與豬脂肪沉積性狀相關的分子標記及其應用的製作方法

2023-05-30 06:50:41

與豬脂肪沉積性狀相關的分子標記及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種動物分子標記，具體涉及豬ECI1基因片段的克隆及作為分子標記的應用。所述的分子標記的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示，在第157位有一個C157-T157鹼基突變，導致Bsm?Ⅰ-RFLP多態性。
【專利說明】與豬脂肪沉積性狀相關的分子標記及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及動物分子標記領域，具體地說，涉及一種與豬脂肪沉積性狀相關的ECIl基因作為分子標記的應用。
【背景技術】
[0002]養豬業是我國畜牧業生產的主體，其產值長期以來始終都是畜牧業總產值的第一位。隨著人們生活水平的提高，對肉食品的數量和質量需求不斷提高，如何培育出高瘦肉率、高肌內脂肪的豬種是當前豬育種工作的熱點。
[0003]我國豬種資源豐富，為豬育種提供良好的素材，也為研究重要經濟性狀的基因和分子標記提供良好的材料。藏豬是我國特有的高原型豬種，體小皮薄、肉嫩味美，風味濃鬱，肉質細膩、風味獨特，素有「高原之珍」的美譽(劉軒，強巴央宗，王強等.藏豬繁殖性狀多基因效應分析.遺傳，2010,32(5):480-485)。滇南小耳豬是雲南省西雙版納州小型地方品種，具有適應熱帶雨林的區高溫潮溼的生態環境，早熟易肥、抗逆性強、皮薄骨細、肉質鮮嫩、營養豐富等優點(馬俊松，馬啟文，段勇，連林生.原生態養殖版納小耳豬肥育性能、胴體及肉質測定.養豬，2009，(2):37-38)。淮豬是原產淮北平原的古老地方品種，具有繁殖力高、肉質細嫩、在地方豬種瘦肉率較高等特點(張東紅，王立克，陶立，王重龍，李慶崗，陳良雲.淮豬及雜交後代肌纖維直徑變化及其與肉質關係的研究.畜牧與獸醫，2005，37(9):9-11)。藏豬、滇南小耳豬和淮豬是我國特色的地方豬種，具有生長速度慢、沉脂能力強、抗逆、抗病、耐粗飼，尤其肉質細膩、肉嫩味美，風味獨特。大白豬(大約克夏)是世界上著名的、分布最廣的主導瘦肉型豬種，生長速度快，但肉質較差。淮豬新品系利用淮豬為基本素材培育的瘦肉型豬新品系，具有肉質優、瘦肉率高、飼料報酬高、產仔數多、搞病力強、抗應激、適應環境能力強等優點(李慶崗，許金根，陶立.淮豬新品系I系胴體及肉質性能世代選育進展.養豬，2009，(4):33-34)。以上不同脂肪性狀的豬是研究豬脂肪沉積性狀基因的良好材料。`
[0004]隨著分子數量遺傳學、分子生物學技術的飛速發展，有關分子遺傳標記和標
[0005]記輔助選擇的研究被廣泛開展，並在畜禽育種中應用，產生了巨大的影響。月旨肪沉積性狀是豬育種中選擇的主要目標之一，不同品種或類型的豬脂肪沉積有明顯的差另IJ。從分子水平上鑑定影響脂肪沉積的基因或標記是目前豬功能基因研究的熱點之一(Aslan 0，Hamill Rj Davey Gj McBryan J，Mullen A，Gispert Mj Sweeney T:Variationin theIGF2gene promoter region is associated with intramuscular fat contentinporcine skeletal muscle.Mol Biol Rep,2012, 9 (4):4101 - 4110)0 研究者曾通過對基因的多態性與表型性狀的關聯分析及定量表達測定，認為脂肪酸結合蛋白基因(FABP) (Chang W，Richers-Haunerland J，Haunerlang NH.1nduction of cardiac fabpgene expression by long chain fatty acids in cultured rat muscle cells.MolCell Biochem2001，221:127-132)、脂肪酸合成酶(FAS) (Clarke Rj Lbutlton RF.LarkM.The successful translocation of an endangered species with a complex socialorganisation:The black-eared miner.Abstract Volume of the23rd InternationalOrnithological Congress.2002, 191-192)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)(李芳瓊，劉海峰，朱礪.