一種戊糖片球菌高密度發酵培養基及發酵方法
2023-05-30 05:16:46
專利名稱：一種戊糖片球菌高密度發酵培養基及發酵方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，具體涉及ー種戊糖片球菌高密度發酵培養基及發酵方法，適用於戊糖片球菌的高密度發酵生產。
背景技術：
戍糖片球菌(Pediococcus pentosaceus, P. p)是ー種常見的乳酸菌,細胞圓球形，不形成芽抱，不運動，兼性厭氧，發酵葡萄糖，不產氣，發酵阿拉伯糖、核糖、麥芽糖等，接觸酶陽性，屬於革蘭氏陽性細菌(凌代文，1999，乳酸細菌分類鑑定及實驗方法.中國輕エ業出版社)。戊糖片球菌被認為是動物體內的益生菌，可直接應用於動物餵食、動物飼料 和青貯飼料中。天然乳酸菌飼料添加劑用於秸杆青貯的優勢縮短發酵周期，快速降低PH值；抑制腐敗細菌的生長繁殖，解決飼料的腐敗問題；降解纖維素並轉化為乳酸，提高飼料的利用率；保持飼料的鮮嫩汁液和營養成分，提高飼料的適ロ性和消化率；明顯減少流出物，降低飼料乾物質的損失(Anastasiadou, Growth and metabolism of ameat isolated strain of Pediococcus pentosaceus in submerged fermentationPurification, characterization and properties of the produced pediocin SM-1.Enzyme and Microbial Technology, 2008)。在發酵肉製品中，戍糖片球菌一直是商業發酵劑中的必要成員，可用於各種香腸發酵，井能滿足加工過程中的許多要求，具有較高的競爭性和較好的環境適應性，作為肉製品發酵劑使用吋，從開始接種到產品消費，其均為優勢微生物(Hammes, Starters in tne processing of meat products. Meat SciencjIggzU0戊糖片球菌可以利用碳水化合物產酸，從而使肉製品的pH下降，賦予其特有的風味；另外戊糖片球菌產生的蛋白酶、脂酶及過氧化氫酶等，可使肉中的蛋白質分解為人體易吸收的物質，分解肉中的脂肪酸為短鏈揮發性脂肪酸和酷類物質，同時產生大量風味物質，提高產品的營養價值(楊華，發酵劑及抗氧化劑對鯰魚發酵香腸品質的影響，食品與發酵エ業，2010)。此外在酸性條件下，病原菌和腐敗菌的生長得以抑制，大大提高了發酵肉製品的安全性。此外，戊糖片球菌也是醬油發酵過程中的主要細菌，對醬油獨特風味的形成具有重要作用(Onda, Analysis of lactic acid bacterial flora during Miso fermentation.Food Science and Technology Research, 2003)。目前對戊糖片球菌的研究主要集中在生產應用當中，如動物飼料、青貯飼料、食品等方面，但是對戊糖片球菌發酵エ藝方面的研究卻少之又少，尚未有文獻報導，均用傳統的MRS培養基進行發酵，但傳統的MRS培養基成本較高，最後得到的活菌數較少，一般活菌數在10億/mL。
發明內容
針對現有技術中存在的不足，本發明的第一個目的在於提供了一種エ藝配方設計合理，且能夠提高菌體生物量的戊糖片球菌高密度發酵培養基。
本發明的第二個目的在於提供了ー種上述培養基的製備方法。本發明的第三個目的在於提供了ー種利用上述培養基對戊糖片球菌進行高密度發酵的方法。為實現本發明的第一個目的，本發明採取的技術方案為ー種戊糖片球菌高密度發酵培養基，其原料配方如下蛋白腖I 20g，
