受抗體的框架區內引入「回復突變」(同上)是很關鍵的。形成回復突變的普通方法在本領域中公知。例如，Queen等人(同上)，Co等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:2869-2873(1991)和 W090/07861 (Protein Design LabsInc.)描述了一種包括兩個關鍵步驟的方法。首先，通過計算機分析與相關鼠抗體V區框架的最佳蛋白質序列同源性，選擇人V框架區。然後，用計算機模擬鼠V區的三級結構，以顯示可能與鼠CDR相互作用的框架胺基酸殘基，然後將這些鼠胺基酸殘基疊加到同源的人框架上。對於這種兩個步驟的方法，有幾個標準用來設計人源化抗體。第一個標準是用來自通常與非人供體免疫球蛋白同源的特定人免疫球蛋白的框架作為人受體，或者使用來自多種人抗體的共有框架。第二個標準是，如果人受體殘基異常且供體殘基在框架的特定殘基處是人序列典型的，則使用供體胺基酸而不是受體胺基酸。第三個標準是在緊鄰CDR的位置處使用供體框架胺基酸殘基而不是受體胺基酸殘基。也可以使用一種不同的方法，如Tempest, Biotechnology 9:266-271(1991)所述。對於這種方法，分別用來源於NEWM和REI重鏈和輕鏈的V區框架進行CDR移植，而不根本引入小鼠殘基。使用該方法的一個優點是NEWM和REI可變區的三維結構通過X射線
結晶學已知，因此⑶R與V區框架殘基的特異性相互作用能夠容易地模擬。其它部分本發明的單克隆抗體還可包含用來實現希望的功能的其它部分。例如，這些抗體可以包括毒素部分(例如破傷風類毒素或篤麻毒素)或放射性核素(例如mIn或9°Y),用於殺傷抗體靶向的細胞(參見，例如美國專利6，307，026)。這些抗體可以含有易於分離或檢測的部分(例如生物素、螢光部分、放射性部分、組氨酸尾或其它肽標籤)。這些抗體也可含有一個能夠延長其血清半衰期的部分，例如聚乙二醇(PEG)部分。病情和動物模型本發明的抗體可用於ανβ6介導的疾病的治療，包括預防。例如，這些抗體通過阻斷TGF-β的激活或阻斷ανβ6與其它任何配體(如纖連蛋白、玻連蛋白和腱生蛋白)的結合，能夠用來治療纖維化(如肺纖維化、急性肺損傷、腎纖維化、肝纖維化、奧爾波特症候群和硬皮病)。該方法的新穎性包括(I)阻斷TGF-β的激活，而不是TGF-β與其受體的結合，⑵能夠局部抑制TGF-β (即在ανβ6上調位點處)，而不是全身抑制，(3)抑制ανβ6與配體的結合。除了纖維化疾病以外，本發明的抗體還可用於治療癌症或癌症轉移(包括腫瘤生長和侵襲)，特別是上皮癌。上皮癌的一個亞類是鱗狀細胞癌，例如頭頸癌、口、乳房、肺、前列腺、子宮頸、咽、結腸、胰腺和卵巢癌。我們使用新的ανβ6單克隆抗體的研究證實ανβ6在多種上皮癌中高表達，特別是在腫瘤的前緣。這些新抗體也能夠用於ανβ6介導的其它任何疾病，包括銀屑病。本發明的治療對罹患這些疾病的人和動物對象都有效。本發明適用的動物對象擴展到作為寵物或為了商業目的獲得的家畜和牲畜。例子包括狗、貓、牛、馬、綿羊、豬和山羊。本發明的抗體的效能可以用不同的動物模型檢驗。肺纖維化小鼠模型包括博來黴素誘導的(Pittet 等人，J. Clin. Invest. 107(12) 1537-1544(2001);和 Munger 等人，同上)和放射誘導的肺纖維化(Franko等人，Rad. Res. 140 :347_355 (1994))。在博來黴素處理的小鼠中，ανβ6的表達在肺上皮肺泡細胞中增加。但是β6敲除小鼠受到保護，免遭博來黴素誘導的損傷和纖維化。腎纖維化小鼠模型包括C0L4A3-/-小鼠(參見，例如Cosgrove等人，Amer.J. Path. 157 1649-1659 (2000))、具有阿黴素誘導的損傷的小鼠(Wang等人，Kidney International 58 1797-1804(2000) ；Deman 等人，Nephrol Dial Transplant 16: 147-150(2001))、db/db 小鼠(Ziyadeh 等人，PNAS USA 97 =8015-8020 (2000))和單側輸尿管阻塞的小鼠(Fogo等人,Lab Investigation 81 :189A(2001))。在所有這些模型中，小鼠發展為腎損傷和纖維化，能夠進展為腎衰竭。對於C0L4A3-/-小鼠、阿黴素處理的小鼠和單側輸尿管阻塞的小鼠，在其腎臟的上行小管和下行小管的上皮層中ανβ6上調。在多種腎損傷模型中，ανβ6的表達也可能增加。
