熱穩定性增強的甲酸脫氫酶突變體及其製備方法
2023-05-30 10:58:41
熱穩定性增強的甲酸脫氫酶突變體及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種熱穩定性增強的甲酸脫氫酶突變體及其製備方法，該突變體源於博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)的野生型甲酸脫氫酶，能夠催化輔酶NADH循環再生，與野生型甲酸脫氫酶相比表現出更高的熱穩定性，具有I98V、V152I、A154D、D158R中的一個或多個突變特徵。本發明的重組甲酸脫氫酶突變體具有更好的熱穩定性，適用於較高溫度下的NADH的循環再生，與目前發現的甲酸脫氫酶相比，本發明的甲酸脫氫酶突變體在50℃－55℃之間活性沒有明顯降低，具有更好的熱穩定性，因此更適合於工業化應用。
【專利說明】熱穩定性增強的甲酸脫氫酶突變體及其製備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種甲酸脫氫氣酶突變體，特別涉及一種熱穩定性增強的甲酸脫氫酶 突變體及其製備方法。
【背景技術】
[0002] 氧化還原酶在製備手性醇、胺基酸及羥基酸等方面的應用越來越多。但在其催 化的反應中，90%需要煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，NADH)，或煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP，NADPH)做為輔酶。因為在氧化還原酶的應用中，還需要低成本、高效的輔酶再生體 系。甲酸脫氫酶（Formate Dehydrogenase, FDH)是最成功的輔酶再生體系之一，已應用於 工業生產中。其優勢在於反應不可逆，並只產生一種副產物一二氧化碳，對酶的活性沒有任 何影響。Kula等在2002年因為發現這一體系而被授予德國未來獎。但目前發現的FDH熱 穩定性較差，在55°C - 60°C之間迅速失活。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種與野生型甲酸脫氫酶相比熱穩定性增強的甲酸脫氫酶 突變體、編碼序列及其製備方法。
[0004] 實現本發明目的的技術方案是：本發明提供一種甲酸脫氫酶突變體，其源於博伊 丁假絲酵母（Candidaboidinii)的野生型甲酸脫氫酶，能夠催化輔酶NADH循環再生。所述 甲酸脫氫酶突變體，與SEQIDN0. 2的野生型甲酸脫氫酶相比表現出更強的熱穩定性。甲 酸脫氫酶突變體和編碼這種突變體的多核苷酸可以使用本領域技術人員通常使用的方法 製備。突變體可以通過使編碼該酶的體外重組、多核苷酸誘變、DNA改組、易錯PCR和定向 進化方法等獲得。
[0005] 上述甲酸脫氫酶突變體，具有選自以下特徵中的一個或多個突變：I98V，V152I， A154D，D158R。
[0006] 上述甲酸脫氫酶突變體，優選自序列SEQIDNO. 4。全長突變的甲酸脫氫酶對於 保持酶的活性和熱穩定性並不是必需的。相應地，應考慮甲酸脫氫酶突變體的截短的類似 物和有催化活性的片段。例如，在一些實施方案中，C端或N端的數個胺基酸可以被刪去。 任何特定的截短的類似物或片段可以利用相應的試驗來評估催化活性。同樣的，額外的氨 基酸殘基可以被添加到一個或兩個末端而不影響催化活性。額外序列可以是功能性的或 非功能性的。例如，額外胺基酸序列可以被用來幫助純化，做為標記，或執行一些其它的功 能。因此，本公開內容的甲酸脫氫酶突變體可以是融合蛋白的形式，其中甲酸脫氫酶突變體 (或其片段）諸如通過助溶標籤（如SUM0蛋白）、純化標籤（如結合金屬的His標籤） 和細菌定位信號（如分泌信號）的實例而非限制的方式被融合到其它蛋白質。
[0007] 上述甲酸脫氫酶突變體，其甲酸脫氫酶比野生型甲酸脫氫酶具有更好的熱穩定 性。
[0008] 本發明提供一種編碼甲酸脫氫酶突變體的基因，其優選自SEQIDN0. 3,其已經過 序列優化以適於在大腸桿菌中表達。在一些實施方案中，多核苷酸包括被優化用於在特定 類型的宿主細胞中表達的密碼子。用於各種不同類型的微生物的密碼子的使用和偏好性是 已知的，因為其是用於在這些微生物的表達特定的胺基酸的優化的密碼子。
