一種製備l-叔亮氨酸的方法

2023-05-30 11:27:56 2

專利名稱：一種製備l-叔亮氨酸的方法
技術領域：
本發明屬於手性醫藥中間體製備領域，涉及一種生物催化法不對稱製備手性醫藥中間體的方法，具體涉及一種以三甲基丙酮酸為底物，以亮氨酸脫氫酶為生物催化劑，實現單一光學純度的L-叔亮氨酸高效製備的工藝方法。
背景技術：
L-叔売氨酸，即L-2-氨基_3，3_二甲基丁酸,分子式為C6H13NO2,分子量為131. 17,CAS號為20859-02-3。L-叔亮氨酸是一種非蛋白源的手性胺基酸，由於疏水性叔丁基側鏈具有較大空間位阻，在化合物的合成中它能夠很好地控制分子構象，因此，該胺基酸作
為一種重要的醫藥中間體，被廣泛用於合成生物抑制劑、生物活性肽、抗癌和抗病毒等藥物，例如百時美-施貴寶公司2009年銷售額就達到14億美金的抗HIV藥物阿扎他韋；以L-叔亮氨酸作為醫藥中間體合成的抗C型肝炎病毒藥物博賽普韋、特拉普韋，已經完成了臨床研究並於2011年上市；另一些從L-叔亮氨酸合成的抗C型肝炎病毒藥物BI201335，narlaprevir, vaniprevir以及BMS791325,也都進入了二期臨床研究。因此，預計今後醫藥行業對L-叔亮氨酸的需求量將呈現逐年上升的趨勢。傳統的合成醫藥中間體L-叔亮氨酸的方法為化學方法，包括化學拆分法和化學不對稱合成法。前者利用手性拆分試劑對外消旋體進行拆分，例如專利號為200710044378的中國發明專利採用光學純酸性拆分劑拆分消旋叔亮醯胺獲得光學純度的叔亮氨酸，但最大收率不超過50% (參見Chem. Pharm. Bull. 1989，37，280-283);不對稱合成法則可以直接合成L-叔亮氨酸，如Corey等利用叔丁基三氯甲基酮合成L-叔亮氨酸，得率近80%。但是，不對稱合成存在諸多不足反應過程複雜、反應條件苛刻(_78°C)、生產成本高，並且在生產過程中需要用到多種有毒試劑，環境汙染嚴重(參見J. Am. Chem. Soc. 1992，114， 1906-1908)。由於生物催化技術具有很強的底物專一性、較高的催化效率、溫和的反應條件以及對環境汙染較小等優點，已被廣泛用於製備L-叔亮氨酸。通過生物催化合成L-叔亮氨酸主要包括兩大類方法，即利用酶拆分光學活性叔亮氨酸以製備L-叔亮氨酸的方法和生物催化直接合成L-叔亮氨酸的方法。例如專利號為200610020854的中國發明專利利用米麴黴氨基醯化酶以及中國專利201010138158利用一種雙酶體系(醯化胺基酸消旋酶和水解酶)都能拆分叔亮氨酸消旋體，製備高光學純度的L-叔亮氨酸(光學純度達99%ee值以上)。雖然這兩種方法的生產成本適中，便於工業化生產，整個生產過程也較簡單，但是，L-叔亮氨酸的理論得率低於50%。利用生物催化手段直接合成L-叔亮氨酸的方法，能提高L-叔亮氨酸的得率，如歐洲專利EP0726891B1用合適的酶(酯酶，脂肪酶或蛋白酶)催化底物azlactones合成目標產物L-叔亮氨酸以及美國專利US6197558B1利用轉氨酶催化合成L-叔亮氨酸的方法。但是，這些方法操作步驟較多，工序繁瑣，過程中需要用到較多有機溶劑，生產成本較高，並造成環境汙染。Bommarius等報導了甲酸脫氫酶與亮氨酸脫氫酶的偶聯繫統，利用甲酸脫氫酶為亮氨酸脫氫酶提供必要的還原型輔酶NADH，合成L-叔亮氨酸(參見Tetrahedron Asymmetry 1995, 6, 2851-2888 ； Org. Process Res. Dev. 2000,4，286 290)。然而，該方法受到底物濃度低，輔酶投入量大以及生產過程複雜導致成本過高等因素的制約。Esaki等用含有亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的全細胞催化劑對α酮羧酸進行還原轉氨合成L-叔亮氨酸(參見Appli. Environm. Microbiology 1997, 63,4651-4656)。該方法雖然能夠避免外加輔酶，但是用此種全細胞催化劑進行反應時，終產物的最大濃度約為0. 3M，難以進行工業化應用。中國專利CN1934264也採用類似的全細胞催化劑轉化酮羧酸為L-叔亮氨酸，其優選的最大穩定底物濃度小於0. 4M，由於其產物濃度仍然較低，不利於工業化生產。Kula等用經分離後的亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶偶聯催化底物三甲基丙酮酸合成L-叔亮氨酸(參見J. Biotechnol. 1997，53，29-39)。雖然該方法能將底物的濃度提高到O. 5 1M，但L-叔亮氨酸的產率只有85%，並且該反應需要投入大量外加輔酶(2mM NAD+)，導致生產成本過高，同樣限制了它在工業上的應用。因此，建立一種高效製備L-叔亮氨酸的生物催化工藝以提高底物濃度、減少輔酶投入和簡化生產流程，對降低生產成本具有廣泛的實用價值和重要意義。

