治療用蛋白和核酸的製作方法

2023-05-30 04:26:56

專利名稱：治療用蛋白和核酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的蛋白，肽片段及其結合體(conjugate)，以及編碼此蛋白及其片段的核酸，它們都能用於腫瘤疾病的診斷和治療，尤其是食管癌的診斷和治療。
人食管癌(EC)是最常見的遍及世界的癌症之一，中國、南非、烏拉圭、法國和義大利(見

圖1和2)發病率很高。美國EC發病率較低，大多數發生在美國黑人。
中國食管癌的死亡率是全世界最高的，佔全世界死亡人數的50％。河南邊界的太行山南部地區、山西和湖北省食管癌死亡率高，尤其是河南省林縣年齡相關死亡率最高，男性為151/100 000，女性為115/100 000(見圖3)。以往對中國的研究表明許多腫瘤抑制基因和癌基因參與此病的發病和進展過程，然而沒有確定與EC直接相關的基因。
本發明人分離了四個不同的基因片段，並用mRNA差異顯示技術將其克隆，比較正常食管上皮和EC之間異常基因表達的不同之處。
在GenBank資料庫中進行序列同源性分析發現這些片段與已知序列無顯著相似性，因而這四個片段可能是新的基因。用5』-RACE(cDNA末端快速擴增)技術測定了一個序列的全長，稱為食管癌相關基因-1(ECRG-1)。對這些基因研究表明，它們的失活或刪除將促使食管形成腫瘤，這對EC基礎和臨床研究有很強的重要性，使得將其用於製備抗體、設計新的藥物、基因診斷、基因治療和抑制或清除基因產物方面的進展成為可能。
用逆轉錄酶PCR確定ECRG1在正常食管上皮和食管癌上皮表達有明顯的不同。Northern雜交分析發現正常食管細胞出現長約1kb的ECRG1陽性信號，而食管癌細胞未出現此信號(見圖4N＝正常，C＝食管癌)。此外，還將ECRG1的融合蛋白在體外和體內應用於腫瘤細胞，能顯著抑制腫瘤生長。
本發明的第一個方面提供了分離或純化的編碼含有SEQ ID NO 2的胺基酸序列，與之有至少50％同源性的胺基酸序列或其片段的蛋白的核酸序列，其中所說的蛋白或肽片段具有抑制食管上皮細胞腫瘤生長速度的活性。
該蛋白優選分子量在43和47kD之間。更優選是絲氨酸蛋白酶型。更優選該蛋白具有SEQ ID NO 3(NLKPWMIAVLIVLSLTVVAVTIGLLVHFLVFDQ)或其保守取代突變體的胺基酸序列的跨膜位點。更優選該蛋白具有下列一個或優選全部的位點N-糖基化位點、蛋白激酶糖基化位點、酪氨酸激酶II磷酸化位點、N-豆蔻醯化位點、醯胺化位點、異戊二烯基組結合位點(CAAX盒)、微體C-末端靶信號、細胞粘附序列和絲氨酸蛋白酶(胰島素型)組氨酸位點。更優選的的位點顯示於下面的表1中。
該蛋白可包括前面所述的與一個或更多編碼標記序列的區域聯結或相連的活性蛋白或片段序列，例如GST或GFP融合序列，或與能增強細胞膜，尤其是食管上皮細胞膜穿透力的序列聯結或相連。
優選的核酸序列是能夠在標準嚴格雜交條件下與SEQ ID NO 1的核酸序列雜交的核酸序列，標準嚴格雜交條件是2×SSC，65℃；更優選的高度嚴格條件是0.2×SSC，65℃。雜交步驟優選按照Church和美國國家科學院院報(USA)(1984)81，1991-1995(通過引用被在此合併)。
更優選的核酸是mRNAs和cDNAs，儘管用於診斷食管癌的探針和引物在下述本發明更進一步的方面也能想到。
