一種檢測鏈黴菌菌絲的增強拉曼基底及其製備和使用方法與流程
2023-05-29 17:42:01
本發明涉及一種檢測鏈黴菌菌絲的增強拉曼基底及其製備和使用方法，屬於細菌檢測領域。
背景技術：
那西肽又名諾西肽、諾肽菌素或諾肽黴素，是含硫多肽類抗生素，由法國科學家於1961年在streptomycesactlloslzs40037發酵液中首次發現，隨後在阿根廷的土壤中獲得一株合成那西肽的菌株，它對大多數革蘭氏陽性菌，特別是金葡萄菌、鏈球菌和魏氏梭狀芽孢桿菌敏感，通過阻礙細菌的蛋白質合成，阻抑了細菌生長，因此可防治呼吸道疾病和壞死性腸炎。目前，很多國家和地區(如歐盟、日本、中國臺灣等地區)允許把那西肽作為飼料添加劑使用，1998年我國批准那西肽為國家三類新獸藥，它具有明顯的促進畜禽生長及改善飼料利用率的作用，在腸道內不易吸收，排除體外可迅速分解，而且用量低，殘留量少，對環境影響小，屬於安全性較高的環保型飼料添加劑。目前，合成那西肽的方法主要分為活躍鏈黴菌發酵法和化學合成法，兩者相比，發酵法成本低廉，純度低，那西肽成品中混有鏈黴菌菌絲，而化學合成法成本較高，純度也高，成品中不含鏈黴菌菌絲。有廠家為了節約成本，用鏈黴菌發酵生產那西肽，以次充好，謊稱是化學合成法合成的那西肽。因此，發明一種可用於檢測鏈黴菌菌絲的方法來區分發酵法和化學合成法合成的那西肽刻不容緩。
目前，微生物的檢測方法主要有培養染色觀察法、免疫學方法、分子生物學方法和質譜法，傳統的微生物培養法一般需要經過富集、分離培養、染色或者生化鑑定等步驟，整個檢測過程繁瑣、耗時長、工作量大，一般需要4～7天才能出檢測結果，免疫學方法具有特異性好、敏感度高的優點，但由於微生物血清型複雜，檢測中常出現假陽性結果，陽性結果需要其他試驗進一步確認。近年來，基於聚合酶鏈式反應(pcr)技術的分子生物學技術由於特異性強、靈敏度高等優點發展非常迅速，但是某些微生物會產生腐殖酸，抑制pcr反應，造成假陽性的結果。質譜的方法進行微生物檢測特異性強，靈敏度高，但是成本較高，不適合進行大批量樣品的檢測。
針對上述問題的解決方案是發明一種成本低廉、檢測快速、簡單可行的檢測基底及檢測方法，鑑於上述微生物檢測技術研究進展，本發明提出一種那西肽預混劑中鏈黴菌菌絲的檢測基底及其製備和使用方法。它不僅使試劑的消耗降低，且使實驗速度提高，費用降低，充分體現了當今實驗室設備微型化的發展趨勢。
技術實現要素：
技術問題:本發明的目的是提供一種鏈黴菌菌絲的增強拉曼檢測基底，該基底成本低廉、樣品需要量少、檢測速度快、靈敏度高、檢測簡單。
本發明的另一個目的是提供一種鏈黴菌菌絲的檢測基底的製備方法，該方法製備簡單。
本發明的另一目的是提供一種鏈黴菌菌絲的增強拉曼檢測的使用方法，用於鏈黴菌菌絲的快速檢測，操作方便，成本低廉。
技術方案：本發明提供了一種檢測鏈黴菌菌絲的增強拉曼基底，該基底由下至上分別為濾膜層、單分散納米粒子層和鍍金屬層，且各層之間以自然堆疊方式進行連接。
其中：
所述的濾膜層的濾孔孔徑為100～450nm，其材料是尼龍微孔濾膜、硝酸纖維素濾膜或普通濾紙；所述的鍍金屬層為鍍銀層、鍍金層或者鍍銅層。
所述的單分散納米粒子層中納米粒子的粒徑為100～500nm，且比濾膜層的濾孔孔徑大；所述的單分散納米粒子層為單層或多層。
所述的單分散納米粒子層中的納米粒子為二氧化矽納米粒子、聚苯乙烯納米粒子、聚甲基丙烯酸甲酯納米粒子、二氧化鈦納米粒子、矽納米粒子或水凝膠納米粒子。
