一種穩定的重組人白介素-11水溶液及其製備方法

2023-05-30 03:56:21 2

專利名稱：一種穩定的重組人白介素-11水溶液及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種穩定的重組人白介素-Ii水溶液及其製備方法；尤其是一種穩定的不含防腐劑和血液提取成分的重組人白介素-11水溶液及其製備方法。
背景技術：
人白介素-11 (IL-Il)是一種存在於人體骨髓、神經、呼吸道及消化道上皮等多種組織，具有廣泛生理功能的細胞因子。IL-Il是一種強疏水性蛋白，無分子內和分子間二硫鍵的結構，也沒有潛在的糖基化位點，同時其Pl值高達11. 7。IL-Il對造血細胞尤其是巨核細胞具有重要的調控作用，對神經細胞、脂肪細胞及小腸腺窩絨毛幹細胞等非造血細胞亦具有明顯的生物活性，在骨髓造血調控中發揮重要作用。IL-Il用於治療腫瘤放化療引起的血小板減少症，替代血小板輸注。對腫瘤放化療及骨髓移植治療具有較高的臨床應用價值。除用於治療血小板減少症外，重組人白介素-11 (rhIL-11)還具有廣闊的臨床應用前景。如調節腸上皮細胞的生長，促進胃腸道黏膜損傷癒合，刺激破骨細胞的發育和神經祖細胞的增殖，對活動性類風溼性關節炎有緩解作用等。目前國內外市場銷售的rhIL-11尚無水針劑型被批准，目前只有粉針劑。粉針劑成本高，使用時需要加入注射用水，給臨床使用帶來不便。尤其重要的是，粉針劑型存在著外觀不佳、不溶性微粒偏高、可見異物超標等問題，對病人的安全性存在著一定的隱患，因此研製開發rhIL-11水針劑型具有重要的意義。以前的研究結果表明，rhIL-11溶液在存放過程中穩定性較差，不溶性微粒逐漸增高，很快超過允許限度，溶液出現絮狀凝集物或細小蛋白顆粒。我們針對這個課題，展開了一系列的研究，對處方進行了優化，最終研製成功了穩定的rhIL-11的溶液配方，該配方可開發成直接注射給藥的水針劑。水針劑型取代凍幹劑型是生物製品的發展趨勢，許多醫藥公司都積極將細胞因子類蛋白質藥物製成水針劑型，如幹擾素、白介素2、G-CSF, EPO等。與凍幹劑型相比，水針劑型具有明顯優勢，水針無需溶解，直接注射，給藥方便，製造成本明顯降低，易於被醫生和患者接受，質量風險較小等。但是，截止目前，尚無rhIL-11注射液劑型被批准。

發明內容
本發明的目的在於創造性地發明一種穩定的rhIL-11水溶液及其製備方法用於改善rhIL-11粉針重建溶液外觀不佳、不溶性微粒偏高、可見異物超標等問題，而且 rhIL-11水溶液產品質量比粉針劑型有顯著提高。本發明中適宜的穩定劑和緩衝體系是 rhIL-11在溶液狀態下保持穩定的關鍵要素。為了達成上述目的，本發明的解決方案是
一種穩定的重組人白介素-11水溶液，其特徵在於包括如下組分 1)濃度為0. 25-20mg/ml的重組人白介素-11 ；2)維持pH在4.5-8. 5範圍內的濃度為lmM-200mM的緩衝液體系；
3)穩定重組人白介素11的穩定劑；
4)等滲劑；
5)注射用水。所述的水溶液中各組分，每0. 4ml中按如下配方配製濃度為0. 25-20mg/ml的重組人白介素-11 :2mg;2)維持PH在4. 5-8. 5範圍內的濃度為lmM-200mM的緩衝液體系 0. 3-1. Img ；3)穩定重組人白介素-11的穩定劑按總體積的0. 001%_1%加入；4)等滲劑按總體積的0. 1-5%加入；5)注射用水加至0. 4ml。所述的水溶液中各組分，每0. 4ml中優選按如下配方配製濃度為0. 25-20mg/ml 的重組人白介素-11 :2mg ；2)維持PH在4. 5-8. 5範圍內的濃度為lmM-200mM的緩衝液體系0. 4-0. 6mg ；3)穩定重組人白介素-11的穩定劑按總體積的0. 