本發明更優選的核酸是DNAs，尤其是cDNAs，它與啟動序列及其他選擇性調控序列可操縱地連接，這些序列允許DNA表達，從而在細胞內產生本發明所述的能抑制食管腫瘤生長的蛋白或片段，從中分離並純化作為抗腫瘤試劑、疫苗或poart fo診斷試劑盒。這類細胞可以是原核細胞，但優選是真核細胞，更優選是哺乳動物細胞，尤其是人細胞。這些細胞可以替換為靶腫瘤細胞，靶腫瘤細胞需要該蛋白或片段抑制其分裂，從而抑制腫瘤生長。
本發明的第二個方面提供了一種分離純化、無菌或無熱原質形式的含有SEQ ID NO 2的胺基酸序列，或與之有至少50％同源性的胺基酸序列或片段的蛋白，其中蛋白或肽片段具有抑制食管上皮細胞腫瘤生長速度的活性。
該蛋白優選分子量在43和47kD之間，更優選約47kD。更優選是絲氨酸蛋白酶型。更優選該蛋白具有SEQ ID NO 3(NLKPWMIAVLIVLSLTVVAVTIGLLVHFLVFDQ)或其保守取代突變體的跨膜位點的胺基酸序列。更優選該蛋白具有下列一個或最好全部的位點N-糖基化位點、蛋白激酶糖基化位點、酪氨酸激酶II磷酸化位點、N-豆蔻醯化位點、醯胺化位點、異戊二烯基組結合蛋白(CAAX盒)、微體C-末端靶信號、細胞粘附序列和絲氨酸蛋白酶(胰島素型)組氨酸位點。更優選的的位點顯示於下面的表1中。
該蛋白可能包括前面所述的活性蛋白或與一個或更多編碼標記序列的區域結合或側接的片段序列，例如GST或GFP融合序列，或與能增強細胞膜，尤其是食管上皮細胞膜穿透力的序列聯結或相連。
同源性是指胺基酸或核酸序列同一性的百分比，或對於胺基酸來說，相同或保守取代胺基酸同一性的百分比。同一性是指胺基酸序列相同的百分比。這兩個百分比術語允許在序列缺失時仍能進行下述的比對。
特別是，術語同一性是指當進行選擇性序列排列比較時，要求保護的胺基酸或鹼基序列在參考文獻中序列的同一相應位點出現的百分比，儘管實際上序列可能在一定位點有缺失或增加，此時在該位點需要加入缺口來排列比較胺基酸或鹼基相同的最高百分比。尤其是在序列排列比較是使用了20或20個以下缺口，即加入到兩個序列之間的所有缺口總數之和為20或20以下，更優選是10或小於10。這些缺口的長度不是非常重要，只要兩個有關E2F結合和E2FDNA結合調節的中一個或另一個的確定活性存在，但一般不超過50個胺基酸，優選不超過10個，或不超過150個鹼基，優選不超過30個鹼基。
前述突變形式序列優選保守取代。關於胺基酸「保守取代」涉及用同一族中有相同物理化學特性的胺基酸取代一給定的胺基酸。這樣當某胺基酸有一個疏水性基團時，它被另一個也含有疏水性基團的胺基酸保守取代；其他這類族是特性基團包括親水、陽離子、陰離子或含有一個硫醇或硫醚的族。這樣的取代只是在預計取代後的蛋白具有DP肽或蛋白活性時，討論有關E2F異二聚化和E2F-DNA結合或轉錄活化調節。
胺基酸或核苷酸序列排列比較以及計算序列同源性或同一性的適當運算法和軟體都是本領域技術人員熟知的。這類工具的主要例子是Pearson和基於FAST的Lipman以及BLAST程序。具體可在Altschul et al(1990)，J.Mol.Biol.215403-10；Lipman D J and Pearson W R(1985)Science 227，p143541中找到。公眾可在網際網路『http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast-help.html』中得到BLAST詳情。因而可經商業、公眾可得軟體包，例如FASTA和BLASTn軟體或通過網絡計算機服務商來確定同源性和同一性百分比。