雜環類新化合物的製作方法

2023-05-30 09:53:06 1

專利名稱：：雜環類新化合物的製作方法雜環類新化合物本發明屬於天然藥物化學領域，涉及三個雜環類新化合物，以及該新化合物的製備方法及在醫藥領域中的用途，尤其是在製備預防與治療細胞缺氧有關疾病及抗腫瘤有關的藥物方面的應用。心腦血管疾病及腫瘤是危害人類生命和健康的兩大疾病，據最新統計資料，2000年全世界有1700萬人死於心血管疾病，佔全球各種原因總死亡人數的1/3,預計到2020年這個數字將增至2500萬。此外，由於環境汙染、臭氧層的破壞，水源、食品的汙染等使得腫瘤的發病率急劇上升。世界衛生組織預測21世紀腫瘤將成為人類的"第一殺手"。根據1997年我國人口死因分析，城市人口死亡原因中腫瘤佔第一位，腦血管病佔第二位，兩者的數值近於相等；農村人口死亡原因中呼吸系統疾病佔第一位，腦血管病佔第二位。缺血性腦血管病在全部腦血管病中約佔70%，心腦血管疾病有著相當高的發病率及致殘率，不容忽視。本發明的目的是要提供具有抗細胞缺氧及抗腫瘤作用的雜環類新化合物，為研製能預防或治療與細胞缺氧有關的疾病或具有抗腫瘤作用的新藥提供新的天然活性物質。本發明是通過如下技術方案完成的，具體內容包括三個雜環類新化合物的提取分離，結構鑑定，抗細胞缺氧研究、抗腫瘤細胞研究及可能的醫藥用途的探討。(1)提取分離水蛭藥材，用乙醇回流提取，提取液經減壓濃縮得乙醇提取物。此提取物再溶於水製成混懸液，之後再經大孔吸附樹脂吸附，乙醇溶液洗脫，乙醇洗脫液減壓濃縮，再利用ODS柱層析進行反覆分離，通過重結晶純化，最終獲得三個雜環類化合物。(2)結構鑑定化合物l化合物1為紅棕色粉末，HR-TOF-MSm/z:308.9747[M-H]-(calc.308.9752)，ESI-MS給出了準分子離子峰m/z:309.1[M-H]—，結合lHNMR及1:iCNMR，確定其分子式為C10H6O4N4S2。IR(KBr)顯示有35003200cm"活潑氫的特徵吸收寬峰和1723cm"羰基的特徵吸收峰。'HNMR(DMSO)顯示，1含有一個甲基S2.85(3H,s)，三個活潑氫S7.40(1H,brs)、S11.72(m,brs)、S12.03(1H,brs);l:,CNMR結合HMQC顯示，化合物1含有1個甲基碳516.520,以及9個不飽和季碳原子。由於1含有較多季碳及雜原子，基本沒有二維譜信息。為了獲得化合物l的結構，我們通過成鹽反應，在5%氨水溶液中重結晶得到了化合物1的銨鹽晶體。單晶X射線衍射分析表明，化合物l的銨鹽晶體屬單斜晶系，空間點群P2(l)/n;晶胞參數a=7.2571(9)A，b=8.5170(ll)A，c=21.510(3)A;晶胞體積V=1576.7(3);晶胞內分子數為4，見圖7-11。根據以上分析，我們確定了化合物l的分子結構，經檢索，該化合物為新化合物，命名為水蛭胺A，結構式如下化合物2為黃色粉末，HR-TOF-MSm/z:349.0045[M+Na〗+(req.349.0041)，參考化合物1並檢索，確定其分子式為CuHkj04N4S2。ESI-MS正離子質譜給出了M/S327.0的[M+Hf準分子離子峰，負離子質譜給出了M/S325.1的[M-H]—準分子離子峰，與上述分子式相符合。IR(KBr)的特徵吸收峰與(l)相似，有35003200cnT1活潑氫的特徵吸收寬峰和1696cm"羰基的特徵吸收峰。'HNMR(DMS0)顯示，化合物2含有一個單峰甲基S2.57(3H,s)，兩組相互偶合的氫S3.60(2H，d,J=5.7)、S5.32(1H,t,J-5.7)，611.77(1H，d，J=1.7)、512.04(lH,d，J=1.7)以及S5.12(lH，brs),S6.30(1H，brs);滴加D20後測定，氫譜顯示原55.12、S6.30、S11.77、S12.04的峰均消失，說明上述四個氫原子均為活潑氫；其乙醯化產物的'HNMR(DMSO)進一步確定，55.12、56.30的兩個活潑氫均為羥基上的氫。