也能夠在作為標準體內腫瘤生長和轉移模型的這些動物模型中檢驗抗ανβ6單克隆抗體抑制腫瘤生長、進展和轉移的能力。參見，例如，Rockwell等人，J. Natl. Cancer Inst. 49 735(1972) ；Guy 等人，Mol. Cell Biol. 12 954(1992) ；ffyckoff 等人，Cancer Res. 60 =2504(2000);和 Oft 等人，Curr. Biol. 8 :124(1998)。癌症中重要的 ανβ6 配體可能包括與轉移有關的TGF-β (綜述見Akhurst等人，Trends in Cell Biology 11: S44-S51(2001))、纖連蛋白和玻連蛋白。
本發明的治療的效能可以用多種可以獲得的診斷方法檢驗，包括身體檢查、血液檢查、蛋白尿測定、肌酐水平和肌酐清除率、肺功能檢查、血漿尿素氮(BUN)水平、瘢痕或纖維化損傷的觀察和評分、胞外基質(如膠原蛋白、平滑肌肌動蛋白和纖連蛋白)的沉積、腎功能檢查、超聲波、磁共振成像(MRI)和CT掃描。
藥物組合物
本發明的藥物組合物包含一種或多種本發明的抗體，或其藥學可接受的衍生物， 任選地含有任何一種藥學可接受的載體。如此處所用的術語「載體」包括已知的可接受的佐劑和載體。
根據本發明，藥物組合物可以是無菌注射製劑的形式，例如無菌注射用水或油懸液。該懸液可以根據本領域公知的技術用適當的分散劑、溼潤劑和懸浮劑配製而成。
本發明的藥物組合物可以按需要口服、局部、靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內、髓內、 關節內、滑液內、胸骨內、鞘內、肝內或顱內施用，或者只是在炎症或腫瘤生長部位局部施用。本發明的藥物組合物也可以通過使用如噴霧器、乾粉吸入器或計量劑量吸入器吸入施用。
可有效產生希望的效應的本發明之抗體的劑量和劑量率取決於多種因素，如所治療的疾病的性質、受試者的體重、治療目的、使用的具體藥物組合物和主治醫生的判斷。約0.001-約100mg/kg體重每天,例如約0. I-約50mg/kg體重每天的活性成分化合物的劑量水平是有用的。例如，本發明的抗體將以1-14天的間隔，以約0.01mg/kg體重/天到約 20mg/kg體重/天,例如約0. lmg/kg體重/天到約10mg/kg體重/天的劑量施用。在另一個實施方案中，當抗體腹膜內施用時，以約0. 3-lmg/kg體重的劑量施用。在另一個實施方案中，當抗體靜脈內施用時，以約在5-12. 5mg/kg體重的劑量施用。在一個實施方案中，抗體組合物以有效產生至少lmg/ml的血漿抗體水平的量施用。
診斷方法
技術領域：
本發明的抗體能夠用來診斷與ανβ6表達水平改變有關的疾病。來自受試者的組織標本，如組織活檢、體液標本或灌洗液(如肺泡灌洗液)，可以通過使用這些抗體的抗原捕獲測定、ELISA、免疫組化測定等來檢測。來自正常個體的組織標本作為對照。
除非另外指出，本發明的實施將使用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、微生物學、重組DNA、蛋白化學和免疫學常規技術，這些技術屬於本領域的技能。這些技術在文獻中描述。參見，例如《分子克隆實驗室指南》，第二版(Sambrook等人編)，1989 ;《寡核苷酸合成》(M. J. Gait編)，1984 ;授予Mullis等人的美國專利4，683，195 ;《核酸雜交》(B. D. Hames 和 S. J. Higgins)，1984 :《轉錄和翻譯》(B. D. Hames 和 S. J. Higgins)，1984 :《動物細胞培養》(R. I. Freshney編)，1987 ;《固定的細胞和酶》，IRL Press, 1986 :《分子克隆實用指南》 (B. Perbal)，1984 ;《酶學方法》，第154和155卷(Wu等人編),Academic Press,紐約；《用於哺乳動物細胞的基因轉移載體》(J. H. Miller和M. P. Calos編)，1987 ；《細胞和分子生物學中的免疫化學方法》(Mayer和Walker編)，1987 ；《實驗免疫學手冊》，第I-IV卷(D. M. Weir 和C. C. Blackwell編)，1986 ;《小鼠胚胎的操作》，1986。