本發明還提供了一種檢測鏈黴菌菌絲的增強拉曼基底的製備方法，包括以下步驟：
步驟一、以濾膜層為底層，通過可拆卸濾器將納米粒子溶液過濾至濾膜層上，納米粒子在濾膜層上自組裝形成有序結構，得到單分散納米粒子層；
步驟二、將金納米粒子溶液利用可拆卸濾器過濾至步驟一得到的單分散納米粒子層上，在單分散納米粒子層表面上通過物理吸附作用得到金納米粒子層；
步驟三、以上述金納米粒子層中金納米粒子為核，通過電鍍沉積法、無電解電鍍沉積法或電子束蒸鍍沉積法在其上生長金屬，製得鍍金屬層，得到檢測鏈黴菌菌絲的增強拉曼基底；其中，當鍍金屬層為鍍金層和鍍銀層時，採用電鍍沉積法、無電解電鍍沉積法或電子束蒸鍍沉積法，當鍍金屬層為鍍銅層時採用電鍍沉積法。
其中：
所述的可拆卸濾器的直徑為1～10cm，所述的濾膜層的直徑為1～10cm，且比可拆卸濾器的直徑小；所述金納米粒子溶液中的金納米粒子的粒徑為1～50nm，所述的納米粒子溶液為二氧化矽納米粒子溶液、聚苯乙烯納米粒子溶液、聚甲基丙烯酸甲酯納米粒子溶液、二氧化鈦納米粒子溶液、矽納米粒子溶液或水凝膠納米粒子溶液。
步驟一所述過濾的具體步驟如下：將濾膜層置於可拆卸濾器中，通過注射器將納米粒子溶液注入可拆卸濾器中，在濾膜層上自組裝形成有序結構，得到單分散納米粒子層。
步驟三所述的無電解電鍍沉積法的具體步驟為：取出覆蓋有金納米粒子層的濾膜，烘乾後將其浸入等體積混合有無電解電鍍a液和無電解電鍍b液的混合液中反應1～60min，以金納米粒子層中金納米粒子為核生長金屬，製得鍍金屬層，得到檢測鏈黴菌菌絲的增強拉曼基底；當鍍金屬層為鍍金層時，無電解電鍍a液由0.1～10g/ml的氯化鈉溶液與0.1～10wt％的氯金酸溶液按照體積比1:1～1:10混勻而成，無電解電鍍b液每100ml中含有0.1～10g酒石酸鉀鈉、1～20g氫氧化鈉、1～30ml乙醇，剩餘成分為去離子水；當鍍金屬層為鍍銀層時，無電解電鍍a液為硝酸銀與1～10vol％氨水按照質量體積比1:1～1:100混合得到的溶液，無電解電鍍b液1～50wt％酒石酸鉀鈉溶液。
本發明還提供了一種檢測鏈黴菌菌絲的增強拉曼基底的使用方法，將上述檢測鏈黴菌菌絲的增強拉曼基底用於檢測那西肽成品中的鏈黴菌菌絲，具體步驟如下：
步驟1、將那西肽預混劑置於1000～10000rpm的條件下離心1～30min，或者室溫下靜置0.5～5h，得到樣品溶液；
步驟2、將步驟1得到的樣品溶液滴加在所述的檢測鏈黴菌菌絲的增強拉曼基底上，靜置反應1～60min，得到待檢測樣品；
步驟3、用拉曼光譜儀對待檢測樣品進行拉曼檢測，當分析雷射照射待檢測樣品後得到拉曼光譜，之後對拉曼光譜進行分析，得出檢測結果。
所述的拉曼光譜儀為手持式拉曼光譜儀、共聚焦顯微拉曼光譜儀或共振顯微拉曼光譜儀。
所述將樣品溶液滴加在所述的檢測鏈黴菌菌絲的增強拉曼基底上使用的工具為微量移液器。
所述分析雷射的波長為785nm。
有益效果：與現有技術相比，本發明具有以下優點：
1、基底製備簡單，與一般的鏈黴菌菌絲檢測方法相比，該基底製備簡單、成本低廉，避免了抗體檢測、pcr檢測和質譜檢測中存在的抗體易失活、pcr假陽性和質譜檢測成本昂貴等缺點。
2、樣品需要量少、檢測速度快、靈敏度高：由於檢測反應只在基底上進行，基底對樣品溶液有過濾濃縮的效果，因此，檢測前樣品無需濃縮預處理，需要的待測樣品較少，縮短檢測時間；同時，檢測反應以具有鍍有金屬層的單分散納米粒子層為載體，比表面積大，檢測靈敏度高；鍍金屬層與菌絲之間的間隙在亞微米級，在亞微米級的間隙內形成熱點，對菌絲的拉曼光譜有增強效果，可以顯著提高菌絲的拉曼信號。