酵母粉I 10g，
梓檬酸鈉(C6H5O7Na3· 2H20) O. 5 5g，葡萄糖(C6H12O6)10 50g,こ酸鈉(CH3COONa)I 6g，磷酸氫ニ鉀(K2HPO4· 3H2O) Γ6δ,硫酸鎂(MgSO4· 7H20) O. I 2g，玉米漿2 30g，用蒸懼水定容至1000mL。為了實現本發明的第二個目的，本發明採取的技術方案為上述ー種戊糖片球菌高密度發酵培養基，其製備方法如下I、將蛋白腖I 20g、酵母粉I 10g、檸檬酸鈉0.5 5g、こ酸鈉I 6g、磷酸氫ニ鉀l 6g、硫酸鎂0. l 2g、玉米楽;2^30g混合,用蒸懼水將固體全部溶解並定容至900mL,用5 8mol/L的NaOH和5 8mol/L鹽酸調整pH到6. 2 6. 8，在103. 4kPa壓力、115 121°C溫度下滅菌2(T30min得培養基；2、稱取葡萄糖l(T50g，加蒸餾水溶解並定容至IOOmL,在103. 4kPa蒸汽壓力、115 121 °C溫度下滅菌2(T30min，得葡萄糖溶液；3、將步驟2得到的葡萄糖溶液加入到滅過菌的步驟I的培養基中，得到改良的MRS液體培養基，稱為戊糖片球菌高密度發酵培養基。為了實現本發明的第三個目的，本發明採取的技術方案為ー種利用上述培養基對戊糖片球菌進行高密度發酵的方法，其步驟如下I、將斜面保存的戊糖片球菌用接種環取ー環，接入裝有3(T50mL MRS培養基(葡萄糖20g/L ;蛋白腖10g/L ;酵母粉5g/L ;檸檬酸氫ニ銨2g/L ;こ酸鈉5g/L ;磷酸氫ニ鉀2g/L ；硫酸鎂0. 58g/L ;硫酸錳0. 25g/L)的250mL三角瓶中，在28 40°C條件下，15(T200rpm下震蕩培養，當菌體OD6tltl達到2. (Γ3. O時即得發酵種子液；2、稱取葡萄糖35 40g，加蒸餾水溶解並定容至IOOmL，在103. 4kPa蒸汽壓力、11(T115°C溫度下滅菌2(T30min得補料用葡萄糖溶液；3、將發酵種子液按0. 5°/Γ5%的接種量接種於本發明的戊糖片球菌高密度發酵培養基中，發酵罐裝液量50% 80%，控制罐溫28 40°C，轉速12(T300rpm，通風比0. Γ . 0VVM。在此發酵條件下培養4 10h後，通過滴加5 8mol/LNa0H溶液使發酵液pH保持在5. O 6. 5範圍內，直至發酵結束。當發酵至4 10h時開始補料，之後每隔2h進行一次補料，共補料3次，補料完成後繼續發酵至2(T25h結束髮酵。補料成分為步驟2製得的補料用葡萄糖溶液，毎次加入量為6 12g/L，使發酵體系中葡萄糖濃度為l(T25g/L，發酵結束後葡萄糖終濃度為0. 5 3g/L。
本發明提供的上述戊糖片球菌高密度發酵的方法，得到了ー種戊糖片球菌高密度發酵培養基，以及其高密度發酵エ藝。由於戊糖片球菌自身的特點，在菌體生長過程能利用葡萄糖代謝產生乳酸，使發酵液PH值迅速降低，從而抑制菌體生長，但戊糖片球菌能夠耐受12%的高鹽，因而可以在發酵過程中用一定濃度的NaOH調節發酵液pH值保持在5. (Γ6. 5範圍內，以促進菌體生長。通過在發酵過程中定時取樣測定PH值、OD600和殘糖含量，為補料發酵提供更及時、更準確的指導，給出了更有利於積累菌體的エ藝技術參數。本發明最終菌體生物量OD6tltl可達14. O,菌數為90億/ml。