除非另外定義，在此使用的所有技術和科學術語均與本發明所屬領域的技術人員通常理解的含義相同。典型的方法與材料在下文中描述，但是與此處所述相似或相當的方法與材料也能夠在本發明的實施中使用。此處提到的所有公開文本和其它參考文獻在此全文引用作為參考。如果衝突，以本說明書，包括定義，為準。材料、方法和實施例只是說明性的，而非意在限制。在本說明書中，單詞「包含」或其時態變化意味著包含所述整體或整體組，但是並不排除其它任何整體或整體組。實施例
下列實施例旨在說明本發明的方法與材料。在抗體領域通常遇到的，本領域技術人員公知的，所述條件和參數的適當修改和改變，在本發明的精神和範圍之內。
在下列實施例中，β6-/-小鼠如Huang等人，J. Cell Biol. 133 =921(1996)所述產生。重組人 LAP 購自 R&D Systems (Minneapolis,MN)。抗體 10D5 購自 Chemicon (Temecula, CA)。L230雜交瘤購自ATCC，分泌的抗體通過在固定的蛋白A上親和層析從飽和培養物的上清液中純化。抗體的同種型分型用IS0STRIP試劑盒(Roche Diagnostics)根據廠商說明書進行。β 6 轉染的 SW480 細胞系如 Weinacker 等人，J. Biol. Chem. 269 =6940-6948 (1994) 所述製備。
實施例I : β 6轉染的穩定細胞系的產生
β 6轉染的NIH 3Τ3和FDC-P1細胞如下產生用含有全長鼠β 6cDNA和新黴素選擇性標記的DNA構建體電穿孔親本細胞系。穩定轉染的細胞如下篩選在含有G418的培養基中傳代細胞14天，隨後通過螢光激活細胞分選(FACS)分離表達最高水平的表面β6的細胞。轉染的FDC-PI細胞在DMEM中培養，其中補充了 4mM L-穀氨醯胺，調節為含有1. 5g/L碳酸氫鈉、4. 5g/L葡萄糖和I. OmM丙酮酸鈉、10% FBS,2. 5%小鼠IL-3培養添加物和I. 5mg/ ml活性G418。轉染的NIH 3T3細胞在補充了 10% FBS、2mM L-穀氨醯胺、青黴素/鏈黴素和lmg/ml活性G418的DMEM中培養。
實施例2 :可溶性人α ν β 6的純化
α νβ 6蛋白質基本如上文的Weinacker所述純化。培養一種表達hs α νβ 6的CHO 細胞系，離心收集獲得的上清液。使用抗αν抗體L230通過親和層析純化整聯蛋白。純化的L230與CNBr激活的Sepharose 4Β(Sigma)以4. 8mg抗體/ml樹脂的比例交聯。α νβ 6 上清液以O. 5mg抗體/ml樹脂的比例加到L230親和柱上，用10倍體積的下列每種溶液洗柱(l)50mM Tris-Cl，pH 7· 5，IM NaCl,ImM MgCl2 ；(2) 50mM Tris-Cl,pH 7. 5,50mM NaCl， ImM MgCl2 ;和(3) IOmM Na3PO4, pH 7· 0。hs α νβ 6 用 IOOmM 甘氨酸，pH 2. 5 洗脫到 I : 10 體積的IM Na3PO4, pH 8. O內。蛋白質對磷酸緩衝液(PBS)透析，期間更換幾次PBS，貯存於-20 0C ο
實施例3 β 6-/-小鼠的免疫
