溶藻弧菌外膜蛋白va0760的表達和作為疫苗組份的應用的製作方法
2023-05-30 05:27:11 2
專利名稱：溶藻弧菌外膜蛋白va0760的表達和作為疫苗組份的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及溶藻弧菌(WZvvo"/g/'"o/"/"")表達的一種外膜蛋白(outer membrane protein, OM protein) VA0760的免疫調節功能。
背景技術：
溶藻弧菌廣泛分布於世界各地海水及河口處，並且數量居海水類弧菌之首，對於溶藻弧 菌致病微生物，研究的重點就是免疫學分析，闡明其致病機理並找出有效的防治方法，防治 的辦法主要包括藥物即抗生素防治以及免疫防治，其中抗生素雖然在最初的使用中取得了巨 大的進展，然而隨著抗生素的廣泛使用，也出現了一系列的相關問題， 一方面抗生素的不合 理使用，增加抗生素耐藥菌的產生，細菌感染增多；另一方面，因抗生素的耐藥性而人為地 加大劑量，加劇耐藥性的產生。因此，研製以具有免疫保護作用的高效中和抗原為成分的疫 苗具有廣闊的應用前景。
在各種動物疾病的防治中，疫苗的使用是一個具有低成本、高效的方法，並且已經有部 分疫苗得到大規模使用並取得了不錯的防治效果。疫苗種類很多，以細菌為例，包括全菌疫 苗、亞單位疫苗以及DNA疫苗等。從實際應用的情況來看，全菌疫苗雖然具有製作相對簡 單而且成本也較低的優點，但它也存在不少由於使用全菌體而固有的一些缺點。如減毒全f^ 疫苗可能出現菌株突變而導致的毒性恢復等不良後果；滅活全菌疫苗則往往由於對細菌的滅 活過程而導致一些免疫保護基團活性的改變，而影響免疫保護的效果。而且對全菌疫苗來說， 由於細菌成分的複雜性，其中往往存在一些毒性成分(如LPS等)，會導致機體產生不良反 應。並且常規製得的全菌疫苗免疫保護效果不理想。然而，全菌疫苗仍然是目前最為主要的 疫苗種類。其原因可能與高效中和抗原的發現和鑑定困難有關。
隨著基因組學、蛋白質組學和轉錄分布圖技術的發展，這就為細菌疫苗提供了新的契機。 基因工程疫苗由於具有高效、且擺脫了傳統疫苗的種種缺點，成為疫苗研究的重點，具有廣 闊的應用與開發前景。外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分之一，由於外膜蛋白直接面 對宿主的體液及組織，細菌利用外膜蛋白進行黏附、侵入和炎症等生理活動，更容易被宿主 識別作為攻擊目標，使得革蘭氏陰性菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不僅可以刺激體液 免疫，而且對細胞免疫亦有刺激作用。近年來，細菌的一些外膜蛋白已經被證實具有良好的 免疫原性，用其製備基因工程疫苗具有良好的前景。如在大腸桿菌中發現外膜蛋白OmpX的
免疫保護功能。但在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報導過本專利申請中提及的溶藻 弧菌外膜蛋白VA0760的免疫調節功能。
本專利率先採用分子克隆和免疫學等現代生物學技術，以溶藻弧菌為研究對象，對外膜 蛋白基因VA0760進行克隆、表達和純化，並在此基礎上深入研究其免疫保護性。免疫和攻 毒實驗結果表明溶藻弧菌的外膜蛋白VA0760顯示出對溶藻弧菌較高的免疫保護作用。其相 對免疫保護率(RPS)為75%，此外還顯示出對螢光假單胞菌的交叉免疫原性，其免疫保護 率(RPS)達到52.6%。這些結果說明VA0760可作為疫苗組分。
發明內容
外膜蛋白具有良好的免疫原性，對細胞免疫和體液免疫均有刺激作用。本發明涉及通過 對表達的溶藻弧菌外膜蛋白VA0760免疫保護性以及免疫交叉性的分析，發現免疫鯽魚後可 以顯著提高對重要致病菌溶藻弧菌以及螢光假單胞菌的抵制力。初步評價其作為候選疫苗的 可行性，對水產疾病的防治具有重要意義。
圖1. VA0760基因PCR產物0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析
圖2. pET-28a- VA0760重組子的雙酶切鑑定
圖3.克隆子BL21-pET-28a- VA0760在五.co/Z-BL21中的誘導表達
圖4. SDS-PAGE分析純化的重組蛋白.lane 1:克隆子BL21-pET-28a- VA0760誘導表
達上清；lane 2:純化的重組蛋白