01%_0· 05%加入；4)等滲劑按總體積的0. 1-5%加入；5)注射用水加至0. 4ml。所述的緩衝體系採用磷酸鹽緩衝液，醋酸鹽緩衝液，枸櫞酸鹽緩衝液，丁二酸鹽緩衝液，Tris緩衝液中的一種；其中磷酸鹽緩衝液，其組成為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉或者是磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀；所述的醋酸鹽緩衝液，其組成為醋酸和醋酸鈉或者是醋酸和醋酸鉀；所述的枸櫞酸緩衝液，其組成為枸櫞酸和磷酸氫二鈉或者是枸櫞酸和磷酸氫二鉀； 丁二酸緩衝液，其組成為丁二酸和丁二酸鈉；Tris緩衝液，其組成為Tris鹼和鹽酸。所述的緩衝體系優選採用磷酸鹽緩衝液。所述的穩定劑採用聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯中的一種。(購買廠商德國默克)
所述的穩定劑優選採用聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。所述的等滲劑採用胺基酸、氯化鈉溶液中的一種；且所述的胺基酸加入量為總體積的0. 5-5% ；氯化鈉溶液的加入量為總體積的0. 1-2. 0%。所述的胺基酸優選採用甘氨酸，且其加入量為總體積的2. 3%。一種穩定的重組人白介素-11水溶液的製備方法，包括如下步驟稱取濃度為 lmM-200mM的緩衝液體系；0. 3-1. Img ；穩定劑按總體積的0. 01%_0· 05%量取；等滲劑按總體積的0. 1-5%量取；依次用無菌無熱源注射用水溶解、配製，除菌過濾後加入濃度為 0. 25-20mg/ml重組人白介素-11原液2mg(購於廈門特寶生物工程股份有限公司，申請(專利)號201010201215. 1)；注射用水稀釋至0. 4ml，再次過濾，混勻；所述的除菌過濾器用 0. 2 μ m孔徑濾膜無菌濾器，分裝前取樣檢測無菌、內毒素。分裝在無菌灌封室層流罩內(A 級區)進行，分裝於容量為2ml的西林瓶中，單劑量裝每瓶0.5ml。分裝後成品置2_8°C下保存。本發明的有益效果為本發明的獨特之處在於不僅能保證水溶液的穩定性，解決了粉針劑型外觀不佳的問題，而且首次發現PH對於降解物有關鍵的影響，發明的水針處方與凍乾粉針劑型相比，質量有顯著的提高。首先聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯的選擇是本發明的一個獨特之處，它既是非離子型表面活性劑，也是rhIL-11的穩定劑。該穩定劑可保持rhIL-11的水溶液澄清和性質穩定。適用於本發明的非離子表面活性劑聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯和聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。而緩衝體系對rhIL-11的影響是本發明的另一個獨特之處當PH超過7. 0時，加速試驗表明，SDS-PAGE電泳可見隨著pH升高而逐漸增加的聚合物條帶；當PH超過8. 5，rhIL-11聚合物繼續增加出現沉澱，且這種沉澱是不可逆的；當PH在低於7.0，隨著pH的逐步降低，SDS-PAGE電泳可見隨著pH降低逐漸增加的降解物條帶，當PH降低至4. 5左右時，降解物含量達到2%。而在pH6. 0-7. 0範圍內，rhIL-11樣品質量能保持穩定，加速試驗結果也保持穩定，產品純度均在98%以上，較傳統的粉針劑型質量有明顯的提高。進一步的研究包括等滲劑、緩衝液等。適用於本發明的等滲劑(同時也是蛋白保護劑)為胺基酸水溶液，胺基酸對蛋白有一定的保護作用，同時作為兼具酸性集團和鹼性基團的兩性分子，性質穩定，具有一定的緩衝能力，可保持溶液滲透壓，減少對注射局部的刺激。其中優選的是甘氨酸。適合本發明的緩衝體系是能保持水溶液製劑的PH值範圍在4. 5-8. 5的緩衝體系，包括磷酸鹽緩衝液，醋酸鹽緩衝液，枸櫞酸鹽緩衝液，丁二酸鹽緩衝液，Tris鹽酸緩衝液等，其中優選的是磷酸鹽緩衝液體系
