改變體毛生長和其色素形成的方法及用於該方法的組合物的製作方法

2023-05-29 15:28:36 1

專利名稱：改變體毛生長和其色素形成的方法及用於該方法的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及在毛囊乳頭中引起程序性細胞死亡和細胞凋亡的方法以及用於該方法的組合物。更具體而言，本發明涉及通過局部應用蛋白酶或影響受體介導的信號傳導途徑的分子來改變體毛生長和體毛色素形成速度的方法。
背景技術：
哺乳動物體毛的一個主要功能是提供環境保護。但是，在人類中該功能大部分已喪失，人類當中，體毛的去留基本上取決於美容目的。
多種方法用於去除不想要的體毛，包括剃除、電針去除、拔除和注射治療用抗雄激素。這些常規方法有其缺點。如剃除可能在皮膚表面產生切口，使人感到體毛重新生長的速度加快，還可能會留下不希望有的毛樁。而電針去除雖然可能會使某一區域在較長時間內不再出現不想要的體毛，但該方法通常費用昂貴，使人痛苦，還可能會引起疤痕。拔除不但使人疼痛不適，而且經常難以除去短毛。使用抗雄激素則經常伴有某些討厭的副作用，如對肌肉的影響。而且，除電針去除之外，所有這些方法都必須反覆進行，通常是每日進行，這使得使用者深感不便。由於以上原因，需要有延遲體毛生長的化學方法。
Ahluwalia等的美國專利5,455,234中報導，哺乳動物的體毛生長可通過向皮膚使用半胱氨酸途徑酶抑制劑而加以改變，該抑制劑會延緩或阻止影響與半胱氨酸相關的體毛生長速度和特性的代謝途徑。但是，對半胱氨酸的這種抑制也會引起處理區域該胺基酸的缺乏。與此類似，Ahluwalia的美國專利5,095,007,Ahluwalia等的美國專利5,096,911和5,468,476以及Shander等的美國專利5,132,293和5,143,925中，使用酶抑制劑來改變體毛生長。在上述各例中，一個生化途徑被改變以抑制一種終產物的產生。
若能提供一種從化學上影響體毛生長和體毛色素形成，而又不致引起使用者中所需胺基酸的缺乏或不想要的副作用的方法，則是比較理想的。
發明概述根據本發明，我們發明了一種改變哺乳動物體毛生長和體毛色素形成的方法，該方法包括以下步驟，基本上由以下步驟組成或由以下步驟組成在相對體毛生長終期的體毛生長誘導足夠的時間內，向哺乳動物皮膚局部應用有效量的含蛋白酶的局部活性組合物。
在本發明的另一個實施方案中，我們發明了一種誘導毛囊乳頭中程序性細胞死亡和細胞凋亡的方法，該方法包括以下步驟，基本上由以下步驟組成或由以下步驟組成向哺乳動物皮膚局部應用局部活性藥物，其具有的第一部分形狀上與胰蛋白酶三維結構中的第二部分類似，因而該第一部分和第二部分均能影響受體介導的信號傳導。
在本發明的另一個實施方案中，我們發明了一種組合物，其包括以下成分，基本上由以下成分組成或由以下成分組成a)一種局部活性藥物，其具有的第一部分形狀上與胰蛋白酶三維結構中的第二部分類似，因而該第一部分和第二部分均能影響受體介導的信號傳導；和b)一種可藥用或美容用的載劑。
在本發明的又一個實施方案中，我們發明了一種組合物，其包括以下成分，基本上由以下成分組成或由以下成分組成a)含有蛋白酶、能夠在毛囊乳頭中誘導細胞凋亡的局部活性藥物；知b)一種可藥用或美容用的載劑。
本發明的組合物和方法，通過誘導毛囊乳頭中的細胞凋亡，提供了延遲體毛生長和體毛色素形成的獨特而又方便的手段。
附圖簡述本專利的文件中包括至少一幅彩圖。向美國專利與商標局提出請求並支付所需費用之後，專利與商標局可以提供帶有彩圖的該專利文件副本。
參照以下詳述和附圖，可以更好地理解本發明，本發明的其它優點也是顯而易見的

圖1(a)和1(c)為螢光胰蛋白酶標記的C57BI/6小鼠未處理皮膚的橫切面圖。圖1(b)為螢光胰蛋白酶標記的C57BI/6小鼠用胰蛋白酶局部處理12天後皮膚的橫切面圖。
圖2為C57BI/6小鼠背部皮膚彩色視圖，其中一些小鼠在誘導體毛生長後立即以載劑或胰蛋白酶處理，處理時間為(a)誘導體毛生長後8天；(b)誘導體毛生長後11天；(c)誘導體毛生長後14天。圖2(a)中，左側為處理小鼠，右側為未處理小鼠。圖2(b)和2(c)中，左側為未處理小鼠，中間為載劑處理小鼠，右側為胰蛋白酶處理小鼠。
圖3A為體毛誘導後(a)4天；(b)5天；(c)8天；和(d)12天，未處理小鼠皮膚的毛囊組織切片。圖3B為體毛誘導後(a)4天；(b)5天；(c)6天；(d,e)8天；和(f)12天，胰蛋白酶處理小鼠皮膚毛囊組織切片。
圖4(A)為體毛誘導後(a)1天；(b)2天；(c)3天，未處理小鼠TUNEL染色皮膚組織的橫切面圖。圖4(B)為體毛誘導後(a)1天；(b)2天；(c)3天；(d)4天；(e)5天；和(f)8天((a)-(e)為使用一次胰蛋白酶，(f)為每日使用胰蛋白酶)，胰蛋白酶處理小鼠TUNEL染色皮膚組織的橫切面圖。