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不 用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例 如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的條 件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1
溶藻弧菌外膜蛋白VA0760基因的克隆和鑑定 1.溶藻弧菌VA0760基因的擴增
由於溶藻弧菌基因的全序列還未測定，目前也無該菌的VA0760基因序列報導。鑑於副 溶血弧菌已完成全序列測定，並於2006年3月在資料庫GenBank (BA000031)公布，我們 按其資料庫上已公布的VP0760序列設計了 VA0760基因引物，用於溶藻弧菌VA0760的PCR
擴增。所設計的引物是上遊引物5'-ATAge^ECCATGTCTTACCTAAAGAAAAGCC-3'; 下遊引物5，- CGCAAGCTTTTAGAAGTAGTATTCAAC-3':橫線所示為酶切位點，上遊引 物引入5amH/酶切位點，下遊引物引入/^>^///酶切位點。使用細菌基因組DNA提取試劑 盒(TIANGEN公司)，按照試劑盒內的使用說明書提取溶藻弧菌的全基因組DNA作為模板， 採用上述引物進行PCR擴增，圖1所示PCR擴增結果。從圖可見，基因擴增產物為單一特 異條帶，va0760基因約1119bp，與預計的片段大小相當。
2、溶藻弧菌va0760基因的克隆、篩選和鑑定
將基因PCR產物使用0.8。/。瓊脂糖/溴化乙錠凝膠進行電泳，通過新配置的瓊脂糖凝膠電 泳純化，按購自TIANGEN公司的凝膠回收試劑盒(DNA Gel Extraction Kit)的說明書進行 回收。用乾淨的、鋒利的刀片，在短波長紫外燈下，切下目的PCR擴增片段，儘可能地切除 多餘的膠，置於乾淨、已稱重的離心管中，稱重並記錄切下目的膠的重量；然後按照說明書 的步驟，依次加入各種溶液、離心、過柱、洗脫等，最後得到基因PCR回收產物，置於-20 'c保存。取少量進行回收效果電泳檢測。
待基因PCR擴增產物回收後，分別採用相應的限制性內切酶^""^/浙//7^////(1^&1"3 公司)進行雙酶切，同時對載體pET-28a (Novagen公司)進行雙酶切(37'c酶切過夜)， 酶切後使用乙醇沉澱回收。方法如下向酶切體系加入1/10體積的NaAc (3M， pH5.2)和 2.5倍體積的無水乙醇，經-2(tc靜置60min後，12000卬m離心15min，棄上清，加500 、1 70 %的乙醇洗滌，12000rpm離心5min，棄上清，重複洗滌一次，洗滌完後小心地倒盡液體， 用濾紙吸盡乙醇，置超淨臺中自然風乾，風乾後直接溶於適量的去離子無菌水。
將兩者回收後加入連接酶(Takara公司)，調節水溫16°c，之後連接過夜。將連接產 物與約100(11/)//5 感受態細胞混合，冰浴30min後42。c熱激90s，並立即冰浴5min，加新 鮮LB培養基補足體積至lml，置於37'C搖床150rpm緩慢培養45min，取培養液10000rpm 離心30s，棄85(^1上清，餘下菌液重懸均勻，塗布含卡那黴素(100 、g/ml) LB平板，待 轉化液被平板完全吸收後，於37'C倒置培養12 16小時。
從轉化平板中隨機挑取6個單菌落，接種到5ml按1:500比例添加卡那黴素(50mg/ml) 的LB液體培養基中，37'c培養8h，採用鹼裂解法小量提取質粒。方法如下將菌液轉入 1.5mL微量離心管中，4'Cl0000g離心1 min，吸出培養液，力卩100 冰預冷的溶液I (50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl pH 8.0， 10 mmol/L EDTA)劇烈振蕩至細菌沉澱完全重 懸。室溫下靜止2min，力卩200hL現配的溶液I1 (0.2mmol/LNaOH， 1% SDS)，蓋緊管口，
快速上下輕微顛倒幾次混勻，冰浴5min，加15 Mu L冰預冷的溶液III (60mL 5mol/L乙酸鉀， 11.5mL冰乙酸，28.5mLH20)，反覆顛倒幾次使粘稠的細菌裂解物分散均勻，冰浴5min。 4°C 下12000g離心7 min，轉移350pL上清到另一離心管，用等量體積的酚/氯仿抽提2次，加 2倍體積的冰冷無水乙醇，上下顛倒混勻。室溫靜置2min， 4。Cl2000g離心5 min。小心去 上清，75%乙醇洗滌2次，棄上清，再將附於管壁上的液滴除盡，用30pL含RNA酶的TE (pH8.0)溶解質粒DNA，稍加振蕩，貯存於-2(TC。用相應的限制性內切酶進行雙酶切進 一步鑑定。如圖2所示，重組質粒pET-28a-VA0760可酶切出與PCR產物大小相當片段大 小一致的片段，表明基因已成功地插入到pET-28a載體中。運用Beckman CEQ末端標記循 環測序將已經克隆的重組質粒VA0760進行序列測定。 實施例2