前者的例子是GCG程序包(Devereux et al Nucelic Acids Research(1984)12(1)387)和Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，eg.Version 8 for Unix or IBM equivalent，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)，他們使用Smith和Waterman當地同源性算法，Advances in Mathematics 2482-489(1981)。許多國際機構，例如GenBank(見http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和EMBL(見http//www.embl-heidelberg.de/Blast2)提供網絡服務。
軟體包使用的參數和網絡服務商應該與適當的序列長度和前述缺口特性一起應用。排列比較策略在W098/40483第39-41頁有敘述，此文獻通過引用被在此合併。
BLAST檢索中方便的參數時預設值，即對EMBL Advanced Blast2Blastp Matrix BLOSUMS 62，Filter預設值，Echofilter X，Ecpect 10，Cutoff預設值，雙鏈，描述50，排列比較50。優選使用BLASTn的預設值。GCG Wisconsin軟體包的缺口預設值為12，長度預設權值4。更優選的同源性算法的FASTDB參數時錯配罰值＝1.00，缺口罰值＝1.00，缺口大小罰值＝0.33及增加鹼基罰值＝30.0。
關於胺基酸「保守取代」涉及用同一族中有相同物理化學特性的胺基酸取代一給定的胺基酸。這樣當某胺基酸有一個疏水性基團時，它被另一個也含有疏水性基團的胺基酸保守取代；其他這類族是特性基團包括親水、陽離子、陰離子或含有一個硫醇或硫醚的保守取代。此種取代被具體描述在參考文獻US5380712中。
本發明的核酸可被序列列表中的例子變性取代。『變性取代』涉及核苷酸被編碼相同胺基酸的密碼子核苷酸序列取代；這些在細胞或載體表達蛋白時具有優越性的變性取代的類型與源生物細胞DNA不同，它含有與源細胞cDNA不同的轉錄/翻譯優選密碼子。這類變性取代由此可能成為宿主特異性取代。
本發明的第三個方面是提供了寡核苷酸探針和引物，它用於第一個方面所述的核酸的鑑定、分離和複製，以及在研究食管腫瘤和食管腫瘤細胞時，用於鑑定組織中ECRG1基因的存在和/或缺失。
該探針的長度足夠在標準或嚴格雜交條件下與ECGR1基因特異性結合。它們可能是SEQ ID NO 1序列相應的全長探針，但其長度為10-100個鹼基可能更合適一些，更優選是15-30個鹼基，每一探針含有與前述長度片段鄰近的序列。
同樣地，用於擴增DNA的引物本身可被鑑定來檢測是否存在活性ECRG1基因或其他的關鍵序列。本領域技術人員熟知引物的合適長度，例如長度為8-30個鹼基。特別優選的引物和探針是那些通過用標記核苷酸進行連接酶鏈式反應來檢測單一核苷酸表現的多肽性，例如位點直接突變，使有關腫瘤生長抑制的蛋白發生失活或與此處公開的野生型蛋白相比活性降低。
本發明的第四個方面是提供了可表達本發明的蛋白或蛋白片段的表達載體，該蛋白或蛋白片段包括本發明第一個方面所述的與啟動子和其他可引起蛋白或片段在靶腫瘤細胞表達或產生蛋白的選擇性調節區域可操縱連接的核酸。
優選載體被用於所謂的基因治療，包括突變病毒形式的載體，所述病毒能感染食管上皮並在食管表達該蛋白或片段。此病毒可方便地是腺病毒、腺病毒相關病毒或細小病毒，但也包括其他治療病毒是本領域技術人員熟知的適合用於基因治療的病毒。特別優選的病毒是在非靶細胞中複製的能力比它們在靶細胞中弱。因此，優選定向到達上皮細胞的病毒突變體。