圖5為在一延遲體毛周期中，反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定的胰蛋白酶處理小鼠和未處理小鼠皮膚的基因表達圖。圖5(A)示出該延遲體毛周期中1到11天的mRNA水平。圖5(B)示出該延遲體毛生長周期中第8天的mRNA水平。圖中示出25ng(A)和250ng(B)總RNA的RT-PCR產物。
發明詳述本文中，「哺乳動物」指包括哺乳綱的高等脊椎動物的任何成員，同Webster＇s Medical Desk Dictionary 407(1986)的定義，包括但不限於人類。「(％,w/v)」指每100ml組合物中給定成分的克數。「受體」包括細胞內和細胞外受體，指能接收和傳導信號的分子。
適合用於本發明組合物的局部活性藥物包括蛋白酶，結構基本上與胰蛋白酶三維結構的一部分類似的化合物或其混合物。
優選的蛋白酶為絲氨酸蛋白酶，包括但不限於胰蛋白酶，羧肽酶Y，蛋白酶Ⅳ，枯草溶菌素或混合物。選用的蛋白酶為胰蛋白酶。若不囿於理論，我們認為這些蛋白酶能夠延遲體毛生長和體毛色素形成，原因在於它們通過誘導毛囊乳頭中的程序性細胞死亡和細胞凋亡而改變了體毛生長周期，這種改變可能是由受體介導的信號傳導誘導的。優選本發明組合物的總體積中，蛋白酶的量為約0％(w/v)到約5％(w/v)，更優選約0.01％(w/v)到約1％(w/v)。
如本文實施例10所述，我們意外地發現，蛋白酶的蛋白水解活性不是影響誘導程序性細胞死亡的唯一因素。若不囿於理論，我們還認為，受體介導的信號傳導事件可能也有助於誘導毛囊乳頭中的程序性細胞死亡，這類藥物可能與局部活性藥物的結構成分有關。
因此，第二種合適的局部活性藥物包括下述化合物，其具有的一個部分形狀上與影響該受體介導的信號傳導的胰蛋白酶分子三維結構部分類似。本文中，「形狀上基本類似」指所述化合物包括充足的表現類似於配體的結構，該結構可能佔據一個受體，或取代受體的配體，或者通過蛋白水解激活或滅活受體，因而有助於誘導程序性細胞死亡。這類形狀上基本與胰蛋白酶三維結構中的一部分類似的化合物包括但不限於蛋白水解滅活胰蛋白酶，其為不能消化膠原等蛋白的胰蛋白酶形式。優選在本發明組合物總體積中，這些化合物的量為約0％(w/v)到約5％(w/v)，最優選約0.01％(w/v)到約1％(w/v)。
如果局部活性藥用或美容用藥物的釋放參數要求的話，本發明的局部活性組合物可優選進一步包括可藥用或美容用載劑，所述載劑能作為釋放系統，使得局部活性藥物能進入毛囊中。儘管可向皮膚附屬結構(此處為毛囊)釋放蛋白酶的任何商用載劑均可用作所述可藥用或美容用載劑，但優選的是脂質體。脂質體優選非離子型，並由以下成分組成a)二月桂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯；b)具有見於膽固醇中的類固醇骨架的化合物；c)具有大約12到18個碳原子的脂肪酸醚，其中細成脂質體的化合物各自比例約為53∶10∶22到63∶20∶32，優選約55∶12∶24到61∶18∶30。最優選由二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚(GDL)組成的脂質體。優選在本發明的組合物總體積中，脂質體的量約為10mg/mL到100mg/mL，更優選約25mg/mL到50mg/mL。最優選比例約為58∶15∶27。合適的脂質體優選根據實施例2的方法製備，但其它本領域常用的方法也可使用。
上述組合物可通過以下方法製備在合適的容器中合併所需成分，在室溫下，採用非離子型脂質體製備中熟知的高剪切混合手段將各成分混合，例見Niemiec等「非離子型脂質體組合物對肽藥物局部釋放進入毛皮脂單位的影響倉鼠耳模型的活體研究」，12 Pharm.Res.1184-88(1995)(「Niemiec」)，本文全文引作參考。
在一個優選實施方案中，局部活性藥用或美容用組合物的pH可使用已知的pH調節劑進行調節，使得最終組合物的pH為約2-8。pH調節劑包括但不限於N-2-羥乙基哌嗪-N′2-乙烷磺酸，其可購自例如Life Technologies，商品名為「Hepes」，或(羥甲基)氨基甲烷，其可購自Life Technologies，商品名為「Tris」，檸檬酸及其混合物。
在另一個實施方案中，局部活性藥用或美容用組合物可以與其它成分組合，所述其它成分如保溼劑，發泡劑，美容佐劑，抗氧化劑，表面活性劑，發泡劑，調節劑，溼潤劑，芳香劑，增稠劑，緩衝劑，防腐劑等，其使用量應不破壞脂質體結構，從而產生美容用或藥用產品，包括但不限於剃毛乳膏，剃毛膠，剃毛粉，化學脫毛乳膏等。