溶藻弧菌VA0760蛋白的表達 1預測胺基酸序列
基因VA0760為中等長度片段，並運用DNAssist軟體分析，獲得其完整的開放閱讀框
ORF
2重組子的原核表達
挑取重組質粒的單菌落接種於lml按1:500比例添加卡那黴素(50mg/ml)的LB液體培 養基中37t:過夜培養至飽和，按l:100接種量接種飽和培養物到5mL的LB培養基中，於37'C 培養約2h至OD6。。約等於0.6左右。在培養物中加入IPTG至終濃度為lmmol/L， 37。C繼續培養 3h。取出經過誘導的培養物室溫高速離心lmin，收集菌體。同時設立對照組，沉澱重懸於 訓nL2xSDS凝膠加樣buffer中，10(TC加熱5min。 12000rpm，離心10min。取適量上請樣品 上樣於12%SDS聚丙烯醯胺凝膠，電泳至溴酚蘭遷移到分離膠底部。考馬斯亮藍染色，掃描 輸出照片。結果表明VA0760基因重組子已轉入E. coli BL21 並獲得陽性表達如圖3。其重組蛋 白大小約為41kD。因此重組蛋白的分子量在表達圖譜上與預期相符。 實施3
溶藻弧菌VA0760蛋白的純化
挑取重組質粒轉化大腸桿菌BL21/(DE3)，根據相應的載體pET-28a，分別在含有 10Mu g/mL卡那黴素的LB培養基中，37℃培養過夜。隨即挑取單菌落，加5mLLB液於37℃ 振蕩過夜，按1:100的比例轉接至含抗生素的液體LB培養基200mL，37℃振蕩培養約2.5-3h， OD600-0.6時，於瓶中加IPTG (終濃度為1 mmol/L)進行誘導，30°C 200r/min搖3h。 6000g， 4℃離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體2次，稱菌體溼重。
收取的菌體以1:100 (g/mL)溶於buffer D(8M尿素；0.1MNaH2PO4 ; lOmmTris-HCl， pH 8.0)懸浮菌體，超聲破碎，輸出功率60%， 5s/次，間隔9s，超聲30min。超聲破碎後的 菌液，9000g， 4r離心15min，收集上清。超聲離心上清用Ni-NTA親和柱進行純化。採用 pH5.9(buffer F)和pH4.5(buffer G)兩個不同pH值的緩衝液純化蛋白。用衝洗緩衝液buffer E(8M尿素；0.1MNaH2PO4; lOmmTris-HCl, pH6.3)洗滌50次，每次lmL;用洗脫緩衝 液buffer F(8M尿素；0.1MNaH2PO4; lOmmTris-HCl， pH5.9)洗脫目的蛋白4次，每次lmL， 收集洗脫液；用洗脫緩衝液bufferG(8M尿素；0.1MNaH2PO4; 10mmTris-HCl， pH4.5)洗脫 蛋白4次，每次lmL，收集洗脫液。取收集液進行SDS-PAGE電泳結果見圖4， Bradford蛋 白定量法定量，低溫保存備用。
實施例4
溶藻弧菌外膜蛋白VA0760對溶藻弧菌以及螢光假單胞菌的免疫保護作用 純化外膜蛋白VA0760共1.0mg，對鯽魚進行腹腔注射，每次免疫的抗原量為25、g/尾， 每組共20尾。首次免疫使用弗氏完全佐劑乳化，隔兩周加強免疫一次，加強免疫用弗氏不完 全佐劑乳化。同時對照組則注射生理鹽水。並且對健康的鯽魚進行溶藻弧菌以及螢光假單胞 菌半數致死劑量LD5o的測定，根據等對數間距選擇試驗濃度。在加強免疫後第10天，使用5 倍LD5。劑量的溶藻弧菌(5xl07cfU/mL)及螢光假單胞菌(5x 107 cfo/mL)進行攻毒保護性實 驗。腹腔注射攻毒後的第2天，對照組魚的遊動開始變得遲緩，並不斷死亡，而具有免疫保 護作用的VA0760實驗組無異常反應。5天後魚不再陸續死亡，觀察記錄實驗組和對照組對死 亡情況，注射溶藻弧菌以及螢光假單胞菌的對照組存活率分別為20%和5%，而實驗組 VA0760的免疫保護效果有明顯的差別，對溶藻弧菌的免疫保護率(RPS)高達75%，具有 顯著性差異(PO.Ol)。同時VA0760還顯示出對螢光假單胞菌的交叉保護作用，其免疫保護 率(RPS)為52.6% (P<0.05)。經統計學計算表明VA0760具有顯著的免疫保護作用。說明 VA0760可以刺激機體產生保護性抗體，提高宿主免疫保護能力，是一個很好的免疫保護原。
