一種木黴菌發酵工藝的製作方法

2023-05-29 17:28:06

專利名稱：一種木黴菌發酵工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物領域，特別涉及一種木黴菌發酵工藝。背景技術：
玉米苗期根腐病是一種分布廣、危害嚴重、病原菌種類繁多和防治較困難的世界性病害。該病是由多種病原菌複合侵染引起，主要危害玉米的根及莖基部，引起根系及莖基部受害部位變褐壞死，影響作物對水分和養分的吸收，地上部葉片邊緣出現黃褐色雲紋狀斑。 玉米苗期根腐病的症狀表現為在玉米3-6葉期，地上部生長受到抑制，株型矮小，下部葉片從葉緣開始出現黃化症狀，進而葉片或整株變黃，或出現褐色斑；胚根和鬚根上有褐色病斑，或腐爛，或縊縮。輕者可逐漸恢復，但是生長趨勢明顯減弱，影響產量，重者死亡，造成缺苗斷壟。國外報導引起玉米根腐病的病原菌有禾生腐黴菌、禾穀鐮刀菌、蠕孢菌、串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌等，主要病原菌為腐黴菌和鐮刀菌。國內報導的病原菌有 串珠鐮刀菌、串珠鐮刀菌膠孢變種、禾穀鐮刀菌、蠕孢菌、腐黴菌、絲核菌等。吉林省的優勢種為鐮刀菌佔66-80%，絲核菌佔5%-10% ；浙江省串珠鐮刀菌佔49%-79. 7%，腐黴菌的分離頻率也較高；河北省以鐮刀菌為主，立枯絲核菌為輔。總的看來，玉米根腐病的主要病原菌為串珠鐮刀菌和禾穀鐮刀菌，不同地區病原菌組成因生態環境的不同而略有差異。玉米苗期根腐病的初侵染源為種子和土壤中的病原菌，在適宜的條件下侵入植株地下部，引起發病。傳統的防治方法主要是化學藥劑拌種。但該防治方法存在較多缺點一是化學藥劑只能殺死種子及周圍的病原菌，而對稍遠一些的病原菌卻無能為力，而且在殺死病原菌的同時，也將有益微生物無選擇地殺死；二是藥劑防治，藥量大，毒性大，汙染重， 長期使用會導致病原菌產生抗藥性，使化學藥劑失去了原有的防治作用。木黴菌作為一種生防菌，可以防治很多經濟作物的主要病害，對發生在根部和葉部病害都有很好的防治效果，近年來對儲藏期病害也有研究。木黴菌對一些土傳植物病原菌的防治具有很好的效果，這些病原菌包括絲核菌屬0 i^^to/7ia)、小核菌屬
腫)、鐮刀菌屬(R/sarium)、腐黴屬(Pythium)、疫黴屬 iPhytophthora)等，並且木黴菌的不同種、同種不同菌株甚至同一菌株的不同後代個體都存在著拮抗性的差異及拮抗對象種類上的差別。作為普遍存在並具有豐富資源的拮抗微生物，在土傳病害的生物防治中具有重要的地位。木黴菌的作用機制幾乎包括了所有可能機制，並因此而受到廣泛的關注，也是其用途廣泛、效果突出的重要原因。據報導，木黴菌至少有如下幾種作用機制競爭作用、抗生作用、溶菌作用、寄生作用、誘導抗性、協同拮抗作用。自從1932年Wfeindling發現木黴菌對植物病原真菌有拮抗作用，70多年來國外專家、學者對木黴菌生物藥劑的開發做了許多嘗試和深入的研究。美國的Top shield(哈茨木黴T22)、以色列的Trichodex (哈茨木黴T39)、紐西蘭的木黴製劑Trichodry和 Trichoflow、俄羅斯Kolombet博士研製的木黴製劑(Mycol)、韓國Chung教授研究開發的木黴製劑YC458、西班牙Monte教授採用哈茨木黴和綠色木黴混合開發的生防製劑TUSAL，這些製劑在植物病害防治中都取得很好的防治效果和明顯的增產作用。近年來，國內的科研人員也把生物防治的注意力轉移到拮抗木黴菌上來，並使其逐步在田間得到應用。丁萬隆等用木黴製劑防治西洋參立枯病，李良做了哈茨木黴T. harzianum防治茉莉白絹病，邢雲章等用綠色木黴T. vi ride防治人參根腐病都取得了一定的效果。但現有的木黴菌在防治玉米苗期根腐病方面防病效果不佳，保苗率較低，應用效果不理想。