在本發明另一個實施方案中，我們發明了改變哺乳動物體毛生長和體毛色素形成的方法，該方法是大致在體毛生長誘導之時，向動物皮膚表面使用局部活性藥用或美容用組合物。
體毛生長終期毛囊的體毛生長誘導可通過本領域熟知的任何方法實現，所述方法包括但不限於剃除，蠟脫毛，化學脫毛及其組合。
儘管局部活性藥用或美容用組合物使用於皮膚的時機及組合物保持在皮膚上的時間長短可以變動，但本領域的技術人員無需過多試驗就可以認識到，局部活性組合物優選在體毛生長終期進行體毛生長誘導之前、之後立即或同時用於皮膚表面。本文中，「立即」限定為大約一小時之內。更優選局部活性藥用或美容用組合物在體毛生長誘導同時或之後立即使用，留置於皮膚上的時間應足以延遲體毛生長，優選時間為使用後至少約5分鐘，更優選使用後至少約15分鐘。
局部活性藥用或美容用組合物的用量應可以有效改變哺乳動物的體毛生長和體毛色素形成。本文中，「有效量」指足以覆蓋需要延遲體毛生長和體毛色素形成的皮膚表面區域的量。優選組合物用於皮膚表面使得需要延遲體毛生長和體毛色素形成的區域，局部活性藥物的量為約2μl/cm2到8μl/cm2。
我們意外地發現，當局部活性藥物如絲氨酸蛋白酶大致在體毛生長誘導之時局部用於動物皮膚時，獲得了至少約9天的體毛生長和體毛色素形成的明顯延遲。我們進一步認為，由於人類體毛生長周期通常要慢於小鼠，人類的體毛生長延遲可能會大大超過9天。
通過本文公開的內容，無需本文具體公開的成分、組分或步驟亦可實施本發明。以下提供了一些實施例進一步說明本發明的本質和實施方式。但是，本發明並不由具體細節所限定。實施例實施例1小鼠受試者的脫毛12隻C57BI/6雌性小鼠獲自Charles River(Kingston,NY)，它們均為6-10周齡，分別處於體毛生長的靜止期(體毛生長終期)，根據Stenn等的方法(「再論糖皮質激素對體毛生長起始的作用」，6 Skin Pharmacol.,125-134(1993))，每隻動物背部通過蠟脫毛(拔除)誘導體毛生長。眾所周知，在小鼠中脫毛時，所有毛囊的生長周期(生長期)同步起始。
如表1所示，在誘導部位觀察到下列現象表1誘導部位觀察結果
由表1可見，脫毛後幾天當動物粉色皮膚開始變暗時可見體毛生長。這可能是由於毛幹中的體毛色素形成，因為C57BI/6小鼠只有毛囊中含有黑素細胞，而表皮中沒有。
也通過化學脫毛誘導12隻類似的C57BI/6小鼠始於體毛生長終期的體毛生長，化學脫毛劑購自Carter-Wallace，商品名為「Nair」，其用量為使每隻小鼠背部溼潤。化學脫毛中，深部的毛囊不受影響，深部的前一周期中的毛幹在真皮中不受影響，直至被新生毛推出。新體毛周期的生長方式與表1所述相同。
由於鼠的體毛周期不僅在不同品系間不同，在不同個體中也不相同，用剪子自每隻小鼠取2cm×1cm皮膚樣品，用來自Stephens Scientific的10％福馬林緩衝液，pH6.9-7.1 25℃下固定，然後根據公知的方法製成石蠟包埋塊。按本領域公知的方法，用包埋塊切片，HE染料染色，進行組織學檢查，確證體毛周期的階段。本實施例所得的組織切片圖示於圖3A。
該實施例顯示，C57BI/6小鼠的體毛生長周期平均約為25天，不管使用何種脫毛方法，毛囊及毛幹發育的時間均相似。實施例2局部活性組合物的製備獲自Sigma-Aldrich Corporation的足量凍幹胰蛋白酶與0.05M N-2-羥乙基哌嗪-N＇-2-乙烷磺酸緩衝水溶液混合，上述溶液購自LifeTechnologies，商品名為「Hepes」，使所得溶液pH為約7.4，其中胰蛋白酶濃度為約2％(w/v)。1體積所得胰蛋白酶溶液與1體積水為載劑的(5％)二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚脂質體混合，後者按Niemiec所述方法製備，以使所得局部活性組合物中胰蛋白酶濃度為1％(w/v)。實施例3將胰蛋白酶釋放到毛囊中4隻7-8周齡雌性C57BI/6小鼠購自Charles River(Kingston,NY)，由6cm×2cm區域拔毛後12天，向該區域使用實施例2的局部活性組合物約100μl/鼠。本實施例中所用的胰蛋白酶用FluoReporter蛋白標記試劑盒進行螢光標記，試劑盒來自Molecular Probes,Inc.，使用方法如所附說明書(1997)，使用異硫氰酸螢光素(FITC)螢光標記，其也購自MolecularProbes,Inc。
使用螢光標記的胰蛋白酶處理之後1小時和4小時，按實施例1的方法，每隻小鼠取2cm×1cm皮膚樣品，製成石蠟包埋塊，然後切片，進行組織學檢查。