序列表
中山大學
<120〉溶藻弧菌外膜蛋白VA0760的表達和作為疫苗組份的應用
2
<210〉1 1122 <212〉DNA 溶藻弧菌
1
atgtcttacc taaagaaaag cctacttgcc acggcaatta ccggcatgat gttcagtggt 60
gttgcatttg ctgatggtgc aaacagtgac gcagcaaaag agtttctaac caaagattca 120
ttttcttatg 3agttt3cgg gatcatcgcg 3tgcaggccg cgtaccgcga ttacgattct 180
ggcagcaaag caacggacga tgacttgggt ggcatgcagc taaacaacga atctcgtatc 240
ggtttccgtg gtaagaaaca atttgctaac ttcgacccta cttttatttg gcaaatcgaa 300
ggcggttatg tagaccctag ctttggtggc gagggcgcag gtcttggtga acgtgacaca 360 ttcgtcggtt ttgaaagtgc atcttggggg caaattcgcc tgggtcgcgt tttgacacct 420
atgtacgaat tggttgactg gcctgcatct aaccctggcc tgggcgatgt atacgactgg 480
ggtggtgcta ttggtggcgc caagtaccaa gaccgtcaat caaacactat ccgctgggac 540
tctccaatgt ttgctgacaa attctcccta gatatcgcag ctggtgcagg tgataaagca 600
ggtctaggtg aaggggatga ctactggggt ggtatcgctg cacactacaa aattggtcct 660
atccagttag atgcggcata tgaaggtaac cgtaatatca agatggaaag ccaaacgtgg 720
gaaaacaaca cgtacttggt aggggcacaa ggctg柳g ataacggaat ctctttcttc 780
gcgcaataca aatacatgga ggcggacgca agcaatggtg tgagtgaaaa gcaagatgca 840
atgtctgccg ctatcatgta caccacgggt gattggcaat acaaactggc ttacgccgct 900
aactttgatc tagagcgtga tggtaagaaa attaacgata cagcggacga tgtgttatca 960
gcacaagtta tgtatttcgt agacccatcg gcagtgctgt acgtacgtgc tcgtactcta 1020gactttggcg acggtgcgtc tcaattagat aaaccaacag aagcacgttg gaagtctgct 1080 gactacgacg agttctctgt aggtgttgaa tactacttct aa 1122
2 378 PRT 溶藻弧菌
2
Met Ser Tyr Leu Lys Lys Ser Leu Leu Ala Thr Ala lie Thr Gly Met 15 10 15
Met Phe Ser Gly Val Ala Phe Ala Asp Gly Ala Asn Ser Asp Ala Ala
20 25 30
Lys Glu Phe Leu Thr Lys Asp Ser Phe Ser Tyr Glu Val Tyr Gly lie
35 40 45
lie Ala Met Gin Ala Ala Tyr Arg Asp Tyr Asp Ser Gly Ser Lys Ala
50 55 60
Thr Asp Asp Asp Leu Gly Gly Met Gin Leu Asn Asn Glu Ser Arg lie 65 70 75 80
Gly Phe Arg Gly Lys Lys Gin Phe Ala Asn Phe Asp Pro Thr Phe lie
85 90 95
Trp Gin He Glu Gly Gly Tyr Val Asp Pro Ser Phe Gly Gly Glu Gly
100 105 110