發明內容
本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種生產周期短、生產成本低、產孢量高的木黴菌發酵工藝。本發明是通過如下技術方案實現的 一種木黴菌發酵工藝，其特徵在於包括如下步驟
(1)將長枝木黴菌株接種到PDA培養基上培養5天；
(2)將麩皮0.5-0. 8g、硫酸銨0. 2-0. 4g、磷酸二氫鉀0. 1-0. 3g、碳酸鈣0. 1-0. 3g、葡萄糖l_2g用無菌水配製成液體發酵培養基IOOmL,調整pH值為5. 5_6，高壓滅菌30-40min，冷卻後，接入步驟(1)所得的長枝木黴菌種，於26-30。C振蕩培養60h後停止，得木黴菌孢子懸浮液；
(3)取重量配比為1:4的菌糠和玉米秸稈粉混合作為培養基質，培養基質含水量為 60%，120°C滅菌30min ；將步驟(2)的木黴菌孢子懸浮液稀釋至濃度為1 X 107cfu/mL，每 IOOg培養基質接種IOmL濃度為IX IO7CfuAiL的木黴菌孢子懸浮液，發酵溫度為^°C、相對溼度為90%，發酵8d停止，風乾後儲存即得；每克發酵物孢子量為LSTXIOiq-LSIXIOiq 個。本發明木黴菌發酵工藝的有益效果是生產周期短，工序簡便，產孢量大，在固體發酵階段木黴分生孢子的產孢量高，每克發酵物含孢子量為1. 37 X IO10-L 51 X 101°個；發酵後製備的木黴菌劑貯存期長，能有效貯存1年以上，防病效果佳，出苗率提高約45%，存活率比對照高50%，保苗效果好，感病指數降低60%，對人畜和生態環境無害，無殘留，不產生抗藥性，原料來源廣，生產成本低於化學農藥多菌靈等，還可以變廢為寶，具有很好的經濟效益和社會效益。

下面結合附圖對本發明作進一步的說明。附圖1為不同載體對木黴菌產孢量的影響圖。具體實施例方式
(A)玉米苗期根腐病病原菌的分離鑑定 (I )方法 ①病原菌分離
玉米苗期根腐病病原菌分離將玉米苗根部用清水衝洗乾淨，剪取根部病健交界處組織0. 5cm左右，用常規方法進行組織表面消毒後，分別放置在PDA和CMA培養基上，培養。5天後對分離物進行初步鑑定。如果是鐮孢菌iFusarium 577/7.)則轉到F8液體培養基上，待其產生大型分生孢子後，挑取單孢進一步純化，供菌種鑑定及測試用。PDA培養基馬鈴薯去皮200g，切碎加水IOOOmL,煮沸20min，紗布過濾，濾液補足至IOOOmL,加葡萄糖20g，瓊脂15g，加熱至熔化；CMA培養基取60g玉米粒放入水中煮lh，過濾，取液體加入20g瓊脂，20g葡萄糖，加水至IOOOmL, pH=7. 0，分裝，滅菌；
F8 液體培養基KH2PO4 2g ；KNO3 2g ；KCl Ig ；MgSO4 Ig ；FeSO4, FeCl3、MnSO4, ZnSO4 各 0. 0002g ；Sug Ig ；水 IOOOmL ；pH=5. 0，分裝，滅菌。②病原菌鑑定
將分離物依據魏景超(真菌鑑定手冊》和Maleolme. shurtleff.的《eompendium of corn disease)) (1980)所描述的無性器官形態特徵及培養形狀鑑定。(II)結果與分析 玉米苗期根腐病病原菌種類