β 6-/-小鼠通過腹膜內(IP)注射在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化的25 μ g純化重組人α νβ 6而免疫，其體積比為I : 1，總體積為200 μ I。此外，β 6-/-小鼠也通過IP注射 4Χ106β6轉染的NIH 3Τ3細胞而免疫，這些細胞重懸浮於補充了 lmg/ml CaCl2和lmg/ml MgCl^lOOyl PBS中，同一小鼠也在相鄰部位注射100 μ I CFA。開始免疫2周和4周後，用相同的試劑類似地加強免疫小鼠，不同之處是使用不完全弗氏佐劑代替CFA。小鼠在最後一次加強7天後採血，根據血清與純化的重組人α ν β 6或與β 6轉染的細胞的結合，測定抗β 6 滴度。對於用純化的重組人α νβ 6免疫的小鼠，使小鼠休息3個月，用與ImmunEasy (Qiagen) 混合的相同抗原再次免疫。在為了雜交瘤融合分離脾臟前3天，通過IP和靜脈內注射，用 12.5yg純化的重組人ανβ6蛋白免疫小鼠。在融合當天，殺死動物，取出脾臟，製成單細胞懸液。脾細胞通過與可藥物選擇的細胞融合配偶體融合而成為無限增殖的。
實施例4 :雜交瘤的篩選
通過β6_/_小鼠的免疫產生兩組抗體。一組抗體通過用截短的可溶性人 ανβ6(融合#6)免疫產生。另一組抗體通過用鼠β6轉染的NIH 3Τ3細胞(融合#7)免疫產生。抗ανβ6抗體的篩選用如下所述的基於細胞的和無細胞的結合和功能測定進行。 陽性克隆的最初篩選是基於與純化的β6轉染的人和鼠細胞的結合(未轉染的細胞作為對照)。使選擇的克隆擴增，利用細胞捕獲試驗再次評價終培養物與β 6轉染的和未轉染的細胞的結合(實施例5b，同上)(圖IA和IB顯示的代表性實施例，其中省略了 mAb名稱的前綴「6. 」或「7. 」，它們分別是指融合6和融合7 ;參見下表2)。某些抗體偏愛結合β 6轉染的細胞，而有些與轉染的和未轉染的細胞都結合，表明只有一個亞類的抗體具有β 6偏好性(圖IA和1Β)。進一步的篩選是基於抗體阻斷生物素化的hs α νβ 6和β 6轉染的鼠細胞與LAP結合的能力。使用FACS亞克隆選擇的克隆，凍存到使用前。
根據與ανβ6結合的特異性篩選單克隆抗體，這是基於它們結合β6轉染的細胞而不結合未轉染的親本細胞的能力。根據它們不能與表達CtvP1或 a J1的細胞繫結合，這些單克隆抗體進一步被證實為α νβ6而不是其它Civ整聯蛋白或非特異性整聯蛋白(即與含RGD的配體結合的非(^整聯蛋白)的特異結合劑。其中包括穩定轉染的細胞以及未轉染的JY、K562、SW480、NIH 3T3和FDCPl細胞系。
已經由ATCC保藏的其中一些抗體在下面表I中列出。
表I保藏的雜交瘤
權利要求
1.一種單克隆抗體或其抗原結合片段，其(a)特異性結合α νβ6 ;和(b)抑制ανβ6與潛伏相關肽的結合，其IC5tl值低於10D5的IC5tl值，其中所述單克隆抗體含有與雜交瘤產生的抗體相同的重鏈和輕鏈互補決定區或其中所述互補決定區具有胺基酸突變使得糖基化位點消除，其中所述雜交瘤選自ATCC保藏號為ΡΤΑ-3647的雜交瘤6. 1Α8、ATCC保藏號為ΡΤΑ-3649的雜交瘤6. 3G9、 ATCC保藏號為ΡΤΑ-3645的雜交瘤6. 8G6、ATCC保藏號為ΡΤΑ-3646的雜交瘤6. 2Β1、ATCC 保藏號為ΡΤΑ-3898的雜交瘤7. 1G10、ATCC保藏號為ΡΤΑ-3899的雜交瘤7. 7G5、ATCC保藏號為PTA-3900的雜交瘤7. 1C5。
2.權利要求I的抗體，其中該抗體含有與ATCC保藏號為PTA-3647的雜交瘤6.1A8產生的抗體相同的重鏈和輕鏈互補決定區。
3.權利要求I的抗體，其中該抗體含有與ATCC保藏號為PTA-3649的雜交瘤6.3G9產生的抗體相同的重鏈和輕鏈互補決定區。
4.權利要求I的抗體，其中該抗體含有與ATCC保藏號為PTA-3645的雜交瘤6.8G6產生的抗體相同的重鏈和輕鏈互補決定區。
5.權利要求I的抗體，其中該抗體含有與ATCC保藏號為PTA-3646的雜交瘤6.2B1產生的抗體相同的重鏈和輕鏈互補決定區。
6.權利要求I的抗體，其中該抗體含有與ATCC保藏號為PTA-3898的雜交瘤7.IGlO產生的抗體相同的重鏈和輕鏈互補決定區。
7.權利要求I的抗體，其中該抗體含有與ATCC保藏號為PTA-3899的雜交瘤7.7G5產生的抗體相同的重鏈和輕鏈互補決定區。
8.權利要求I的抗體，其中該抗體含有與ATCC保藏號為PTA-3900的雜交瘤7.1C5產生的抗體相同的重鏈和輕鏈互補決定區。
9.權利要求I的抗體，其中抗體與ανβ6的結合依賴於二價陽離子。
10.權利要求9的抗體，其中二價陽離子是Ca2+、Mg2+或Mn2+。