綜上所述本發明解決了凍乾粉針劑型外觀不佳、不溶性微粒偏高，可見異物超標等問題；其次首次發現了 rhIL-11溶液的穩定性與pH範圍和非離子化的表面活性劑有密切關係，是保持水溶液穩定的關鍵因素；更重要的是本發明的rhIL-11水溶液具有很好的穩定性，外觀澄清、聚合物減少、不含防腐劑、不含血液成分；在規定條件下，可穩定保存24個月，且產品質量比粉針劑型有明顯提高。


圖1 是實施例 1-17 在 2-80C W rhIL-11 純度(SDS-PAGE 法)圖譜；
圖2是實施例1-17在45°C加速考察10天的rhIL-11純度(SDS-PAGE法)圖譜。
具體實施例方式以下通過實施例將進一步說明本發明
實施例1-4中水溶液中各組分，每0. 4ml中按表1配方配製；實施例5-8中水溶液中各組分，每0. 4ml中按表2配方配製；實施例9-12中水溶液中各組分，每0. 4ml中按表3配方配製；實施例13-16中水溶液中各組分，每0. 4ml中按表4配方配製；實施例17-20中水溶液中各組分，每0. 4ml中按表5配方配製；
以上各實施例1-20均按照如下方法製備按表中所例的量稱取取濃度為lmM-200mM的緩衝液體系；穩定劑按表中所例的量量取；等滲劑按按表中所例的量量取；依次用無菌無熱源注射用水溶解、配製，除菌過濾後按表中所例的量加入濃度為0. 25-20mg/ml rhIL-11 原液，注射用水稀釋至0. 4ml，再次過濾，混勻；所述的除菌過濾器用0. 2 μ m孔徑濾膜無菌濾器，分裝前取樣檢測無菌、內毒素。分裝在無菌灌封室層流罩內(A級區)進行，分裝於容量為2ml的西林瓶中，單劑量裝每瓶0. 5ml，得到各實施例製備的穩定的重組人白介素-11 水溶液。試驗方案一
實驗例1-20均放置在45°C加速培養箱中考察，比較實驗例1-20在0天與加速10天的不溶性微粒和純度(HPLC-RP)檢測結果，不溶性微粒按照《歐洲藥典》第7版《不溶性微粒檢查法》進行，使用雷射注射液微粒分析儀檢測；純度(HPLC-RP)參考《中國藥典》2010年版三部《高效液相色譜法》，使用WATERS公司生產的高效液相色譜儀檢測。比較實驗例1-17 在0天與加速10天的純度(SDS-PAGE法)檢測結果，純度(SDS-PAGE法)參考《中國藥典》2010年版三部《SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法》，使用穩壓穩流電泳儀檢測。試驗結果
1、實施例1-20在45°C加速考察10天不溶性微粒比較結果見表6，結論為實施例17 在45°C加速考察10天不溶性微粒有明顯升高，其它實施例加速10天均無顯著變化。說明增加聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯能減少不溶性微粒增加，因此對水溶液外觀有明顯改善作用。2、實施例1-20在45°C考察10天rhIL-11純度(HPLC-RP)結果見表7。結論為 實施例1-20在45°C考察10天純度(HPLC-RP)均略有降低，其中實施例1、2、7、11、12、15比其它實施例純度(HPLC-RP)降低稍明顯。3、實施例1-17在45°C考察10天rhIL-11純度(SDS-PAGE)結果見圖1和圖2。結論為實施例1-17在45°C考察10天均發現rhIL-11有少量降解物產生，降解物的大小與緩衝液PH值有關，pH值過高或過低時降解物均會增加。試驗方案二