如圖1所示，幾乎所有螢光標記見於毛囊內。在1小時(圖1(c))和4小時(圖1(a))檢查的小鼠組織學染色特徵相同，以後的時間點未見進一步皮膚穿透。該觀察結果揭示不存在非特異性細胞外基質的蛋白酶消化，否則在較後的時間點會顯示螢光標記更深地穿透進入角質層。
在4隻類似的7-8周齡C57BI/6雌性小鼠中重複上述試驗，不同的是小鼠在誘導後12天每天用實施例2的1％(w/v)胰蛋白酶處理。誘導後第12天，在使用螢光胰蛋白酶之後4小時，使用類似的組織學方法分析小鼠皮膚。如圖1(b)所示，胰蛋白酶釋放進入處理區皮膚毛囊的途徑未見大的變化。然而，胰蛋白酶處理皮膚角質層的外部輪微染色表明了屏障完整性的一定損失。
本實施例表明向生長期動物皮膚表面使用含胰蛋白酶的局部活性組合物導致胰蛋白酶主要向毛囊釋放，短期和長期使用後均是如此。實施例4胰蛋白酶延遲體毛生長和體毛色素形成根據實施例3的方法，體毛生長誘導後立即向12隻7-8周齡C57 BI/6雌性小鼠局部使用單劑實施例2製備的局部活性組合物。
如圖2所示，體毛生長誘導後使用單劑胰蛋白酶延遲了體毛生長和體毛色素形成。較深的皮膚顏色表明體毛周期的進行性階段，該階段之後毛幹可見。未處理和脂質體(載劑)處理的對照在體毛生長誘導後7-8天可見深色皮膚(圖2a，左邊為處理小鼠，右邊為未處理小鼠)，它們的毛幹在11-13天可見(圖2b，左邊為未處理小鼠，中間為載劑處理小鼠，右邊為處理小鼠)。相形之下，胰蛋白酶處理小鼠在第8天皮膚仍為粉紅色(圖2a，左側小鼠)；在第11天為略呈深紅(圖2b，右側小鼠)；在第14天皮膚為灰色(圖2c，右側小鼠)。儘管胰蛋白酶處理小鼠的毛幹在第15-17天可見，但這些毛幹質量較差，不如對照濃密；然而，再過4-7天，除長度外這些毛幹在各方面都與對照中相同。
本實施例表明胰蛋白酶可有效延遲體毛生長和體毛色素形成。實施例5胰蛋白酶處理毛囊的組織學按照實施例3的方法，體毛誘導後向3隻7-8周齡雌性C57 BL/6小鼠皮膚表面使用單劑實施例2製備的局部活性組合物。
如實施例1的方法，取未處理、載劑處理(未示出)和胰蛋白酶處理小鼠1cm×2cm皮膚樣品，HE染色，然後進行組織學檢查。如圖3所示，染色樣品的組織學分析揭示胰蛋白酶處理小鼠的毛囊發育明顯被延遲。更具體地說，首次觀察到特徵性板層結構、膨大的毛囊和新體毛色素形成，要較未處理和載劑處理的對照中首次觀察到這些特徵晚幾天。此外，胰蛋白酶處理小鼠皮膚毛囊顯示出膨脹的漏鬥形，圖3B(a-e)中最為清楚，如圖3A(a-b)所示，這一現象在未處理和載劑處理小鼠中不存在。這一觀察結果證實，用含胰蛋白酶的組合物處理也會導致體毛生長質量下降，即更細、更稀。用胰蛋白酶處理後7-8天，某些處理毛囊的深部開始形成上皮層狀結構，如圖3B(d-e)所示，但其淺部仍為中空結構，圖3B(d)中最為清楚。用胰蛋白酶處理後11-12天，大多數處理的毛囊已成熟，但體毛色素形成較差，毛幹長度較短，類似於未處理毛囊誘導後4-5天的特徵(比較圖3A(d)與圖3B(f))。
本實施例通過組織學分析進一步表明，體毛生長誘導小鼠皮膚局部使用胰蛋白酶顯著延遲了體毛生長和體毛色素形成。實施例6胰蛋白酶誘導毛囊乳頭中的細胞凋亡按照實施例3的方法，在體毛誘導之後向3隻7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚表面使用單劑如實施例2製備的局部活性組合物。
按實施例1的方法取未處理和胰蛋白酶處理小鼠的1cm×2cm皮膚樣品，然後通過TdT介導的dUTP-生物素切口末端標記(TUNEL)法分析，該方法見Gavrieli等「通過核內DNA片段的特異標記原位識別程序性細胞死亡，」119 J.Cell Biology 493-501(1992)(「Gavrieli」)。在上述操作中，製備的皮膚石蠟切片使用購自Oncor,Inc.的「ApopTagTMPlus原位細胞凋亡檢測試劑盒」染色，方法如Oncor,Inc.的「ApopTagTMPlus原位細胞凋亡檢測試劑盒」說明書(1995年2月)，該方法基於Gavrieli所述的DNA片段末端標記。圖4示出了組織學分析結果，其中染色包括過氧化物酶終點(棕色)和甲基綠復染。
類似地，由小鼠未處理皮膚製備適合TUNEL染色的石蠟切片。將切片染色並進行組織學分析；結果見圖4A(a-c)。
如圖4所示，TUNEL染色樣品通過形態(緻密或片段化的胞核和胞質或凋亡小體)或著色(緻密的胞核中DNA片段染成棕色)限定了凋亡細胞。更具體而言，圖4B(a-e)顯示，在體毛生長誘導後第一周，處理的毛囊乳頭中均可檢測到凋亡小體。但是，胰蛋白酶處理不影響毛囊其它部分、表皮或真皮。相形之下，圖4A(a-c)未處理樣品的TUNEL染色顯示，未處理的早生長期毛囊中偶爾可檢測到極低水平的細胞凋亡；但是，在毛囊峽部總可見到細胞凋亡，因而毛囊濾泡以上細胞凋亡充分。大多數未處理毛囊未顯示任何細胞死亡。