從玉米苗期根腐病病株分離得到的病原菌有串珠鐮孢菌、禾穀鐮孢菌、尖孢鐮孢菌、腐黴菌、立枯絲核菌等，其中串珠鐮孢菌的分離頻率最高，分別為43. 66% ；禾穀鐮孢菌的分離頻率為13. 57%;其它病原菌的分離頻率均在5%以下(表1)。結果說明，引起玉米苗期根腐病的主要病原菌為串珠鐮孢菌和禾穀鐮孢菌。表1玉米苗期根腐病病原菌分離頻率
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(B)玉米苗期根腐病生防木黴菌的篩選方法
(I )方法
①土樣採集
隨機選取玉米種植田塊，每個地塊5點取樣，每取樣點沿玉米根圍從不同位置取樣3 次，取土深度0 20cm，同一田塊5點取樣後將其混合均勻裝入無菌塑膠袋，標明編號、地點、採集時間，帶回實驗室供分離用，共採集36份土樣；
②土壤溶液的製備
將採集到的土樣敲碎、風乾後過篩，取充分混勻的土樣IOg於容量瓶中，加無菌水定容至IOOmL,振動30min。取IOmL 土壤懸浮液加入90mL無菌水中，依次稀釋至10 —6倍，充分搖勻後用於分離；
③木黴菌的分離純化
將稀釋後的土壤懸浮液在振蕩器上振蕩10 20s，吸取ImL 土壤懸浮液至LB瓊脂平板中央，用塗布棒塗勻，並做好濃度標記，塗好的LB瓊脂平板靜置5min，使土壤懸浮液滲透進LB瓊脂平板中，將塗好的LB瓊脂平板倒置於恆溫箱中培養，每濃度重複3次。待 LB瓊脂平板上長出菌落後，挑取菌落邊緣幼嫩菌絲到PDA平板上反覆純化。從形成的單個分散的菌落上移植菌絲體於PDA斜面上冷凍保存待用；
④木黴菌的篩選
從採集的36份土樣中，分離出92株木黴菌株。用PDA培養基復篩後得到拮抗效果較好的 10 個木黴菌株，編號為:T-A2、T-B5、T-B8、T-Bl 1、T-C7、T-ClO、T-D3、T-E4、T-E8、T-F3 ；
⑤對峙培養
將PDA平板上培養5d左右的木黴菌與串珠鐮孢菌分別用打孔器打成大小為6mm的菌餅，分別接種於PDA平板上，2個菌餅相距5cm，於培養7d，逐日觀察並記錄木黴菌和串珠鐮孢菌的菌落生長距離及拮抗情況，計算抑制率。抑制率/% = [ (dCK - dB) /dCK] X 100式中，dCK表示對照病原菌菌落直徑，dB表
示處理病原菌菌落直徑。防效=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數X 100%
對峙培養72h時，挑取兩菌落交界面菌絲製片，用顯微鏡觀察木黴菌與病原菌交集處菌絲生長情況並跟蹤觀察。再以僅接種串珠鐮孢菌為對照，同時做木黴菌和串珠鐮孢菌的純培養試驗並記錄菌落滿皿時間，每處理3次重複。對峙培養的抑制率
從表2看出，10株拮抗效果較好的木黴菌株對串珠鐮孢菌均有不同程度的抑制作用， 抑制率大於70%有5株。其中，T-C7的抑制率高於85%，其最初生長速度均明顯優於供試病原菌，對峙培養3 後兩菌落菌絲相互接觸，後可看到串珠鐮孢菌生長速度迅速降低。由於木黴菌的拮抗，串珠鐮孢菌菌落半徑增加緩慢。顯微鏡下可以看到菌絲相互纏繞摺疊，木黴菌的孢子在病原菌菌落上生長。表2木黴菌對病原菌的拮抗效果
①盆栽防治試驗