(2)的l3CNMR表明該化合物有ll個碳，結合DEPT譜進一步顯示，其中低場的8個碳原子均為季碳，此外還含有1個CH(S69.626)，1個CH2(S66.057)，1個CH3(S17.34)及8個季碳o根據化合物2和1的氫譜、碳譜及分子式比較，我們推測兩者具有十分相似的母核。化合物2與1的碳譜相比，少了低場5163.71的峰，而多了CH(569.85)和CH2(666.28)的峰，根據其化學位移值推測，化合物1可能就是2中支鏈-CH(OH)CH20H氧化成-COOH後的產物，氫譜亦支持了以上的推測。NH化合物l化合物2二維相關譜進一步確證了以上推測。'H」HCOSY主要顯示了二組氫氫自旋體系H-14(S5.32)與14-0H(S6.30)、H-15(S5.12)相關，H-15(S3.60)與15-OH(S5.12)相關；而H-1(S12.04)與H-3(S11.77)相關。C0L0C譜中主要有以下重要的相關信息:l-NH(S12.04)與C陽5(S126.01)相關;3-NH(SU,77)與C-4、C-5(S161.25、126.01)相關;14-OH(56.30)與C-12、C-15。153.47、66.28)相關；H-15(S3.60)與C-12(S153.47);H-14、H-17(55.12、2'55)均與C國13(S121,66)相關；H-17(S2.55)與C-12(S153,47)相關。根據以上分析，我們確定了化合物2的分子結構，經檢索，該化合物為新化合物，命名為水蛭胺B，結構式如下化合物3為淡黃色粉末，HR-TOF-MSm/z:304.9780[M+Na]+(req.304.9779)的離子峰，檢索並確定其分子式為C9H603N4S2。'HNMR(DMSO)顯示化合物3在低場有兩個活潑氫S12.13(1H,s)和S11.81(1H,s)，高場有一個單峰甲基S3.06(3H,s)以及一個不飽和碳原子上的氫S8.51(1H,s),"CNMR表明該化合物有9個碳，DEPET譜進一步顯示，其中含有1個CH(S131.0)和CH3(S40.7),以及7個季碳。根據碳氫的化學位移及分子式，可以推測化合物3的母核與化合物1、(2)基本一致。此夕卜，化合物3的HMBC譜顯示l-NH(S12.13)與C-5(S126.33)相關；3-NH(S11.81)與C-4、C-5(5160.46、126,01)相關；12-H(S8.41)與C-7(S140.11)、C-8(S158.45)相關;H-15(S3.06)與C-12(S131.03)、C-13(S137.78)有相關。根據以上信息，我們可以推測出化合物3的主要分子結構如下化合物2formulaseeoriginaldocumentpage5化合物3formulaseeoriginaldocumentpage5與高分辨質譜給出的分子式相比，以上結構少了一個O原子，與化合物1的碳譜、氫譜比較後發現，化合物3中C-12由於羧基的缺失而導致化學位移值向高場移動，而C-13、C-15以及H-15的化學位移值均向低場出現了較大移動，此變化應該是由於O原子的存在而產生的，據此推測，存在0原子與S-14相連的亞碸結構。此外，化合物3的紅外光譜圖中不僅有羰基在1701cm—1及活潑氫原子在35003200cm"的特徵吸收峰，還出現了1046cm"的亞碸特徵吸收峰，進一步說明了該結構片斷的存在。綜合以上分析，推斷出了化合物3的分子結構，經檢索，該化合物為新化合物，命名為水蛭胺C,結構式如下formulaseeoriginaldocumentpage6化合物3化合物13的111NMRand'3CNMR數據(500細z、DMSO-de)化合物1化合物2化合物3位置13C(ppm)'H(ppm)13C(ppm)'H(ppm)13C(ppm)'H(ppm)112,03,brs12.04,s12.13,1H,s2149.99(s)150.05(s)150.01(s)311.72，brs11.77,s11.81，1H,s4161.02(s)161.25(s)跳46(s)125.88(s)126.01(s)126,33(s)7146.17(s)145.48(s)140.11(s)8157.68(s)157.24(s)158.45(s)10146.71(s)146