本發明的第五個方面是提供了被本發明的核酸轉染的細胞。
本發明的第六個方面提供了本發明的蛋白或片段的抗體，例如在實施例中提供的。這些抗體可能與純化分離SEQ ID NO 1蛋白或與其抗原結合片段結合，如實施例中所列，或與聯接著標記蛋白(例如谷光苷肽-S-轉移酶(GST)或綠螢光蛋白(GFP))的蛋白或片段結合。這些抗體可能由各種動物產生，例如豬、兔、小鼠或大鼠，也可能是多克隆抗體，但更優選的為單克隆抗體，例如由熟知的雜交瘤技術產生的單克隆抗體。
本發明的第七個方面是提供了一種診斷編碼異常食管腫瘤生長抑制蛋白的基因ECRG1存在的方法，包括確定患者食管組織樣本中是否存在所述基因序列，並與已知SEQ ID NO 2及其突變體序列比較，該序列能誘導或增強抑制食管上皮細胞腫瘤生長的效果，確定所述基因序列丟失或具誘導活性的ECRG1丟失的患者存在發生食管腫瘤的高危因素。用本發明的探針或引物能方便地作出診斷。
本發明的第八個方面提供了一種治療可疑癌症患者的方法，包括給藥於患者有效量的本發明第二個方面的蛋白或片段，抑制腫瘤的生長。該可疑癌症優選食管腫瘤。
本發明的第九個方面提供了一種治療可疑癌症患者的方法，包括給患者施與有效量的本發明第四個方面的病毒載體，感染任何腫瘤細胞，並在細胞內產生有效量的蛋白或蛋白片段來抑制腫瘤的生長。該可疑癌症優選食管癌。
本發明的第十個方面提供了一種延長癌細胞的細胞周期的方法，包括用本發明第二或第四個方面的蛋白或片段或載體處理該細胞。
本發明的第十一個方面提供了一種藥物組合物，包括第二個方面的蛋白或片段與藥物可接受的載體、稀釋液或賦形劑。優選無菌和無熱原質形式的組合物。
本發明的第十二個方面提供了第二個方面所述蛋白或片段在製備治療癌症，尤其是食管腫瘤的藥物中的應用。
本發明的第十三個方面提供了一種藥物組合物，其包含第四方面的載體，尤其是病毒載體，與藥物可接受的載體、稀釋液或賦形劑。優選無菌和無熱原質形式的組合物。更優選該組合物與類固醇或其它抗細胞因子，例如TNF受體，聯合進行治療，以減輕炎症反應。
下面用下列非限制的附圖、序列表和實施例對本發明作進一步的描述。進一步體現對於本領域技術人員按照這些描述所作的改動都落入本發明的保護範圍。
附圖附圖1食管癌在全世界的發病率地圖。
附圖2遍及世界的各種癌症的死亡率。
附圖3食管癌在中國的分布。
附圖4正常和異常食管癌組織的Northern雜交結果。
附圖5本發明全長ECRG1蛋白在各個pH值的淨電荷。
附圖6全長ECRG1蛋白的抗原決定部位分析，SEQ ID NO 2中所列胺基酸序列位於水平軸。
附圖7本發明蛋白的穩定構型。
附圖8ECRG1基因染色體4q22-25上的位置。
附圖9在E coli中表達融合蛋白所用質粒pGEX-4T-1-ECRG1的構建步驟。
附圖10和11蛋白表達的Western雜交雜交凝膠圖譜。
附圖12抗BALB/C小鼠來源的純化蛋白的抗體與GST融合蛋白的抗血清免疫反應活性。
附圖13與GST的抗血清免疫反應活性，其顯示與蛋白的不同。
附圖14一個能在人細胞中表達GST-ECRG1的真核表達質粒pcDNA3-ECRG1的構建步驟。
附圖15GST-ECRG1通過pcDNA-ECRG1質粒在NEC細胞中表達。
附圖16用GST融合蛋白處理過的NEC細胞的生長曲線。
附圖17NEC細胞接觸GST融合蛋白後的抑制率。
附圖18體外培養的NEC細胞的幻燈片，證明加入編碼質粒的GST-ECRG1融合蛋白後對生長的作用。
附圖19GST-ECRG1融合蛋白劑量從0.05mg/ml增加到0.4mg/ml的作用。