本實施例顯示向已脫毛皮膚使用胰蛋白酶，使得相對於未處理或載劑處理對照，胰蛋白酶處理的毛囊乳頭中細胞凋亡增加。實施例7胰蛋白酶誘導體毛周期中基因表達的改變根據實施例3的方法，在體毛誘導之後向6隻7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚表面使用單劑如實施例2製備的局部活性組合物。
在圖5所示時間間隔，按實施例1所述取未處理小鼠和胰蛋白酶處理小鼠的皮膚，然後使用來自Tel-Test「B」的「RNA Stat-60」試劑提取總RNA，上述試劑的描述見Chomczymski，「使用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步提取RNA的方法，」162 Anal.Biochem.156-59(1987)。向每隻小鼠中提取的RNA中加入足量無RNase的DNase，酶來自Promega公司，商品名為「RQ1無RNase的DNase」使得各樣品均含200ng DNase消化的RNA，方法見Promega公司出版的「無RNase的DNase」說明書(1995年5月)。所得200ng DNase消化的RNA使用隨機六聚體進行反轉錄(「RT」)，方法見Gibco-BRL(現為Life Technologies,Incorporated)出版的「SuperscriptⅡ反轉錄酶」說明書(1992年4月)，隨機六聚體如購自Life Technologies,Incorporated的隨機引物。
所得RT產物通過聚合酶鏈反應(「PCR」)擴增，反應使用約0.5單位(每100μl反應)熱穩定性DNA聚合酶和約0.1μmol/反應基因特異性引物，酶購自Rerkin-Elmer-Cetus公司，商品名為「Taq聚合酶」，引物獲自Clontech Laboratories,Inc.(「Clontech」)或按表2進行設計，方法同Clontech引物所附說明書中擴增小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)、轉錄因子和細胞因子的方法，或如表2所述。
表2列出了使用的某些DNA引物，PCR反應所需的MgCl2量及PCR循環的長度。
表2用於RT-PCR試驗的DNA引物<
PCR產物通過2％瓊脂糖/溴化乙錠凝膠根據本領域熟知的方法進行分析，以便比較胰蛋白酶處理和未處理小鼠體毛周期中某些基因的表達水平。為更好地進行觀察，所得PCR產物根據熟知的方法用乙醇沉澱。當使用G3PDH引物時，只使用10％的PCR反應產物。每一PCR擴增設置一個陰性對照，使用未經反轉錄的7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚RNA樣品。若陽性對照不能夠買得到，使用具有非同步體毛周期的6月齡雌性C57BI/6小鼠的皮膚RNA樣品作為陽性對照。RT-PCR產物在凝膠上的遷移均與陽性對照相同，亦與報導的擴增引物大小一致。
然後通過分析各產物中一種「管家」基因G3PDH的mRNA水平，比較各RT-PCR反應產物的相對質量。如圖5所示，在檢查的所有時間點G3PDH基因表達相近，因而可以對所需基因的相對表達水平進行比較。
為證實毛囊發育延遲不是由於非特異性刺激或炎症應答，我們分析了此種情況下一般下調的基因的mRNA水平。檢查了RT-PCR產物基因的mRNA水平之後，我們發現IL-6、IL-10和GM-CSF的mRNA水平沒有變化，TNFα略微上調，TNFβ和TNF-RI略微下調，巨噬細胞誘導蛋白(MIP)中度下調，如表3所示。
表3基因表達特徵<
- 未檢測到表達+ 強帶+/- - 極弱帶 + + 較強帶+/- 弱帶+ + + 極強帶表3的基因表達分布圖否定了炎症反應或對真皮刺激的應答。
IL-1αmRNA水平中度上調(圖5b及表3),IL-1α為與培養物中體毛周期抑制相關的基因。由於IL-1α誘導也可能由於表皮屏障功能的喪失，我們通過測定經表皮水損失(TEWL)分析了屏障完整性。TEWL使用獲自Servomecl AB的「Evaporimeter EPI」蒸發計測定，首先以室內溼度標定蒸發計，然後將探頭置於受試者皮膚上。結果顯示，TEWL僅中度增加，與胰蛋白酶濃度不一致，如表4所示。
表4胰蛋白酶處理皮膚的TEWL
因此，可能表3和圖5所示的RT-PCR產物中IL-1α的任何上調均與體毛生長抑制相聯繫。