.16(s)146.41(s)12139.51(s)153.47(s)131.03(d)5.32,1H，s13128..40(s)121.66(s)137.78(s)14163.71(s)69.85(t)5,32，1H,t,5.5Hz1566.28(d)3.60,2H，d，5.5Hz40.71(q)3.06，3H，s1616.52(q)2.85，3H,s1717.56(q)2.55,3H,s14-0H7.40,lH，s6.30,1H，br15-0H5.12，1H，br(3)抗細胞缺氧實驗1、實驗材料1.1藥品與試劑化合物l，化合物2、化合物3;尼莫地平，購於山東新華製藥有限公司；連二亞硫酸鈉、氯化鉀、過氧化氫，購自南京化學試劑一廠；高糖DMEM培養基，購自Gibco公司；小牛血清(NCS)，購自杭州四季青生物工程公司；MTT,購自Sigma公司。1.2細胞'細胞PC12細胞株(大鼠腎上腺嗜鉻腫瘤細胞株)，中國科學院上海生物化學與細胞研究所提供。以高糖DMEM培養液，內含10%小牛血清，0.0583mg/L青黴素，100mg/L鏈黴素，pH7.2培養。2、實驗方法參照文獻方法[中國實驗方劑學雜誌，2005，11(5)55-58頁]，進行連二亞硫酸鈉^&23204)誘導的PC12細胞損傷的影響實驗各試驗藥物用PBS(磷酸鹽緩衝溶液pH7.0)配製成各溶液。取長滿單層PC12細胞的96孔培養板，棄去培養液，D-Hank，s液洗滌2次，加入無血清DMEM,將細胞分為(l)正常組、(2)模型組、(3)尼莫地平組(4)-(6)化合物1組，(7)-(9)化合物2組，(10)-(12)化合物3組，(2卜(12)組每孔加入終濃度8mmol/L的^23204造模，37°C,5%C02培養箱作用4h，棄去培養液用D-Hank，s液洗滌2次，加入無血清DMEM培養24h。MTT法觀察細胞活力。3、實驗結果tableseeoriginaldocumentpage74、實驗結論化合物(l)、化合物(2)均具有較強的抗細胞缺氧作用，其ECso分別為26.6pg/ml，18.2pg/ml。化合物(3)抗細胞缺氧作用很弱。(4)抗腫瘤細胞實驗1、實驗材料1.1藥品與試劑化合物l，化合物2、化合物3;陽性對照品5-Fu(上海旭東海普製藥廠，25mg/ml，041015);RPMI-1640(Gibco，1252996)，小牛血清(中美合資蘭州民海生物工程有限公司，20050517)，Trypsin(Amresco，2430B18),MTT(Sigma，03H5079)，DMSO(Sigma)，1.2細胞A549(人肺癌細胞)，南京中醫藥大學中醫藥研究院藥理室提供。2、實驗方法接種細胞用0.25%胰蛋白酶消化處於對數生長期的腫瘤細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液配成單個細胞懸液，以每孔0.4X10"個(2Xl(^個/ml，0.2ml)細胞接種於96孔板中，將培養板移入C02孵箱中，在37'C、5。/。C02及飽和溼度條件下培養24小時後加藥。加藥0.2、2、20嗎'ml-l(終濃度)每個濃度平行6孔，用培養基稀釋後加入(空白對照孔不加細胞，只加培養液；陰性對照孔除不加藥物外，其餘操作相同)，細胞繼續培養24小時。呈色棄上清，每孔加200nl新鮮配製的含0.4mg'ml-lMTT的無血清培養基，繼續培養4h，然後棄上清加20(HilDMSO溶解MTT甲簪沉澱，用微型振蕩器振蕩混勻。比色酶標儀測定490/570nm處光密度值(以空白對照孔調零)，按下式計算腫瘤細胞抑制率，細胞抑制率(％)=(對照組OD值一試驗組OD值)/對照組OD值X100%,並計算半數抑制濃度IC50。3、實驗結果tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage94、實驗結論化合物1、化合物2、化合物3均具有較強的抗細胞缺氧作用，其ICso分別為22.16ng/ml,16.76ng/ml，11.90ng/ml。圖1.化合物1的HR-TOF-MS譜圖2.化合物1的ESI-MS(負離子)譜圖3.