附圖20ECRG1基因轉染的NEC細胞生長抑制圖。
附圖21ECRG1基因轉染的NEC細胞生長抑制速度。
附圖22細胞數與DNA含量的細胞周期測定，表明NEC細胞的細胞周期各個階段的細胞比例。
附圖23細胞數與DNA含量的細胞周期測定，表明經GST融合蛋白處理的NEC細胞的細胞周期各個階段的細胞比例。
附圖24細胞數與DNA含量的細胞周期測定，表明經pcDNA3-ECRG1轉染的NEC細胞的細胞周期各個階段的細胞比例。
附圖25細胞數與DNA含量的細胞周期測定，表明經pcDNA3-ECRG1轉染的NEC細胞誘導腫瘤後，腫瘤細胞的細胞周期各個階段的細胞比例。
附圖26細胞數與DNA含量的細胞周期測定，表明用無ECRG1基因的pcDNA3轉染的NEC細胞的細胞周期各個階段的細胞比例。
附圖27細胞數與DNA含量的細胞周期測定，表明經pcDNA3轉染的NEC細胞誘導腫瘤後，腫瘤細胞的細胞周期各個階段的細胞比例。
附圖28細胞數與DNA含量的細胞周期測定，表明經pcDNA3-ECRG1轉染的NEC細胞誘導腫瘤後，腫瘤細胞的細胞周期各個階段的細胞比例。
序列表SEQ ID NO 1表示ECRG1的cDNA序列，其5』端有80個鹼基，3』端有122個鹼基，包括多聚腺苷酸尾。
SEQ ID NO 2表示ECRG1蛋白的胺基酸序列。
實施例1使用設計而成的長引物利用cDNA末端(RACE)5』快速擴增法獲得全長ECRG 1，並測定全部核苷酸序列。Northern雜交分析ECRG-1 mRNA得到約1.2kb的單一信號。GENBANK中序列同源性分析表明現登錄號AF071882的新序列沒有與其高度同源的序列，由此鑑定出該序列是新的序列。
逆轉錄酶PCR(RT-PCR)法檢測ECRG-1在EC中的表達。在正常胎兒大腦、成人大腦、肝臟、腎臟、睪丸、骨髓和骨骼肌7個cDNA文庫以及8個人胎兒組織，例如腦、肺、肌肉、皮膚、腎臟、腸道和腺體中，發現ECRG-1的表達。ECRG-1在7個正常食管上皮的表達100％陽性，但在44個EC患者中僅4.55％，p＜0.01。在26個腫瘤附近組織，其表達為46.15％，p＜0.05。這些結果表明ECRG-1基因產物是腫瘤抑制基因，其在EC發病和進展過程中起著重要的作用。
實施例2用放射雜交法測定ECRG-1基因在染色體上的位置。發現此基因位於染色體4q22-25。
實施例3通過生物信息來預測ECRG-1蛋白產物的結構和功能，表明它是一種與絲氨酸蛋白酶類似的跨膜蛋白。蛋白分子量約為45kD，三維晶體結構同絲氨酸蛋白酶。
表1 ECRG-1蛋白的功能位點
信息肽和跨膜位點被鑑定為NLKPWMIAVLIVLSLTVVAVTIGLLVHFLVFDQ。
實施例3將ECRG-1 cDNA插入到可被ITPG誘導的表達質粒中，用Western雜交法鑑定表達蛋白。用純化蛋白免疫BLAB/C小鼠，產生多克隆抗體。直接ELISA測定抗體的效價是1∶3200。
用質粒PGEX型PGEX-4T-ECRG-1在E.coli中表達GST-ECRG-1蛋白。
實施例4構建含ECRG-1基因的真核表達質粒，轉染先前缺乏ECRG-1表達活性的NEC細胞。通過RT-PCR和Western雜交鑑定ECRG-1基因轉染克隆。
與未被ECRG-1基因轉染的細胞相比，ECRG-1基因轉染的細胞的增殖率降低，腫瘤重量和體積也降低。當ECRG-1基因轉染到NEC細胞中，NEC細胞的增殖率降低(表2)。還發現ECRG-1基因轉染的NEC細胞較未被轉染的細胞相比，腫瘤重量和體積顯著降低。我們的發現表明ECRG-1基因在體外和體內都能顯著抑制NEC細胞的生長。