如圖5a-b及表3所示，IL-1B及IFNγ的mRNA水平均大幅增加，已知二者在簇狀脫髮中均上調，均與體毛生長抑制相聯繫。這進一步表明，只有胰蛋白酶上調的炎症相關基因與體毛生長抑制相聯繫。
如表3所示，在延遲期中，c-myb、c-myc和c-fos的mRNA水平略微下降，而c-jun水平略微上升。膠原酶基因通過AP-1應答元件調節，其水平也略微下降。某些基因的mRNA水平的普遍略微下降進一步表明胰蛋白酶處理皮膚體毛生長的全面延遲。
如圖5A和表3所示，體毛色素形成的關鍵酶酪氨酸酶在體毛生長期延遲期間下調，而當開始克服延遲時，其mRNA水平增加。如圖5A和表3所示，在延遲期間促黑素原肽促黑激素(MSH)的前體POMC中度下調。這兩個基因的下調表明胰蛋白酶也影響體毛色素形成的調節。
本實施例表明，胰蛋白酶對體毛周期的影響可通過觀察延遲期間一系列基因的表達特徵而理解。已清楚地證實了在體毛周期中胰蛋白酶誘導的mRNA水平變化，表明了胰蛋白酶在體毛生長和體毛色素形成中的調節作用。並且，本實施例還反映了局部使用胰蛋白酶對體毛生長和體毛色素形成基因的特異性。實施例8其它影響體毛生長的絲氨酸蛋白酶按照實施例3的方法，在體毛誘導後向7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚表面使用單劑如實施例2製備的局部活性組合物。
重複實施例3的操作，但分別用羧肽酶-Y蛋白酶Ⅳ和枯草溶菌素代替胰蛋白酶。
處理後8天，每隻小鼠的皮膚使用Minolta Chromameter CR300型比色計檢查，以比較其皮膚顏色。
我們注意到胰蛋白酶誘導的體毛生長延遲期最長，胰蛋白酶為內肽酶家族的一個成員，它在精氨酸和賴氨酸的C側切斷蛋白。相形之下，羧肽酶-Y在蛋白的C末端水解L-胺基酸，蛋白酶Ⅳ在中性pH切斷56％的肽鍵，它是非特異性外肽酶家族的一個成員，二者只有極低的延遲效應，而枯草溶菌素是非特異性肽酶家族的一個成員，它在鹼性pH時切斷肽鍵，它略微增加體毛生長速度。本實施例的結果見表5。
表5絲氨酸蛋白酶處理皮膚的顏色測定
(L*標尺0=黑，100=白，為根據皮膚表面觀察的體毛色素形成的測定值。)如表5所示，胰蛋白酶處理的毛囊發育最不充分，因而皮膚顏色最淺。本實施例表明，皮膚顏色表現與毛囊中體體毛育有關。
由於胰蛋白酶處理皮膚所得結果表明胰蛋白酶在延遲體毛生長和體毛色素形成方面相對更好，本實施例證實胰蛋白酶對體毛生長和體毛色素形成的作用不僅僅是由於非特異性的蛋白水解，還可能是由於胰蛋白酶誘導的特異活性引起程序性細胞死亡途徑的激活。實施例9胰蛋白酶影響體毛生長誘導的早期步驟按照實施例3的方法，在體毛生長誘導後向3隻7-8周齡雌性C57BL/6小鼠的皮膚表面使用單劑如實施例2製備的局部活性組合物。另9隻小鼠亦重複上述操作，但處理分別為每周2次、3次或7次。
觀察小鼠皮膚顏色8天後，可見處理小鼠皮膚顏色淺於未處理的對照。這進一步表明胰蛋白酶處理的毛囊發育最不充分，因而使得皮膚顏色最淺。
按實施例1的方法取各種處理小鼠的1cm×2cm皮膚樣品，H＆E染色，然後進行組織學檢查。染色樣品的組織學分析表明，增加胰蛋白酶處理動物的次數並未延長體毛生長的延遲期。這表明絲氨酸蛋白酶誘導細胞死亡由特異定時的事件引起。
為確定該特異事件的時間，按照實施例3的方法，在體毛誘導後向7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚表面使用單劑如實施例2製備的局部活性組合物，但處理在表6所示的不同時間點進行。
如表6所示，根據實施例8的方法對皮膚顏色的比色測定證實深色增加(色素更多，延遲更少)與體毛生長誘導和胰蛋白酶使用之間間隔時間增加相應。體毛生長誘導後立即處理的小鼠體毛生長和體毛色素形成的延遲期最長。體毛生長誘導後2小時和4小時處理小鼠表現出延遲期更短的體毛周期。脫毛後6小時或更長時間處理的小鼠體毛生長未見延遲，與未處理的對照沒有區別。
表6胰蛋白酶處理皮膚的顏色測定
**皮膚樣品在脫毛後8天測試。
本實施例表明，在體毛生長誘導後4小時，優選立即，向皮膚使用胰蛋白酶可有效延遲體毛生長和體毛色素形成。實施例10胰蛋白酶的作用可能涉及受體介導的途徑按照實施例3的方法，在體毛誘導後向7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚表面使用單劑如實施例2製備的局部活性組合物，但胰蛋白酶濃度由1％(w/v)到0.01％(w/v)(4×10-4M-4×10-6M)變化。脫毛後第9天，按實施例9的方法對小鼠進行比色分析。
如圖7所示，比色分析的結果表明亮色增加(L*，白色更多，色素更少)與胰蛋白酶濃度減少及體毛周期延遲增加相應。