化合物化合物1的紅外光譜圖(KBr)圖4.化合物1的'H,譜(500MHz，DMSO-d6)圖5.化合物1的'CNMR譜(500MHz,DMSO-d6)圖6.化合物l的UV光譜(MEOH)圖7.化合物1的銨鹽X-Ray實驗數據圖8.化合物1結構中碳、氫、氮、氧及硫原子之間鍵的鍵長圖9.化合物1結構中碳、氫、氮、氧及硫原子之間鍵的夾角圖10.化合物1結構中碳、氮、氧及硫原子之間的扭曲夾角圖ll.化合物l的銨鹽分子結構圖12.化合物2的HR-TOF-MS譜圖13.化合物2的ESI-MS(正離子)譜圖14.化合物2的ESI-MS(負離子)譜圖15.化合物2的紅外光譜圖(KBr)圖16.化合物2的'HNMR譜(300MHz,DMSO-4)圖17.化合物2的'H,譜(300MHz，DMS0-d6+D20)圖18.化合物2乙醯化產物的'HNMR譜(300MHz，CDC13)圖19.化合物2的13CNMR譜(300MHz,DMSO-d6)圖20.化合物2的DEPT譜(300MHz,DMSO-d6)圖21.化合物2的H_HCOSY譜(300MHz,DMSO-d6)圖22.化合物2的C-HCOSY譜(300MHz,DMS0_d6)圖23.化合物2的COLOC譜(300MHz,DMS0_d6)圖24.化合物3的紅外光譜圖(KBr)圖25.化合物3的HR-TOF-MS譜圖26.化合物3的UV光譜(MEOH)圖27.化合物3的lHNMR譜(500MHz,DMS0-d6)圖28.化合物3的'3CNMR譜(500MHz,DMS0_d6)圖29.化合物3的13C-DEPT譜(500MHz,DMSO-d6)圖30.化合物3的HMBC譜(500MHz,DMS0_d6)實施例一水蛭藥材10Kg，切斷，加水提取兩次，水用量分別為藥材重的7、5倍，合併提取液並濃縮至20L，通過大孔樹脂(AB-8，10kg)，用水衝冼後，30%乙醇洗脫，洗脫液回收濃縮至1L，放置48小時，有沉澱析出。取沉澱物經ODS中壓柱層析，以甲醇-水(30:70)洗脫分離，得化合物l，重結晶即得；濃縮液經ODS中壓柱層析，以甲醇-水(15:85)洗脫分離，分得化合物2、(3)，重結晶即得。實施例二水蛭藥材10Kg，切斷，加70%乙醇提取兩次，用量分別為藥材重的7、5倍，合併提取液並回收溶劑，加水至20L，通過大孔樹脂(HP-20，10kg)，用水衝冼後，50%乙醇洗脫，洗脫液回收濃縮至1L，放置48小時，有沉澱析出。取沉澱物經ODS中壓柱層析，以乙醇-水(30:70)洗脫分離，得化合物1,重結晶即得；濃縮液經ODS中壓柱層析，以乙醇-水(15:85)洗脫分離，分得化合物2、(3)，重結晶即得。權利要求1.雜環類新化合物，其特徵在於該化合物具有(1)式所示的化學結構其中R1＝-SCH3R2＝-COOH或R1＝-SCH3R2＝-CHOHCH2OH或R1＝-SOCH3R2＝-H2.根據權利要求1的三個雜環類新化合物的製備方法，其特徵在於以水蛭為原料，經水或有機溶劑或它們的混合溶劑提取，水提取液直接過大孔吸附樹脂吸附，含有機溶劑的提取液回收有機溶劑後加水溶解，之後再經大孔吸附樹脂吸附，大孔吸附樹脂吸附物經反覆柱層析分離而得。3.根據權利要求1所述的三個雜環類新化合物在製備預防與治療與抗細胞缺氧有關疾病及抗腫瘤有關的藥物中的用途。4.根據權利要求2所述的三個雜環類新化合物的製備方法，其特徵在於大孔吸附樹脂包括AB-8、D4020、DlOl、HP-20;柱層析用擔體選自矽膠、氧化鋁、ODS的一種或一種以上；有機溶劑包括甲醇、乙醇。5.根據權利要求3所述的三個雜環類新化合物的用途，其中的疾病包括冠心病，腦血栓、腦梗死、腦供血不足、腫瘤。全文摘要本發明涉及天然藥物化學領域，公開了如式(1)所示的三個雜環類新化合物的化學結構，以及該化合物的製備方法及在醫藥領域中的用途。尤其在製備預防與治療與抗細胞缺氧有關疾病及抗腫瘤有關的藥物中的用途。文檔編號A61P35/00GK101412726SQ200710133248公開日2009年4月22日申請日期2007年10月15日優先權日2007年10月15日發明者彭國平,李紅陽,鄭雲楓,黃險峰申請人:南京中醫藥大學