與現有技術相比，本發明具有如下優點和技術效果I、本發明提供了ー種戍糖片球菌高密度發酵培養基，降低了培養基的生產成本；2、採用控制發酵液pH值的方法進行發酵，促進了菌體的積累；3、NaOH溶液調節pH值過程中產生的高鹽濃度能有效降低雜菌的汙染，在菌劑生產過程中能得到高純度的菌體；4、採用葡萄糖補料的方法進行發酵，延長了對數期的時間，促進了菌體的積累。
圖I為戊糖片球菌CICM B1241在MRS培養基中的種子液生長曲線；圖2為發酵過程中發酵液的pH調節或不調節時菌體生長情況比較圖。
圖中·-發酵過程控制發酵液pH時菌體生物量；·-發酵過程不控制發酵液pH時菌體生物量； ▲-發酵過程控制發酵液pH時殘糖含量；▼-發酵過程不控制發酵液pH時殘糖含量。
具體實施例方式下面申請人將結合具體的實施例對本發明的技術方案做詳細的闡述，但以下內容不在任何意義上解釋為對本發明請求保護範圍的限制。實施例中使用的戊糖片球菌均為戊糖片球菌CICM B1241。 實施例I :I、戊糖片球菌高密度發酵培養基的製備(I)按下列配方備料將蛋白腖15g、酵母粉Sg、檸檬酸鈉3g、こ酸鈉2g、磷酸氫ニ鉀2g、硫酸鎂O. 4g、玉米漿(エ業級玉米漿，購自宜昌華誠生物發酵原料有限公司，蛋白含量彡45%、酸度< 14%、亞硫酸鹽彡O. 3%、灰分彡10%)20g混合，用蒸餾水將固體全部溶解並定容至900mL，用5^8mol/L氫氧化鈉和5 8mol/L鹽酸調整pH到6. 2，在103. 4kPa蒸汽壓力、115°C下滅菌30min得培養基；(2)稱取葡萄糖10g，用蒸餾水溶解並定容至IOOmL,在103. 4kPa蒸汽壓力、110°C下滅菌30min得葡萄糖溶液；(3)將步驟(2)的葡萄糖溶液加入到滅過菌的步驟(I)的培養基中，得到戊糖片球
菌高密度發酵培養基。
2、3L發酵罐高密度發酵A、發酵種子液的培養將斜面保存的戊糖片球菌用接種環取ー環，接入裝有30mLMRS培養基(葡萄糖20g/L ;蛋白腖10g/L ;酵母粉5g/L ;檸檬酸氫ニ銨2g/L ;こ酸鈉5g/L ;磷酸氫ニ鉀2g/L ;硫酸鎂O. 58g/L ;硫酸錳O. 25g/L)的250mL三角瓶中，在35°C條件下，180rpm下震蕩培養，當菌體OD6tltl達到2. (Γ3. O 時即得發酵種子液(戊糖片球菌在MRS培養基中的種子液生長曲線見圖I)。B、補料用葡萄糖溶液的配製稱取葡萄糖40g,加蒸懼水溶解並定容至IOOmL,在103. 4kPa蒸汽壓力、110°C下蒸汽滅菌30min得補料用葡萄糖溶液；C、接種將發酵種子液按1%的接種量接入裝有I. 5L步驟I製備的戊糖片球菌高密度發酵培養基的3L發酵罐中，控制罐溫28°C，轉速120rpm，通風比O. 1VVM，進行發酵培養。D、發酵液pH值調節及補料發酵戊糖片球菌發酵培養至4h後，開始通過級聯控制滴加5 8mol/L的NaOH溶液使pH值保持在5. O 5. 5範圍內，直至發酵結束。在發酵培養至4h時開始補料，向發酵罐中一次補入15mL補料用葡萄糖溶液，之後每隔2h進行一次補料，共補料3次，發酵至20h結束髮酵，此時戊糖片球菌的有效活菌數為50億/mL，菌體OD6tltl是9. (T9. 5。實施例2 I、戊糖片球菌高密度發酵培養基的製備(I)按下列配方備料將蛋白腖10g、酵母粉5g、檸檬酸鈉lg、こ酸鈉lg、磷酸氫ニ鉀2g、硫酸鎂O. 58g、玉米漿(エ業級玉米漿，購自宜昌華誠生物發酵原料有限公司，蛋白含量> 45%、酸度彡14%、亞硫酸鹽彡O. 3%、灰分彡10%)20g混合，用蒸餾水將固體全部溶解並定容至900mL，用5 8mol/L氫氧化鈉和5 8mol/L鹽酸調整pH到6. 4，在103. 