3、檢測簡單、操作方便、成本低廉：由於基底可以剪裁成任意大小，將基底剪裁成共聚焦顯微拉曼的光斑大小，就可以實現對光斑大小範圍內樣品所含菌絲的檢測，不用在基底上尋找菌絲確切位置，簡化了操作難度；可擴展性高：由於採用了可剪裁的濾膜基底，可以方便地進行不同樣品檢測基底的集成，可以一次性同時檢測多個樣品，促進了分析系統的微型化和集成化。
附圖說明
圖1為本發明中檢測鏈黴菌菌絲的增強拉曼基底的製備流程圖；
圖2為本發明中檢測鏈黴菌菌絲的增強拉曼基底工作原理示意圖；
圖中有：濾膜層1、單分散納米粒子層2、鍍金屬層3、微量移液器4、拉曼光譜儀5、分析雷射6、拉曼光譜7、待檢測樣品8。
具體實施方式
本發明提出了一種那西肽預混劑中鏈黴菌菌絲的檢測基底及其製備和使用方法，該檢測基底由下至上分別為濾膜層1、單分散納米粒子層2、和鍍金屬層3；該檢測基是通過過濾的方法在濾膜上組裝光子晶體基底，然後通過電鍍在基底表面鍍金屬製備，基底通過共聚焦顯微拉曼進行那西肽預混劑中的鏈黴菌菌絲特徵拉曼光譜的檢測。
實施例1：製備尼龍微孔濾膜多層二氧化矽鍍銀拉曼檢測基底
1、首先，將1～100ml的100～500nm直徑的二氧化矽納米粒子溶液通過注射器注入到直徑大小為1～10cm的可拆卸濾器中，在可拆卸濾器內的直徑1～10cm、濾孔孔徑為100～450nm(比二氧化矽納米粒子粒徑小)之間的尼龍微孔濾膜上組裝成多層有序結構，得到單分散二氧化矽納米粒子層；
2、將1～50ml事先製備的粒徑為1～50nm的金納米粒子溶液注入到濾器內，過濾到二氧化矽納米粒子表面，得到金納米粒子層；
3、取出覆蓋有金納米粒子層的尼龍微孔濾膜，置於熱臺上烘乾，之後將其浸入無電解電鍍銀a液(1～20g硝酸銀，1～50ml氨水，10～1000ml去離子水)和b液(1～100g酒石酸鉀鈉，1～1000ml去離子水)等體積混合的溶液中鍍銀1～60min，得到檢測鏈黴菌菌絲的尼龍微孔濾膜多層二氧化矽鍍銀基底。
實施例2：檢測染料4-atp的拉曼光譜
1、將事先製備的尼龍微孔濾膜多層二氧化矽鍍銀基底剪裁成尺寸為3mm×3mm的基底；
2、用微量移液器取5μl、10-3～10-12m的4-atp染料，滴加到上述基底上，接著共聚焦顯微拉曼進行4-atp特徵拉曼光譜的檢測，得到染料4-atp的拉曼光譜；
3、反應完畢，將使用過的基底丟棄，基底為一次性使用基底。
實施例3：檢測染料r6g的拉曼光譜
1、將事先製備的尼龍微孔濾膜多層二氧化矽鍍銀基底剪裁成尺寸為3mm×3mm的基底；
2、用微量移液器取5μl、10-3～10-12m的r6g染料，滴加到上述基底上，接著共聚焦顯微拉曼進行r6g特徵拉曼光譜的檢測，得到染料r6g的拉曼光譜；
3、反應完畢，將使用過的基底丟棄，基底為一次性使用基底。
實施例4：分別檢測發酵方法、化學方法製備的那西肽預混劑中是否含有鏈黴菌菌絲
1、將事先製備的尼龍微孔濾膜多層二氧化矽鍍銀基底剪裁成尺寸為3mm×3mm的基底；
2、用微量移液器取5μl在10000rpm條件下離心10min的發酵方法製備(或者化學方法製備)的那西肽預混劑樣品，滴加到上述基底上，接著共聚焦顯微拉曼進行鏈黴菌菌絲特徵拉曼光譜的檢測，得到發酵方法製備(或者化學方法製備)的那西肽預混劑的拉曼光譜，通過與鏈黴菌菌絲特徵光譜比對得到分析結果；
3、反應完畢，將使用過的基底丟棄，基底為一次性使用基底。