表7胰蛋白酶處理皮膚的亮色
L*標尺0=黑，100=白**樣品在脫毛後9天分析。
本實施例表明存在著受體介導的機制，包括高劑量脫敏。實施例11胰蛋白酶的蛋白水解活性對延遲體毛生長不是必需的實施例2的組合物在室溫下溫育48小時，然後通過獲自Pan VeraCorporation的絲氨酸蛋白酶活性檢測試劑盒分析其蛋白水解活性，結果表明其中已檢測不到蛋白水解活性。按照實施例10的方法，在體毛誘導後向3隻7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚表面使用該滅活組合物。脫毛後第9天，通過實施例8的方法對小鼠進行比色分析。如表7所示，很明顯胰蛋白酶缺乏蛋白水解活性並不降低其延遲體毛生長的活性。
重複以上操作，但溫育的胰蛋白酶代之以100℃煮沸10分鐘的胰蛋白酶。結果表明，使用同樣滅活了蛋白水解活性的煮沸的胰蛋白酶，對體毛生長沒有延遲作用。煮沸破壞了胰蛋白酶的三維結構，這表明是胰蛋白酶的三維結構，而非其蛋白水解活性對體毛周期的延遲效應起作用。無論胰蛋白酶是阻斷存活信號還是激活死亡受體來引發該過程，本實施例都表明胰蛋白酶分子的構象可能也有助於誘導毛囊乳頭中的程序性細胞死亡和細胞凋亡。實施例12含胰蛋白酶組合物的應用二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚脂質體按Niemiec的方法製備，其中脂質體各組成成分的比例為約58∶15∶27。
待脂質體溫度降至約40℃後，將脂質體按常規混合加至一定量的增稠劑中，增稠劑由聚丙烯醯胺(和)C13-C14異石蠟(isoparaffin)(和)Iaureth-7組成，獲自Seppic,Inc.，商品名為「SEPIGEL 305」，使得最終組合物中增稠劑的量為約1-3％(w/v)。
然後向其中加入足量胰蛋白酶，得到1％的胰蛋白酶(w/v)組合物。該組合物適於立即局部使用。
所得產品具有有效剃毛膠的特點和性質。
權利要求
1．改變哺乳動物體毛生長和體毛色素形成的方法，包括在相對體毛生長終期的體毛生長誘導足夠的時間內，向動物的皮膚局部使用有效量的含有蛋白酶的局部活性組合物。
2．權利要求1的方法，其中蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。
3．權利要求2的方法，其中蛋白酶選自胰蛋白酶、羧肽酶-Y、蛋白酶Ⅳ、枯草溶菌素或其混合物。
4．權利要求3的方法，其中蛋白酶是胰蛋白酶。
5．權利要求4的方法，其中蛋白酶的量為局部活性組合物總體積的約0％(w/v)到5％(w/v)。
6．權利要求5的方法，其中蛋白酶的量為局部活性組合物總體積的約0.01％(w/v)到1％(w/v)。
7．權利要求1的方法，其中所述的改變之一是延遲體毛生長和體毛色素形成。
8．權利要求1的方法，其中所述局部活性組合物還包括可藥用或美容用載劑。
9．權利要求8的方法，其中所述可藥用或美容用載劑為脂質體或其混合物。
10．權利要求9的方法，其中所述脂質體為非離子型。
11．權利要求10的方法，其中所述脂質體由以下組分組成a)二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯或其混合物；b)具有見於膽固醇中的類固醇骨架的化合物或其混合物；及c)具有約12到18個碳原子的脂肪酸醚或其混合物。
12．權利要求10的方法，其中所述脂質體由以下組分組成a)二月桂酸甘油酯；b)膽固醇；及c)聚氧乙烯-10-硬脂基醚。
13．權利要求11的方法，其中所述脂質體中各組分的比例約為53∶10∶22到63∶20∶32。
14．權利要求8的方法，其中所述可藥用或美容用載劑的量基於所述局部活性組合物的總體積約為0mg/mL到100mg/mL。
15．權利要求1的方法，其中體毛生長終期體毛的生長誘導是通過剃除、電針去除、蠟脫毛、化學脫毛或所述方法的組合完成的。
16．權利要求1的方法，其中所述時間為與體毛生長終期毛囊的體毛生長誘導同時或在其之前或之後即時。
17．權利要求16的方法，其中所述時間為與體毛生長誘導同時或在其之後即時。
18．權利要求1的方法，其中所述組合物還包括表面活性劑、保溼劑、溼潤劑、調節劑、芳香劑、色劑或其混合物。
19．權利要求18的方法，其中所述組合物的形式為剃毛乳膏、剃毛膠、剃毛粉、化學脫毛乳膏、其它目的在於促進體毛去除或實際去除體毛的產品或其組合。
20．權利要求1的方法，還包括使所述組合物在皮膚上保留足夠的時間從而實現所述改變。
21．權利要求20的方法，其中所述時間為至少約15分鐘。