4kPa蒸汽壓力、118°C下滅菌25min得培養基；(2)稱取葡萄糖25g,用蒸懼水溶解並定容至IOOmL, 103. 4kPa蒸汽壓力、113°C下滅菌25min得葡萄糖溶液；(3)將步驟(2)的葡萄糖溶液加入到滅過菌的步驟(I)的培養基中，得到戊糖片球菌高密度發酵培養基。2、發酵罐高密度發酵A、發酵種子液的培養將斜面保存的戊糖片球菌用接種環取ー環，接入裝有40mL MRS培養基(葡萄糖20g/L ;蛋白腖10g/L ;酵母粉5g/L ;檸檬酸氫ニ銨2g/L ;こ酸鈉5g/L ;磷酸氫ニ鉀2g/L ;硫酸鎂O. 58g/L ;硫酸錳O. 25g/L)的250mL三角瓶中，在40°C條件下，200rpm下震蕩培養，當菌體OD6tltl達到2. (Γ3. O時即得發酵種子液。B、補料用葡萄糖溶液的配製稱取葡萄糖40g，加蒸餾水溶解並定容至IOOmL,在103. 4kPa蒸汽壓力、113°C下滅菌25min得補料用葡萄糖溶液；
C、接種將發酵種子液按4%的接種量接入裝液量為I. 8L步驟I製備的戊糖片球菌高密度發酵培養基的3L發酵罐中，控制罐溫32°C，轉速200rpm，通風比O. 4VVM，進行發酵培養。D、發酵液pH值調節及補料戊糖片球菌發酵培養至8h後，開始通過級聯控制滴加5 8mol/L的NaOH溶液使pH保持在5. 5 6. O範圍內，直至發酵結束。在發酵培養至6h時開始補料，向發酵罐中一次補入12mL補料用葡萄糖溶液，之後每隔2h進行一次補料，共補料3次，發酵至22h結束髮酵，此時戊糖片球菌有效活菌數為80億/mL，此時菌體OD6tltl是12. (Γ12. 5。實施例3 I、戊糖片球菌高密度發酵培養基的製備(I)按下列配方備料將蛋白腖10g、酵母粉10g、檸檬酸鈉3g、こ酸鈉lg、磷酸氫ニ鉀2g、硫酸鎂O. 58g、玉米漿(エ業級玉米漿，購自宜昌華誠生物發酵原料有限公司，蛋白含量> 45%、酸度彡14%、亞硫酸鹽彡O. 3%、灰分彡10%)20g混合，用蒸餾水將固體全部溶解並定容至900mL，用5 8mol/L氫氧化鈉和5 8mol/L鹽酸調整pH到6. 6，在103. 4kPa蒸汽壓力、121°C下滅菌20min得培養基；(2)稱取葡萄糖40g，用蒸餾水溶解並定容至100mL，103.4kPa蒸汽壓力、115°C下滅菌20min得葡萄糖溶液；(3)將步驟(2)的葡萄糖溶液加入到滅過菌的步驟(I)的培養基中，得到戊糖片球菌高密度發酵培養基。2、發酵罐高密度發酵A、發酵種子液的培養將斜面保存的戊糖片球菌用接種環取ー環，接入裝有50mLMRS培養基(葡萄糖20g/L ;蛋白腖10g/L ;酵母粉5g/L ;檸檬酸氫ニ銨2g/L ;こ酸鈉5g/L ;磷酸氫ニ鉀2g/L ;硫酸鎂O. 58g/L ;硫酸錳O. 25g/L)的250mL三角瓶中，在30°C條件下，150rpm下震蕩培養，當菌體OD6tltl達到2. (Γ3. O時即得發酵種子液。B、補料用葡萄糖溶液的配製稱取葡萄糖35g,加蒸懼水溶解並定容至IOOmL,在103. 4kPa蒸汽壓力、115°C下滅菌20min得補料用葡萄糖溶液；C、接種將發酵種子液按5%的接種量接入裝液量為2. 4L步驟I製備的戊糖片球菌高密度發酵培養基的3L發酵罐中，控制罐溫37°C，轉速300rpm，通風比O. 8VVM，進行發酵培養。D、發酵液pH值調節及補料戊糖片球菌發酵培養至IOh後，開始通過級聯控制滴加5 8mol/L的NaOH使pH保持在6. O 6. 5範圍內，直至發酵結束。在發酵培養至8h時開始補料，向發酵罐中一次補入IOmL補料用葡萄糖溶液，之後每隔2h進行一次補料，共補料3次，發酵至25h結束髮酵，此時戊糖片球菌有效活菌數為90億/mL，此時菌體OD6tltl是13. 5^14. O。本實施例中控制發酵液pH值與不控制發酵液pH值條件下發酵過程的生長曲線及殘糖含量，如圖2所示。