表2 ECRG-1基因轉染和無ECRG-1基因轉染的細胞腫瘤抑制速度
實施例5ECRG-1基因編碼的蛋白能抑制食管癌細胞增殖。經NMBA2A(NEC)誘導的人胎兒的食管癌細胞與融合蛋白培養，將NEC細胞腫瘤移植到裸鼠，然後注射ECRG-1融合蛋白。重組融合蛋白在體外和體內都能顯著抑制腫瘤生長。
與未被ECRG-1基因轉染的細胞相比，ECRG-1基因轉染的NEC細胞的增殖率降低，腫瘤重量和體積也顯著降低。這些結果表明ECRG-1及其蛋白在體外和體內均可調節細胞周期G2期延長。此外，被ECRG-1基因轉染的NEC細胞腫瘤血管形成減少。
表2經GST-ECRG-1蛋白處理的NEC腫瘤重量和體積
融合蛋白組與對照組P＜0.05表3融合蛋白對NEC細胞周期的影響
表4 ECRG-1轉染NEC細胞對細胞周期的影響
序列表110BTG國際有限公司120藥用蛋白和核酸130ECRG11401411602170PatentIn Ver.2.121012111375212DNA213Homo sapiens220221CDS222(81)..(1253)4001atcacgagat gtcatatagt tgattagtta gttgagttca gtgggtgcag acctgcaaga 60tcatattctt cctcctgtac atg atg tat cgg aca gta gga ttt ggc acc cga 113Met Met Tyr Arg Thr Val Gly Phe Gly Thr Arg1 5 10agc aga aat ctg aag cca tgg atg att gcc gtt ctc att gtg ttg tcc 161ser Arg Asn Leu Lys Pro Trp Met Ile Ala Val Leu Ile Val Leu Ser15 20 25ctg aca gtg gtg gca gtg acc ata ggt ctc ctg gtt cac ttc cta gta 209Leu Thr Val Val Ala Val Thr Ile Gly Leu Leu Val His Phe Leu Val30 35 40ttt gac caa aaa aag gag ttc tat cct ggc tcc ttt aaa att tta gat 257Phe Asp Gln Lys Lys Glu Phe Tyr Pro Gly Ser Phe Lys Ile Leu Asp45 50 55ccg caa atc aat aac aat ttc gga caa agc aac aca tat caa ctt aag 305Pro Gln Ile Asn Asn Asn Phe Gly Gln Ser Asn Thr Tyr Gln Leu Lys60 65 70 75gac tta cga gag acg acc gaa aat ttg gtg gat gag ata ttt ata gat 353Asp Leu Arg Glu Thr Thr Glu Asn Leu Val Asp Glu Ile Phe Ile Asp80 85 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權利要求
1.分離或純化的編碼蛋白或其片段的核酸序列，所述蛋白含有SEQ IDNO 2的胺基酸序列，或與之有至少50％同源性的胺基酸序列，其中所說的蛋白或其肽片段具有抑制食管上皮細胞腫瘤生長速度的活性。