綜合試驗方案一的不溶性微粒、純度(HPLC-RP)和純度(SDS-PAGE)的考察結果可知rhIL-11水溶液外觀、不溶性微粒與緩衝液pH值有關，本發明內容範圍內的pH值能使 rhIL-11水溶液外觀澄清，且pH值過高或過低時降解物均會增加；胺基酸對rhIL-11水溶液有保護作用，不加胺基酸的實施例會產生更多雜質；聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯能減少不溶性微粒增加，因此對水溶液外觀有明顯改善作用。因此我們將優選PH範圍的實施例 2-6、不含胺基酸的實施例15、不含聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯的實施例17進行進一步加速和長期試驗，確定優選PH值的rhIL-11水溶液在長期貯存中穩定，同時將不含胺基酸和不含聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯的水溶液進行對比，進一步確定這兩種穩定劑的必要性。加速試驗在25°C 士2°C考察30天，主要考察項目有外觀、不溶性微粒。長期試驗主要是在藥品貯存條件2-8°C實時考察，考察30個月，主要考察項目有外觀、不溶性微粒、生物學活性、異常毒性等。試驗結果
1、實施例2-6、實施例15和實施例17在25°C 士 2 °C加速考察穩定性情況 a)外觀外觀均為澄明液體，未見蛋白質聚集。b)不溶性微粒不溶性微粒均合格，實施例2-6和實施例15的不溶性微粒無明顯變化，實施例17的不溶性微粒有顯著增加，加速結果說明聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯能有效減少不溶性微粒增加。> IOym不溶性微粒測定結果(粒/支)見表8。>25μπι不溶性微粒測定結果(粒/支)，見表9。2、實施例2-6、實施例15和實施例17在2_8°C存放30個月穩定性情況
a) 外觀實施例2-6、實施例15和實施例17在2_8°C存放30個月外觀均為澄明液體，未見蛋白質聚集。b) 實施例4在2_8°C存放30個月生物學活性合格。c) 實施例4在2_8°C存放30個月異常毒性檢測合格。d) 實施例3-5在2_8°C存放30個月不溶性微粒檢測合格，實施例17在2_8°C 存放3個月不溶性微粒有顯著增加，說明長期貯存過程中聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯也能有效減少不溶性微粒增加。》10 μ m不溶性微粒測定結果(粒/支)，見表10 ；>25μπι不溶性微粒測定結果(粒/支)，見表11。
表 權利要求
1.一種穩定的重組人白介素-11水溶液，其特徵在於包括如下組分1)濃度為 0. 25-20mg/ml的重組人白介素_11 ；2)維持pH在4. 5-8. 5範圍內的濃度為lmM-200mM的緩衝液體系；3)穩定重組人白介素11的穩定劑；4)等滲劑；5)注射用水。
2.如權利要求1所述的一種穩定的重組人白介素-11水溶液，其特徵在於所述的水溶液中各組分，每0. 4ml中按如下配方配製濃度為0. 25-20mg/ml的重組人白介素_11 :2mg ； 2)維持pH在4. 5-8. 5範圍內的濃度為lmM-200mM的緩衝液體系0. 3-1. Img ；3)穩定重組人白介素11的穩定劑按總體積的0. 001%-1%加入；4)等滲劑按總體積的0. 1-5%加入；5) 注射用水加至0. 4ml。