羅格列酮和血清對豬前脂肪細胞誘導分化過程中PPARa和PPAR Y基因表達的影響(英文)[J].Agricultural Science&Technology，2011，5 (06):893_896)、長鏈脂 CoA 合成酶(ACSL) (Zhan Tj Poppelreuther M，Ehehalt Rj FiillekrugJ.0verexpressed FATPlj ACSVL4/FATP4and ACSLlincreasethe cellular fatty aciduptake of3T3_Lladipocytes but are localized on intracellular membranes.PLoS0NE2012，7(9):e45087)等與豬的脂肪沉積有關。但目前，在豬分子育種實踐中仍然缺少功能明確、效應顯著主效基因和分子標記。
[0006]Δ 3-Λ 2-雙烯酯醯-輔酶A異構酶(ECIl)是生物體內核編碼的酶，是線粒體中參與β氧化過程中奇數位置雙鍵新陳代謝所必須的輔酶，它通過將不同位置和長度的反式或順式-3烯酯醯輔酶A轉化為反式-2烯酯醯輔酶A來催化β-氧化反應，是該途徑的關鍵輔酶。研究表明，該基因編碼的酶對鼠和人的不飽和脂肪酸β_氧化有調控作用(Palosaari PM，Kilponen JMj Sormunen RTj et al.Δ 3- Δ 2-enoyl-CoAisomerases.Characterization of the mitochondrial isoenzyme in the rat.JBIOL CHEM1990, 265(6 ):3347-3353;Hiltunen JKjQin Y.Beta-oxidation-strategiesfor the metabolism of a wide variety of acyl-CoA esters.Biochim.Biophys.Acta.2000，1484:117 - 128)。小鼠線粒體ECIl基因被敲除後會引起很多脂肪酸新陳代謝過程中的改變，諸如肝的脂肪變性和尿液中中間產物不飽和乙二酸的增加(JanssenU and Stoffel W.Disruption of mitochondrial beta-oxidation of unsaturatedfatty acids in the3，2-trans-enoyl-CoA inomerase—deficient mouse.J BiolChemj2002，277(22):19576-19584)。
[0007]基於該基因在生長發育過程中起到的重要作用， 申請人:推測豬ECIl基因可能在影響豬脂肪沉積中起到重要作用，因此將豬ECIl基因作為脂肪沉積的候選基因，採用電子克隆及PCR測序獲取豬ECIl基因序列，並PCR測序技術篩選不同類型豬群體間差異的SNP位點，建立了快速檢測方法，獲得了影響豬脂肪沉積的SNP位點及基因型效應。

【發明內容】

[0008]本發明的目的在於克隆與豬脂肪沉積性狀相關的ECIl基因，尋找ECIl基因的突變位點以及作為豬脂肪沉積相關基因的多態性檢測方法，為標記輔助育種提供一種有用的分子標記。
[0009]為了實現本發明目的，本發明首先提供一種與豬脂肪沉積性狀相關的分子標記，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所述，在第157位有I個C157-T157鹼基突變，導致Bsm 1-RFLP 多態性。
[0010]所述鹼基突變的位點位於豬ECIl基因第3內含子第54bp處，命名為Intron3-C54To
[0011]本發明還提供一種所述分子標記的製備方法，其以豬基因組DNA為模板，設計引物，進行PCR擴增，目的在於擴增包含Intron3-C54T位點的DNA序列。所述引物的核苷酸序列如下:[0012]正向引物:5』 -GCTGCCTCCTCTCCCTCA-3 』 ；
[0013]反向引物:5，-GGAACAGCCAGCCACTTG-3』。
[0014]PCR 反應體系為 25 μ L，其中 10XPCR Buffer2.5 μ L，lOmmol/LdNTP mix2.0 μ L,5pmol/ μ L 的引物各 I μ L，Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0.5 μ L，DNA 模板 I μ LCDNA 約 lOOng),加 dd H20 M 25 μ L0
[0015]PCR 反應條件為 95°C 預變性 5min ;95°C變性 30s，65°C 復性 30s，72°C 延伸 20s，36個循環；72°C延伸7min ;降溫至4°C保持。