權利要求
1.一種戊糖片球菌高密度發酵培養基，其原料配方如下 蛋白腖I 20 g， 酵母粉廣10 g， 朽1檬酸鈉0. 5^5 g, 葡萄糖10 50 g， 乙酸鈉I 6 g， 磷酸氫二鉀廣6 g， 硫酸鎂0. r2 g， 玉米漿2 30 g， 用蒸餾水定容至1000mL。
2.—種權利要求I所述的戊糖片球菌高密度發酵培養基的製備方法，其步驟如下 (1)、將蛋白腖廣20g、酵母粉flO g、檸檬酸鈉0.5 5 g、乙酸鈉I飛g、磷酸氫二鉀I 6 g、硫酸鎂0. 1 2 g、玉米楽；2 30 g混合,用蒸懼水將固體全部溶解並定容至900mL,用5 8mol/L的NaOH和5 8mol/L鹽酸調整pH到6. 2 6. 8，在103. 4kPa壓力、115 121°C溫度下滅菌2(T30 min得培養基； (2)、稱取葡萄糖10飛0g，加蒸餾水溶解並定容至IOOmL,在103.4kPa蒸汽壓力、115 1211溫度下滅菌20 30 min，得葡萄糖溶液； (3)、將步驟(2)得到的葡萄糖溶液加入到滅過菌的步驟(I)的培養基中，得到戊糖片球菌高密度發酵培養基。
3.一種利用權利要求I所述的戊糖片球菌高密度發酵培養基對戊糖片球菌進行高密度發酵的方法，其步驟如下 (1)、將斜面保存的戊糖片球菌用接種環取一環，接入裝有3(T50mLMRS培養基的三角瓶中，在28 40°C條件下，150^200 rpm下震蕩培養，當菌體OD6tltl達到2. 0^3. 0時即得發酵種子液； (2)、稱取葡萄糖35 40g，加蒸餾水溶解並定容至100 mL，在103.4kPa蒸汽壓力、110 115°C溫度下滅菌20 30 min得補料用葡萄糖溶液； (3)、將發酵種子液按0.59T5%的接種量接種於權利要求I所述的戊糖片球菌高密度發酵培養基中，發酵罐裝液量50% 80%，控制罐溫28 40°C，轉速120 300 rpm，通風比0. I I.0 VVM,在此發酵條件下培養4 10 h後，通過滴加5 8mol/L NaOH溶液使發酵液pH保持在5.0 6. 5範圍內，直至發酵結束；當發酵至4 10 h時開始補料，之後每隔2 h進行一次補料，共補料3次，補料完成後繼續發酵至2(T25 h結束髮酵； 所述補料的成分為步驟(2)製得的補料用葡萄糖溶液，每次加入量為6 12g/L，使發酵體系中葡萄糖濃度為1(T25 g/L，發酵結束後葡萄糖終濃度為0.5 3 g/L。
全文摘要
本發明屬於微生物技術領域，具體公開了一種戊糖片球菌高密度發酵培養基及發酵方法，適用於戊糖片球菌的高密度發酵生產。發酵工藝包括種子液製備和發酵罐培養。發酵罐培養階段包括發酵過程中pH的調節和葡萄糖補料發酵。在發酵過程中通過注入一定濃度的NaOH溶液調節發酵液pH在5.0～6.5範圍內，發酵4~6h後間歇補加葡萄糖，培養20~25h結束髮酵，此時有效活菌數可以達到90億/mL。採用本發明的戊糖片球菌高密度發酵培養基及發酵工藝，使戊糖片球菌的菌體量有大幅度提高。
文檔編號C12N1/20GK102732467SQ20121023389
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月6日 優先權日2012年7月6日
發明者冀志霞, 石娜娜, 祁高富, 陳守文, 馬昕 申請人:華中農業大學