發明內容
本發明的發明目的是提供一種製備L-叔亮氨酸的方法，在保證高立體選擇性、高轉化率和高得率的基礎上，有效提高底物濃度，減少輔酶投入，簡化生產工藝和降低生產成本。為達到上述發明目的，本發明採用的技術方案是一種製備L-叔亮氨酸的方法，包括以下步驟
(1)向反應液中加入底物三甲基丙酮酸、共底物甲酸銨、亮氨酸脫氫酶以及由甲酸脫氫酶介導的輔酶循環再生體系，配製得到反應體系；
所述反應液為水或PH7. (ΓΙΟ. O的緩衝液；底物濃度為I. 0M^2. OM ;所述共底物甲酸銨和底物三甲基丙酮酸的摩爾比為I :廣10 I ;所述亮氨酸脫氫酶的濃度大於或等於2U/mL，亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶摩爾比為I : Γ1 5;所述由甲酸脫氫酶介導的輔酶循環再生體系中NAD+或NADH的濃度大於或等於O. OlmM (O. 007g/L)；
(2)步驟(I)所得反應體系在振蕩或攪拌條件下，調節反應體系pH至7.(Γ10. 0，於15飛O 1下，反應製備L-叔亮氨酸。上述技術方案中，步驟⑴中，所述底物三甲基丙酮酸的結構式為
權利要求
1.一種製備L-叔亮氨酸的方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)向反應液中加入底物三甲基丙酮酸、共底物甲酸銨、亮氨酸脫氫酶以及由甲酸脫氫酶介導的輔酶循環再生體系，配製得到反應體系； 所述反應液為水或PH7. (ΓΙΟ. O的緩衝液；底物濃度為I. 0M^2. OM ;所述共底物甲酸銨和底物三甲基丙酮酸的摩爾比為I :廣10 I ;所述亮氨酸脫氫酶的濃度大於或等於2U/mL，亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶摩爾比為I : Γ1 5;所述由甲酸脫氫酶介導的輔酶循環再生體系中NAD+或NADH的濃度大於或等於O. OlmM ； (2)步驟(I)所得反應體系在振蕩或攪拌條件下，調節反應體系pH至7.(Γ10. 0，於15飛O 1下，反應製備L-叔亮氨酸。
2.根據權利要求I所述製備L-叔亮氨酸的方法，其特徵在於，步驟(2)中，在保持反應進行的同時，補加底物三甲基丙酮酸；補加底物的方式選自一次性加入底物或分批加入底物或連續加入底物中的一種；並且保持反應體系中的底物濃度小於或等於2. 0Μ。
3.根據權利要求I所述製備L-叔亮氨酸的方法，其特徵在於，所述製備L-叔亮氨酸的方法還包括步驟(2)反應完成後將反應液於5(T100 °C下加熱，使蛋白變性，離心或過濾除去變性蛋白，除溶劑後，經過濾，得到L-叔亮氨酸產物和含有少量L-叔亮氨酸的濾液。
4.根據權利要求3所述製備L-叔亮氨酸的方法，其特徵在於，所述製備L-叔亮氨酸的方法還包括循環利用濾液，向濾液中補加三甲基丙酮酸、甲酸銨、亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶，構成與步驟(I)相同的反應體系；調節反應體系溶液PH至7. (Γ10. 0，振蕩或攪拌，於15飛O °C下，反應3 24小時，製備L-叔亮氨酸，重複該步驟直至轉化率低於95%。
5.根據權利要求I所述製備L-叔亮氨酸的方法，其特徵在於，所述pH7. (Γ10. O的緩衝液為甲酸銨-氨水緩衝液、氯化銨-氨水緩衝液、Tris-HCl緩衝液或硼酸緩衝液。
全文摘要
本發明公開了一種以亮氨酸脫氫酶為生物催化劑製備單一光學純L-叔亮氨酸的工藝方法，具體包括以下步驟在反應液中加入底物三甲基丙酮酸、甲酸銨、亮氨酸脫氫酶和由甲酸脫氫酶介導的輔酶循環再生體系，振蕩或攪動，反應後加熱反應體系，過濾或離心除去變性蛋白，除去溶劑，過濾後，得到L-叔亮氨酸產物和含有少量L-叔亮氨酸的濾液，濾液循環用於下一輪反應，反應溫度為15~50℃。本發明利用亮氨酸脫氫酶，配合輔酶循環再生體系，採用循環工藝製備L-叔亮氨酸，底物濃度高達2.0M，所需的輔酶NAD+或NADH濃度較低，並且可循環多次使用而達到忽略輔酶成本的水平，具有重要應用價值。
文檔編號C12P13/04GK102888431SQ20111020232
公開日2013年1月23日 申請日期2011年7月19日 優先權日2011年7月19日
發明者陳依軍, 江金鵬, 吳旭日 申請人:陳依軍