[0016]具體地說，所述分子標記的獲得是通過以下步驟實現的:
[0017]1、豬ECII基因的克隆測序
[0018]在NCBI 網站上(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/database/indem html)同源比對人ECIl 基因(NM_001919)，獲得豬ESTs序列，經過多次BLAST、比對和拼接，最後得到1401bp的電子克隆序列，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。根據SEQ ID N0.2序列設計引物ECIl-1和ECI1-2 (見表1)，PCR擴增豬ECIl基因mRNA序列，純化回收擴增產物並連接到PEASY-T3克隆載體，轉染Transl-Tl感受態細胞，培養並鑑定重組質粒，測序，連接ECIl-1和ECI1-2產物序列，以確證所述電子克隆序列的正確性。
[0019]2、豬ECIl基因SNP篩選
[0020]將克隆測序得到的豬ECIl基因mRNA序列在UCSC網站(http://genome, ucsc.edu/)豬基因組資料庫中BLAT，得到該基因的定位和DNA序列，設計3對引物ECI1-3、ECI1-4和ECI1-5 (見表I)。以藏豬、滇南小耳豬和大約克豬基因組DNA為模板，利用上述3對引物，擴增ECIl基因的所有外顯子和部分內含子序列。對擴增得到的PCR產物進行測序，比對，篩選群體間突變頻率差異的SNPs位點，結果在豬ECIl基因第3內含子第54bp處發現C/T鹼基突變，命名為Intron3-C54T。
[0021]3、豬ECIl基因分子標記檢測方法，具體步驟如下:
[0022]針對篩選到的豬ECIl基因的Intron3-C54T突變位點，設計引物ECI1_6(見表1)，目的擴增包含Intron3-C54T突變位點的DNA序列，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0023]其中:序列表SEQ ID N0.1所述的第157bp處有一個位於ECIl第3內含子第54bp處的c/τ鹼基突變，該突變可被Bsm I內切酶識別。
[0024]表1.豬ECIl基因PCR引物
[0025]
【權利要求】
1.一種與豬脂肪沉積性狀相關的分子標記，其特徵在於，其核苷酸序列如序列表SEQID N0.1所示，在第157位有I個C157-T157鹼基突變，導致Bsm 1-RFLP多態性。
2.根據權利要求1所述的分子標記，其特徵在於，所述鹼基突變的位點為Intron3-C54T位點，位於豬ECIl基因第3內含子第54bp處。
3.權利要求1所述的分子標記的製備方法，其特徵在於，以豬基因組DNA為模板，設計引物，進行PCR擴增，目的在於擴增包含Intron3-C54T位點的DNA序列。
4.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，所述引物的核苷酸序列如下: 正向引物:5』 -GCTGCCTCCTCTCCCTCA-3，； 反向引物:5』 -GGAACAGCCAGCCACTTG-3』。
5.根據權利要求3或4所述的製備方法，其特徵在於，PCR反應體系為25μ L，其中IOXPCR Buffer2.5μ L，10mmol/L dNTP mix2.0 μ L，5pmol/μ L 的引物各 I μ L，Taq DNA 聚合酶(5υ/μ L) 0.5μ L, DNA 模板 I μ L (DNA 約 lOOng)，加 dd H20 至 25μ L。
6.根據權利要求3或4所述的製備方法，其特徵在於，PCR反應條件為95°C預變性5min ;95°C變性30s，65°C復性30s，72°C延伸20s, 36個循環；72°C延伸7min ;降溫至4°C保持。
7.一種用於擴增權利要求1所述分子標記的引物對，其核苷酸序列如下: 正向引物:5』 -GCTGCCTCCTCTCCCTCA-3，； 反向引物:5』 -GGAACAGCCAGCCACTTG-3』。
8.權利要求1所述的分子標記在豬標記輔助選擇中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103451180SQ201310373535
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月23日 優先權日:2013年8月23日
【發明者】張 浩, 魯雲風, 強巴央宗, 李慶崗, 吳克亮, 張博, 王志秀 申請人:中國農業大學