Ala Gly Leu Gly Glu Arg Asp Thr Phe Val Gly Phe Glu Ser Ala Ser
115 120 125
Trp Gly Gin He Arg Leu Gly Arg Val Leu Thr Pro Met Tyr Glu Leu
130 135 140
Val Asp Trp Pro Ala Ser Asn Pro Gly Leu Gly Asp Val Tyr Asp Trp 145 150 155 160
Gly Gly Ala lie Gly Gly Ala Lys Tyr Gin Asp Arg Gin Ser Asn Thr
165 170 175
lie Arg Trp Asp Ser Pro Met Phe Ala Asp Lys Phe Ser Leu Asp lie
180 185 l卯
Ala Ala Gly Ala Gly Asp Lys Ala Gly Leu Gly Glu Gly Asp Asp Tyr
195 200 205
Trp Gly Gly lie Ala Ala His Tyr Lys lie Gly Pro lie Gin Leu Asp
210 215 220
Ala Ala Tyr Glu Gly Asn Arg Asn lie Lys Met Glu Ser Gin Thr Trp 225 230 235 240
Glu Asn Asn Thr Tyr Leu Val Gly Ala Gin Gly Trp Phe Asp Asn Gly
245 250 255
lie Ser Phe Phe Ala Gin Tyr Lys Tyr Met Glu Ala Asp Ala Ser Asn
260 265 270
Gly Val Ser Glu Lys Gin Asp Ala Met Ser Ala Ala lie Met Tyr Thr
275 280 285
Thr Gly Asp Trp Gin Tyr Lys Leu Ala Tyr Ala Ala Asn Phe Asp Leu
290 295 300
Glu Arg Asp Gly Lys Lys lie Asn Asp Thr Ala Asp Asp Val Leu Ser 305 310 315 320
Ala Gin Val Met Tyr Phe Val Asp Pro Ser Ala Val Leu Tyr Val Arg
325 330 335
Ala Arg Thr Leu Asp Phe Gly Asp Gly Ala Ser Gin Leu Asp Lys Pro
340 345 350
Thr Glu Ala Arg Trp Lys Ser Ala Asp Tyr Asp Glu Phe Ser Val Gly
355 360 365
Val Glu Tyr Tyr Phe 370
權利要求
1. 一種溶藻弧菌外膜蛋白VA0760，其胺基酸序列序列表400所示。
2. 編碼權利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白VA0760的DNA，其核苷酸序列 如序列表400所示。
3. 權利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白VA0760作為疫苗組份的應用。
4. 權利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白VA0760免疫保護作用的應用。
5. 權利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白VA0760作為提高宿主免疫功能製劑 的應用。
全文摘要
本發明涉及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的一種重組外膜蛋白(outermembrane proteins)VA0760的表達和疫苗組份的作用功能。本發明通過克隆溶藻弧菌重組外膜蛋白VA0760基因、表達及純化，純化產品可以顯著地提高魚類對溶藻弧菌、螢光假單胞菌等病原菌的抵抗力。可作為亞單位疫苗的候選靶位，且對控制弧菌感染的免疫學防治具有十分重要的意義。
文檔編號C12N15/31GK101386642SQ20081002983
公開日2009年3月18日 申請日期2008年7月29日 優先權日2008年7月29日
發明者彭宣憲, 惠 李, 熊莜鵬 申請人:中山大學