3.如權利要求2所述的一種穩定的重組人白介素-11水溶液，其特徵在於所述的水溶液中各組分，每0. 4ml中按如下配方配製濃度為0. 25-20mg/ml的重組人白介素_11 :2mg ； 2)維持pH在4. 5-8. 5範圍內的濃度為lmM-200mM的緩衝液體系0. 4-0. 6mg ；3)穩定重組人白介素11的穩定劑按總體積的0. 01%-0. 05%加入；4)等滲劑按總體積的0. 1-5%加入； 5)注射用水加至0. 4ml。
4.如權利要求3所述的一種穩定的重組人白介素-11水溶液，其特徵在於所述的緩衝體系採用磷酸鹽緩衝液，醋酸鹽緩衝液，枸櫞酸鹽緩衝液，丁二酸鹽緩衝液，Tris緩衝液中的一種；其中磷酸鹽緩衝液，其組成為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉或者是磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀；所述的醋酸鹽緩衝液，其組成為醋酸和醋酸鈉或者是醋酸和醋酸鉀；所述的枸櫞酸緩衝液，其組成為枸櫞酸和磷酸氫二鈉或者是枸櫞酸和磷酸氫二鉀；丁二酸緩衝液，其組成為丁二酸和丁二酸鈉；Tris緩衝液，其組成為Tris鹼和鹽酸。
5.如權利要求4所述的一種穩定的重組人白介素-11水溶液，其特徵在於所述的緩衝體系採用磷酸鹽緩衝液。
6.如權利要求3所述的一種穩定的重組人白介素-11水溶液，其特徵在於所述的穩定劑採用聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯中的一種。
7.如權利要求6所述的一種穩定的重組人白介素-11水溶液，其特徵在於所述的穩定劑採用聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。
8.如權利要求3所述的一種穩定的重組人白介素-11水溶液，其特徵在於所述的等滲劑採用胺基酸、氯化鈉溶液中的一種；且所述的胺基酸加入量為總體積的0. 5-5% ；氯化鈉溶液的加入量為總體積的0. 1-2. 0%。
9.如權利要求8所述的一種穩定的重組人白介素-11水溶液，其特徵在於所述的胺基酸採用甘氨酸，且其加入量為總體積的2. 3%。
10.一種如權利要求1所述的穩定的重組人白介素-11水溶液的製備方法，其特徵在於包括如下步驟稱取濃度為lmM-200mM的緩衝液體系0. 3-1. Img ；穩定劑按總體積的0. 01%-0. 05%量取；等滲劑按總體積的0. 1-5%量取；依次用無菌無熱源注射用水溶解、 配製，除菌過濾後加入濃度為0. 25-20mg/ml重組人白介素11原液2mg ；注射用水稀釋至 0. 4ml，再次過濾，混勻；所述的除菌過濾器用0. 2 μ m孔徑濾膜無菌濾器，分裝前取樣檢測無菌、內毒素；分裝在無菌灌封室層流罩內進行，分裝於容量為2ml的西林瓶中，單劑量裝每瓶0. 5ml，得到各實施例製備的穩定的重組人白介素-11水溶液。
全文摘要
本發明公開一種穩定的重組人白介素-11水溶液及其製備方法，其特徵在於包括如下組分1)濃度為0.25-20mg/ml的重組人白介素-11；2)維持pH在4.5-8.5範圍內的濃度為1mM-200mM的緩衝液體系；3)足以穩定重組人白介素11的穩定劑；4)等滲劑；5)注射用水。本發明創造性地發明了一種適合rhIL-11的水溶液配方，其中適宜的穩定劑和緩衝體系是rhIL-11在溶液狀態下保持穩定的關鍵因素。本發明改善了rhIL-11凍乾粉針重建溶液外觀不佳、不溶性微粒偏高、可見異物超標等問題，而且產品質量比粉針劑型有明顯提高。
文檔編號A61K9/08GK102319206SQ201110298750
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者劉斌, 劉滿榮, 孫黎, 張子民, 張林忠, 楊美花, 林輝煌, 遊一玉, 王秋紅, 胡斌, 雷利芳 申請人:廈門特寶生物工程股份有限公司