11.權利要求I的抗體，其中抗體與ανβ6的結合不依賴於二價陽離子。
12.—種抗ανβ6抗體，選自a)其重鏈互補決定區1、2和3分別由SEQID NOs :1、4和7的序列組成，其輕鏈互補決定區1、2和3分別由SEQ ID NOs :10、13和15的序列組成的抗體；b)其重鏈互補決定區1、2和3分別由SEQID NOs :3、5和8的序列組成，其輕鏈互補決定區1、2和3分別由SEQ ID NOs :11、14和17的序列組成的抗體；c)其重鏈互補決定區1、2和3分別由SEQID NOs :3、6和9的序列組成，其輕鏈互補決定區1、2和3分別由SEQ ID NOs :12、14和18的序列組成的抗體；d)其重鏈互補決定區1、2和3分別由SEQID NOs :2、46和47的序列組成，其輕鏈互補決定區分別由SEQ ID NOs :48、13和16的序列組成的抗體；e)其重鏈互補決定區1、2和3分別由SEQID NOs :49、51和53的序列組成，其輕鏈互補決定區1、2和3分別由SEQ ID NOs :55、57和59的序列組成的抗體；和f)其重鏈互補決定區1、2和3分別由SEQID NOs :50、52和54的序列組成，其輕鏈互補決定區1、2和3分別由SEQ ID NOs :56、58和60的序列組成的抗體。
13.—種抗ανβ6抗體，其含有選自如下序列的重鏈可變域序列和輕鏈可變域序列(a)SEQ ID NO 19的重鏈可變域序列和SEQ ID NO 37的輕鏈可變域序列；(b)SEQ ID NO 20或21的重鏈可變域序列和SEQ ID NO 38的輕鏈可變域序列；(c)SEQ ID NO 22的重鏈可變域序列和SEQ ID NO 43的輕鏈可變域序列；(d)SEQ ID NO 23的重鏈可變域序列和SEQ ID NO 44的輕鏈可變域序列；(e)SEQ ID NO 24的重鏈可變域序列和SEQ ID NO 45的輕鏈可變域序列；(f)SEQ ID NO 25或26的重鏈可變域序列和SEQ ID NO 42的輕鏈可變域序列；(g)SEQ ID NO :27、28或29的重鏈可變域序列和SEQ ID NO 39的輕鏈可變域序列；(h)SEQ ID NO 34或35的重鏈可變域序列和SEQ ID NO 40的輕鏈可變域序列；(i)SEQID NO 36的重鏈可變域序列和SEQ ID NO 41的輕鏈可變域序列；(j) SEQ ID NO 61的重鏈可變域序列和SEQ ID NO 63的輕鏈可變域序列；和 (k) SEQ ID NO 62的重鏈可變域序列和SEQ ID NO 64的輕鏈可變域序列。
14.一種組合物，其含有權利要求1-13中任何一項的抗體，和藥學可接受的載體。
15.權利要求14的組合物，其中所述抗體與細胞毒性劑偶聯。
16.權利要求14的組合物，其中所述抗體是依賴陽離子的抗體。
17.一種檢測哺乳動物組織標本中的a v 0 6的方法，包括使組織標本接觸權利要求1的 抗體。
18.保藏號為ATCCPTA-3647的雜交瘤細胞6. 1A8。
19.保藏號為ATCCPTA-3648雜交瘤細胞6. 2B10。
20.保藏號為ATCCPTA-3649雜交瘤細胞6. 3G9。
21.保藏號為ATCCPTA-3645雜交瘤細胞6. 8G6。
22.保藏號為ATCCPTA-3646雜交瘤細胞6. 2B1。
23.保藏號為ATCCPTA-3896雜交瘤細胞6. 2A1。
24.保藏號為ATCCPTA-3897雜交瘤細胞6. 2E5。
25.保藏號為ATCCPTA-3898雜交瘤細胞7. 1G10。
26.保藏號為ATCCPTA-3899雜交瘤細胞7. 7G5。
27.保藏號為ATCCPTA-3900雜交瘤細胞7. 1C5。
全文摘要
本發明涉及分子生物學領域，具體涉及抗αvβ6抗體。
文檔編號C12N15/09GK102924598SQ20121006722
公開日2013年2月13日 申請日期2003年3月13日 優先權日2002年3月13日
發明者S·M·維歐雷特, P·H·維尼爾博, K·J·西蒙, D·舍帕德, D·R·利昂 申請人:拜奧根Idec麻薩諸塞公司, 加利福尼亞大學董事會