[0009] 本發明提供一種重組質粒，其源自SEQIDN0. 5,比pET系列及pQE系列表達載 體相比其具有更嚴謹的表達控制。在一些實施方案中，控制序列包括啟動子、前導序列、多 腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列和轉錄終止子等。對於細菌宿主細胞，指導編碼序 列的轉錄的適合的啟動子包括但不限於從噬菌體T5、噬菌體17、噬菌體lambda、大腸桿菌 lacUV5操縱子、大腸桿菌trp操縱子、大腸桿菌tac操縱子等。
[0010] 本發明提供一種宿主細胞，優選自大腸桿菌W3110,DH1，和JM109中的一種。表 達甲酸脫氫酶突變體的表達載體可以包含允許載體整合到宿主細胞基因組中或者載體 在細菌中獨立於基因組自主複製的元件。為整合到宿主細胞基因組中，載體可以通過 recombineering重組工程使載體整合到基因組中。
[0011] 本發明提供一種製備甲酸脫氫酶突變體的方法，其特徵在於包括以下步驟：(a) 構建表達甲酸脫氫酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主細胞，表達載體以及 甲酸脫氫酶突變體基因；(b)篩選得到所述基因工程菌；（c)培養所述基因工程菌；（d)誘 導表達所述基因工程菌；（e)收集和製備甲酸脫氫酶突變體。
[0012] 所述步驟a為將來自博伊丁假絲酵母（Candidaboidinii)的編碼野生型甲酸脫 氫酶的多核苷酸（SEQIDN0 :1)進行序列優化後通過全基因合成的方式獲得。將優化後的 編碼甲酸脫氫酶的多核苷酸克隆到改進後的表達載體（SEQIDN0. 5)的啟動子的控制下， 得到可以表達野生型甲酸脫氫酶的質粒。將所得質粒通過標準方法轉化到大腸桿菌中。所 用克隆方法為同源重組的方式，所用到的擴增引物為：
[0013] F:5'TAACTTTTAGGAGGTAAAACATATGAAAATCGTTCTGGTTCTGTACG3' ；
[0014] R:5'AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTATTTTTTGTCGTGTTTACCGTAAGC3'
[0015] 類似的，將編碼甲酸脫氫酶突變體的多核苷酸（SEQIDN0 :3)克隆到表達載體 (SEQIDN0. 5)的啟動子的控制下，得到可以表達甲酸脫氫酶突變體的質粒。將所得質粒 通過標準方法轉化到大腸桿菌DH1中。
[0016] 所述步驟c為挑取含有目的表達載體的大腸桿菌單菌落接種於l〇ml高壓滅菌後 的第一培養基中30°C，250rpm過夜培養，次日取三角瓶，按1 :100的接種比例接入到100ml 高壓滅菌後的於30°C中培養至菌體0D5-6,立刻將三角瓶置於25°C搖床中，250rpm培養 lh，加入IPTG至終濃度0.ImM，並於25°C，250rpm繼續培養12h;
[0017] 所述第一培養基為：胰蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氫二鈉3. 55g/L， 磷酸二氫鉀3. 4g/L，氯化銨2. 68g/L，硫酸鈉0. 71g/L，七水硫酸鎂0. 493g/L，六水氯化 鐵0. 027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0. 8g/L，滅菌後添加氨節青黴素至100mg/L;
[0018] 所述第二培養基為：胰蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氫二鈉3. 55g/L， 磷酸二氫鉀3. 4g/L，氯化銨2. 68g/L，硫酸鈉0. 71g/L，七水硫酸鎂0. 493g/L，六水氯化 鐵0. 027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0. 3g/L。滅菌後添加卡那黴素至50mg/L。
[0019] 本發明具有積極的效果：（1)本發明的重組甲酸脫氫酶突變體具有更好的熱穩定 性，適用於較高溫度下的NADH的循環再生，與目前發現的甲酸脫氫酶相比，本發明的甲酸 脫氫酶突變體在50°C- 55°C之間活性沒有明顯降低，具有更好的熱穩定性，因此更適合於 工業化應用。
【具體實施方式】
[0020] (實施例1)