將串珠鐮孢菌接於PDA培養基上，置於恆溫培養箱中培養，待其產生孢子後用滅菌水洗下，配成IO4個/mL的孢子懸浮液。選擇大小均一的玉米種子，用體積濃度為70%的酒精消毒5min後用無菌水洗滌3次，再以質量分數為0. 1 %的氯化汞溶液滅菌5min後用無菌水洗滌5次。每盆土重證8，播種6粒。萌發後選取生長均勻的幼苗3株，分成以下3個處理(每個處理3次重複):處理1 IO7個/mL的木黴菌T-C7菌液50mL與50mL上述孢子懸浮液的混合液進行處理；處理2 :lmg/mL的58%甲霜靈錳鋅WP藥液50mL與50mL上述孢子懸浮液的混合液進行處理；處理3 :50mL清水與50mL上述孢子懸浮液的混合液進行處理。用上述三種處理方法的三種混合液分別澆灌幼苗(每盆IOOmL)，30d後調查各處理玉米的發病情況，計算病情指數和防效。玉米根腐病分級標準0=根系健全，無病斑；1=根系上有零星病斑，但不連片；2=根病斑連片，但小於根部周長的1/4 ；3=根病斑大於根部周長的1/4， 但小於1/2 ；4=根病斑大於周長的1/2，但小於3/4 ；5=整個根部均有病斑包圍，根部腐爛。②盆栽防治試驗的防治效果
盆栽防治試驗結果(表3)表明，用木黴菌T-C7防治玉米苗期根腐病，防效為45. 19%， 用58%甲霜靈錳鋅WP藥液防治玉米苗期根腐病，防效為35. 87%，低於木黴菌株T-C7。對各處理的玉米苗生長情況進行觀察，經木黴菌T-C7處理的玉米苗的長勢優於甲霜靈錳鋅處理，表明，木黴菌T-C7對玉米苗的生長具有一定的促進作用。表3盆栽防治試驗的防治效果
權利要求
1. 一種木黴菌發酵工藝，其特徵在於包括如下步驟(1)將長枝木黴菌株接種到PDA培養基上培養5天；(2)將麩皮0.5-0. 8g、硫酸銨0. 2-0. 4g、磷酸二氫鉀0. 1-0. 3g、碳酸鈣0. 1-0. 3g、葡萄糖l_2g用無菌水配製成液體發酵培養基IOOmL,調整pH值為5. 5_6，高壓滅菌30-40min，冷卻後，接入步驟(1)所得的長枝木黴菌種，於26-30°C振蕩培養60h後停止，得木黴菌孢子懸浮液；(3)取重量配比為1:4的菌糠和玉米秸稈粉混合作為培養基質，培養基質含水量為 60%，120°C滅菌30min ；將步驟(2)的木黴菌孢子懸浮液稀釋至濃度為1 X 107cfu/mL，每 IOOg培養基質接種IOmL濃度為IX IO7CfuAiL的木黴菌孢子懸浮液，發酵溫度為^°C、相對溼度為90%，發酵8d停止，風乾後儲存即得；每克發酵物孢子量為LSTXIOiq-LSIXIOiq 個。
全文摘要
本發明涉及生物領域，特別公開了一種木黴菌發酵工藝。該木黴菌發酵工藝，其特徵在於包括如下步驟(1)將長枝木黴菌株接種到PDA培養基上培養；(2)將麩皮、硫酸銨、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、葡萄糖用無菌水配製成液體發酵培養基，接入步驟(1)的長枝木黴菌種培養得木黴菌孢子懸浮液；(3)取菌糠和玉米秸稈粉混合作為培養基質，每100g培養基質接種10mL木黴菌孢子懸浮液，發酵8d停止，風乾後儲存即得。本發明木黴菌發酵工藝的有益效果是生產周期短，工序簡便，產孢量大，在固體發酵階段木黴分生孢子的產孢量高，每克發酵物含孢子量為1.37×1010-1.51×1010個。
文檔編號A01P3/00GK102382791SQ20111037108
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月21日 優先權日2011年11月21日
發明者劉治剛, 寧蕾, 趙春海 申請人:濱州職業學院