2.權利要求1的核酸，其特徵在於其分子量在43和47kD之間。
3.權利要求1或2的核酸，其特徵在於它編碼的活性蛋白或片段序列結合或側接於一個或更多編碼標記序列，例如GST或GFP融合序列的區域，或能增強對細胞膜，尤其是食管上皮細胞膜穿透力的序列的區域。
4.權利要求1至3任一項的核酸序列，其特徵在於能夠在標準嚴格雜交條件下與SEQ ID NO 1的核酸雜交，標準嚴格雜交條件是2×SSC，65℃；更優選的高度嚴格條件是0.2×SSC，65℃。
5.權利要求1-4任一項的核酸，其特徵在於該核酸是mRNA，cDNA，探針或引物。
6.權利要求1-5任一項所述的DNA，它與啟動子序列及任選的其他調控序列可操縱地連接，這些序列允許DNA表達，從而在細胞內產生本發明所述的食管腫瘤生長抑制蛋白或片段。
7.權利要求6的DNA，其中細胞用於產生蛋白，然後由細胞中分離並純化蛋白作為抗腫瘤藥劑、疫苗或診斷試劑盒的一部分。
8.分離、純化、無菌或無熱原質形式的蛋白或其片段，其包含SEQ IDNO 2的胺基酸序列，或與所述胺基酸序列有至少50％同源性，其中所說的蛋白或肽片段具有抑制食管上皮細胞腫瘤生長速度的活性。
9.權利要求8的蛋白，其分子量在43和47kD之間。
10.權利要求8或9的蛋白或片段，其結合或側接於一個或更多標記物胺基酸序列，例如GST或GFP融合序列，或能增強對細胞膜，尤其是食管上皮細胞膜穿透力的序列。
11.包含權利要求1-7任一項的核酸的能表達權利要求8，9或10的蛋白或蛋白片段的表達載體，所述核酸與啟動子或任選的其他能引起蛋白或片段在靶腫瘤細胞或蛋白生成細胞中表達的調控區域可操縱地連接。
12.權利要求11的載體，其特徵在於它是具有感染食管上皮細胞並表達蛋白或片段的突變病毒。
13.權利要求1-7任一項的核酸轉染的細胞。
14.權利要求8-10任一項的蛋白或片段的抗體。
15.一種診斷編碼異常食管腫瘤生長抑制蛋白的基因ECRG1存在的方法，包括確定患者食管組織樣本中是否存在所述基因和/或測序，並將其蛋白產物與已知的SEQ ID NO 2及其具有減低或增強的抑制食管上皮細胞腫瘤生長效果的變體序列的蛋白產物進行比較，確定所述基因序列丟失或ECRG1活性降低的患者存在發生食管腫瘤的高危因素。
16.一種治療可疑癌症患者的方法，包括給患者施用有效量的權利要求8-10中任一項的蛋白或片段，抑制腫瘤的生長。該可疑癌症優選食管腫瘤。
17.一種治療可疑癌症患者的方法，包括給患者施用有效量的權利要求12的病毒載體，感染任何腫瘤細胞，並在細胞內產生有效量的蛋白或蛋白片段來抑制腫瘤的生長。該可疑癌症優選食管癌。
18.一種延長癌細胞的細胞周期的方法，包括用權利要求8-12任一項的蛋白或片段或載體處理該細胞。
19.一種藥物組合物，包括權利要求8-10任一項的蛋白或其片段與藥物可接受的載體、稀釋液或賦形劑。優選無菌和無熱原質形式的組合物。
20.權利要求8-10任一項的蛋白或片段在製備治療癌症，尤其是食管腫瘤的藥物中的應用。
21.一種藥物組合物，包含權利要求11的載體，尤其是病毒載體，與藥物可接受的載體、稀釋液或賦形劑。
全文摘要
本發明提供了一種以前未被鑑定的蛋白和片段，其具有抑制食管腫瘤生長的活性。
文檔編號C07K14/47GK1425681SQ0113838
公開日2003年6月25日 申請日期2001年12月12日 優先權日2001年12月12日
發明者S·H·盧 申請人:中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所, 國家癌症研究基金