[0021] 將來自博伊丁假絲酵母（Candidaboidinii)的編碼野生型甲酸脫氫酶的多核苷 酸（SEQIDN0 :1)進行序列優化後通過全基因合成的方式獲得。將優化後的編碼甲酸脫氫 酶的多核苷酸克隆到改進後的表達載體（SEQIDN0. 5)的啟動子的控制下，得到可以表達 野生型甲酸脫氫酶的質粒。將所得質粒通過標準方法轉化到大腸桿菌DH1中。所用克隆方 法為同源重組的方式，所用到的擴增引物為：
【權利要求】
1. 一種熱穩定性增強的甲酸脫氫酶突變體，其源於博伊丁假絲酵母的野生型甲酸脫氫 酶，能夠催化輔酶NADH循環再生，與野生型甲酸脫氫酶相比表現出更高的熱穩定性，具有 選自以下特徵中的一個或多個突變：I98V、V152I、A154D、D158R。
2. 根據權利要求2所述熱穩定性增強的甲酸脫氫酶突變體，其特徵在於：其序列為SEQ ID NO. 4。
3. -種多核苷酸，其編碼如權利要求1-2中任一項所述的重組多肽。
4. 根據權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於：其序列為SEQ ID NO. 3。
5. -種重組質粒，其包括表達載體連接權利要求4所述的多核苷酸，所述載體序列為 SEQ ID NO. 5。
6. -種宿主細胞，其包含權利要求5所述的重組質粒。
7. 根據權利要求6所述的宿主細胞，其中所述細胞是大腸桿菌，為大腸桿菌W3110， DH1，和JM109中的一種。
8. 根據權利要求6或7所述的宿主細胞，其中所述重組質粒的密碼子已經為在所述宿 主細胞中表達而進行了優化。
9. 一種如權利要求1~8所述甲酸脫氫酶突變體的製備方法，包括以下步驟：(a)採用博 伊丁假絲酵母構建表達甲酸脫氫酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主細胞， 表達載體以及甲酸脫氫酶突變體基因，所述宿主細胞為大腸桿菌W3110，DH1，和JM109中的 一種；(b)篩選得到所述基因工程菌；(c)培養所述基因工程菌；(d)誘導表達所述基因工 程菌；（e)收集和製備甲酸脫氫酶突變體。
10. 根據權利要求9所述的甲酸脫氫酶突變體的製備方法，其特徵在於：所述步驟 (c)為挑取含有目的表達載體的大腸桿菌單菌落接種於10ml高壓滅菌後的第一培養基中 30°C，250rpm過夜培養，次日取三角瓶，按1 :100的接種比例接入到100ml高壓滅菌後的於 30°C中培養至菌體0D 5-6,立刻將三角瓶置於25°C搖床中，250rpm培養lh，加入IPTG至終 濃度0. ImM，並於25°C，250rpm繼續培養12h ; 所述第一培養基為：胰蛋白腖10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氫二鈉3.55 g/L，磷酸 二氫鉀3.4 g/L，氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L，七水硫酸鎂0.493 g/L，六水氯化鐵 0. 027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0. 8g/L，滅菌後添加氨節青黴素至100mg/L ; 所述第二培養基為：胰蛋白腖10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氫二鈉3.55 g/L，磷酸 二氫鉀3.4 g/L，氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L，七水硫酸鎂0.493 g/L，六水氯化鐵 0. 027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0. 3g/L。滅菌後添加卡那黴素至50mg/L。
11. 一種NADH循環再生方法，包括在與權利要求1-2任一項所述的甲酸脫氫酶突變體 的存在下，將NAD催化生成NADH。
【文檔編號】C12N15/53GK104342406SQ201310320779
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月26日 優先權日:2013年7月26日
【發明者】丁雪峰 申請人:南京朗恩生物科技有限公司