22．權利要求1的方法，還包括將所述蛋白酶與含N-2-羥乙基哌嗪-N＇-2-乙烷磺酸、(羥甲基)氨基甲烷或其混合物的緩衝液混合。
23．在哺乳動物的毛囊乳頭中誘導程序性細胞死亡和細胞凋亡的方法，包括向哺乳動物的皮膚局部使用局部活性藥物，其具有的第一部分形狀上與胰蛋白酶三維結構的第二部分類似，因而所述第一部分和第二部分均能影響受體介導的信號傳導。
24．權利要求23的方法，其中所述藥物為胰蛋白酶、蛋白水解活性滅活的胰蛋白酶或其組合。
25．含有以下成分的組合物a)一種局部活性藥物，其具有的第一部分形狀上與胰蛋白酶三維結構的第二部分類似，因而所述第一部分和第二部分均能影響受體介導的信號傳導；及b)可藥用或美容用載劑。
26．權利要求25的組合物，其中局部活性藥物為胰蛋白酶、蛋白水解活性滅活的胰蛋白酶或其組合。
27．權利要求25的組合物，其中局部活性藥物為組合物總體積的約0％(w/v)到5％(w/v)。
28．權利要求25的組合物，其中局部活性藥物為組合物總體積的約0.01％(w/v)到1％(w/v)。
29．權利要求25的方法，其中所述可藥用或美容用載劑為脂質體。
30．權利要求29的方法，其中所述脂質體為非離子型。
31．權利要求30的方法，其中所述脂質體由以下組分組成a)二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯或其混合物；b)具有見於膽固醇中的類固醇骨架的化合物或其混合物；及c)具有約12到18個碳原子的脂肪酸醚或其混合物。
32．權利要求30的方法，其中所述脂質體由以下組分組成a)二月桂酸甘油酯；b)膽固醇；及c)聚氧乙烯-10-硬脂基醚。
33．權利要求31的組合物，其中所述脂質體中各組分的比例約為53∶10∶22到63∶20∶32。
34．權利要求25的組合物，其中所述可藥用或美容用載劑的量基於所述組合物的總體積約為0mg/mL到100mg/mL。
35．權利要求25的組合物，其中所述組合物還包括表面活性劑、保溼劑、溼潤劑、發泡劑、美容佐劑、緩衝劑、防腐劑、抗氧化劑、調節劑、芳香劑、色劑或其混合物。
36．權利要求35的組合物，其中所述組合物的形式為剃毛乳膏、剃毛膠、剃毛粉、化學脫毛乳膏、其它目的在於促進體毛去除或實際去除體毛的產品或其組合。
37．含有以下成分的組合物a)一種局部活性藥物，其含有能誘導毛囊乳頭中細胞凋亡的蛋白酶；及b)可藥用或美容用載劑。
38．權利要求37的組合物，還包括選自以下的一種組分表面活性劑、保溼劑、溼潤劑、發泡劑、美容佐劑、緩衝劑、防腐劑、抗氧化劑、調節劑、芳香劑、色劑或其混合物。
39．權利要求37的組合物，其中所述蛋白酶為絲氨酸蛋白酶。
40．權利要求39的組合物，其中所述蛋白酶選自胰蛋白酶、羧肽酶-Y、蛋白酶Ⅳ、枯草溶菌素或其混合物。
41．權利要求37的組合物，其中局部活性藥物為組合物總體積的約0％(w/v)到5％(w/v)。
42．權利要求37的組合物，其中局部活性藥物為組合物總體積的約0.01％(w/v)到1％(w/v)。
43．權利要求37的組合物，其中可藥用或美容用載劑為脂質體。
44．權利要求43的組合物，其中脂質體為非離子型。
45．權利要求43的組合物，其中所述脂質體由以下組分組成a)二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯或其混合物；b)具有見於膽固醇中的類固醇骨架的化合物或其混合物；及c)具有約12到18個碳原子的脂肪酸醚或其混合物。
46．權利要求43的組合物，其中所述脂質體由以下組分組成a)二月桂酸甘油酯；b)膽固醇；及c)聚氧乙烯-10-硬脂基醚。
47．權利要求45的組合物，其中所述脂質體中各組分的比例約為53∶10∶22到63∶20∶32。
48．權利要求37的組合物，其中所述可藥用或美容用載劑的量基於所述組合物的總體積約為0mg/mL到100mg/mL。
49．權利要求37的組合物，其中所述組合物的形式為剃毛乳膏、剃毛膠、剃毛粉、化學脫毛乳膏、其它目的在於促進體毛去除或實際去除體毛的產品或其組合。
全文摘要
本發明利用絲氨酸蛋白酶及其誘導毛囊乳頭中程序性細胞死亡和細胞凋亡的能力來改變哺乳動物的體毛生長和體毛色素形成。本發明還介紹了含有下述藥物的組合物,所述藥物的一部分結構上與胰蛋白酶分子的一部分類似,使得所述藥物以類似於胰蛋白酶的方式誘導程序性細胞死亡和細胞凋亡。
文檔編號A61K8/37GK1225575SQ97196355
公開日1999年8月11日 申請日期1997年6月25日 優先權日1996年7月12日
發明者M·塞貝爾格, S·S·沙皮羅, G·F·M·J·考文伯, S·J·維斯尼夫斯基 申請人:莊臣消費者有限公司