應用二代測序技術分析牙髓幹細胞與根尖牙乳頭幹細胞差異miRNAs表達譜的方法與流程
2023-05-30 01:02:12 3
本發明涉及一種分析牙髓幹細胞與根尖牙乳頭幹細胞差異mirnas表達譜的方法，具體涉及一種應用二代測序技術分析兩種幹細胞中差異mirnas表達譜的方法。
背景技術：
牙齒藉助牙根與牙槽骨緊密結合，牙根的穩固在牙列的穩定中非常重要。臨床中常見的例如牙周炎、牙隱裂、牙外傷等疾病都會導致牙根的缺失、折斷、發育異常等，最終都會造成牙的缺失。牙缺失後，生物學牙根的研究具有重要的意義。
目前，生物學牙根的研究在體外主要是通過組織工程學的方法來構建。其中通過不同的牙源性幹細胞組合在支架材料中構建牙齒是目前常用的方法之一。生物學牙根在臨床上也有實際的應用，目前最常用的方法是牙髓血運重建術。牙髓血運重建術用來治療根尖未發育完成的年輕恆牙牙髓壞死和根尖周炎，它不僅可以繼續延續牙根的發育，而且增加了根部牙本質的厚度，避免了根尖誘導成形術和根尖屏障術後由於根管壁薄弱所造成的折裂風險。這些都表明，根尖部保留有健康的幹細胞對於牙髓再生、牙體組織再生和牙根的繼續發育發揮了重要的作用。
人牙源性間充質幹細胞，包括牙髓幹細胞、根尖牙乳頭幹細胞和牙囊幹細胞等。其中，牙髓幹細胞(denalpulpstemcells,dpscs)和根尖牙乳頭幹細胞(stemcellfromtheapicalpapilla,scap)與牙髓、牙根形成密切相關。
多年來，牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞一直都是眾多學者研究的熱點。在組織工程中，牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞都是理想的細胞來源，根尖牙乳頭幹細胞來源於生長發育期的根尖孔未閉合的年輕恆牙，可能是更早期、更優越的牙源性幹細胞資源，用於牙髓、牙本質的再生和生物學牙根的再生中具有優勢，是組織構建的首選，更是成為近年來牙髓血運重建治療研究領域中的焦點之一。
牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞的乾性能力，是牙髓組織工程中最重要的，其乾性維持及分化能力涉及多個蛋白編碼基因及多條信號通路。如果單純地控制一個分子乃至一條通路，將無法高效地維持幹細胞乾性和調控分化進程。其中，關於牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞的生物學作用，來源以及分離方法等方面的研究，都取得了不小的進展，這將為重新認識幹細胞生物學特性提供新的參考依據。
隨著近年來mirnas數量的爆炸式增長，據悉在2004年中，mirnas的數量總就有719個，到了2010年9月，mirbase資料庫內的mirnas序列信息更是已經超過一萬五千條。故此，本發明應用二代測序技術分析幹細胞的mirnas表達譜，對於檢測牙髓幹細胞與根尖牙乳頭幹細胞中差異mirnas表達譜的變化，具有深遠的意義。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題在於提供一種應用二代測序技術分析牙髓幹細胞與根尖牙乳頭幹細胞差異mirnas表達譜的方法。
本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：
一種應用二代測序技術分析牙髓幹細胞與根尖牙乳頭幹細胞差異mirnas表達譜的方法，其特徵在於：包括如下操作步驟：
(1)培養牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞：選取新鮮拔除的第三磨牙，在無菌條件下取出牙髓、根尖牙乳頭組織，將組織剪碎，並採用i型膠原酶及dispase酶於37℃下消化30min，之後離心重懸，用細胞篩過濾重懸液，獲得單細胞懸液；
(2)牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞的分選：對步驟(1)中獲得的單細胞懸液，利用胰酶消化收集其中對數生長期的細胞，並依據抗體說明書採用鼠抗人stro-1-pe標記細胞，經免疫磁珠分選收集stro-1陽性細胞，所收集到的stro-1陽性細胞即為所需的牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞；
(3)二代測序技術檢測細胞mirnas表達譜：分別取步驟(2)經分選後的牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞，加入trizol混合後抽提總rna；使用truseqsmallrnasampleprepkit，按照廠家的標準流程，主要步驟如下：測定rna的濃度、瓊脂糖凝膠電泳檢查rna的完整性、以及測定rna的rin值，完成rna樣本質檢後，使用接頭對切膠回收的20-40nt的mirnas的3』與5』端進行連接，逆轉錄合成cdna第一鏈，隨後進行pcr擴增，pcr擴增產物經page電泳質檢、切膠純化、濃度測定以及質檢後，將濃度統一調整為2nm，mirnas文庫構建即告完成；待測mirnas文庫在cbot上完成簇類生長，然後將流通池轉移到基因測序系統上，按照標準流程進行二代測序及數據分析。
所述接頭序列如下：
rna5』adapter(ra5),part#15013205，5』guucagaguucuacaguccgacgauc；rna3』adapter(ra3),part#15013207，5’tggaattctcgggtgccaagg)。
步驟(3)所述pcr擴增的引物序列如下：rnartprimer(rtp),part#15013981，5』gccttggcacccgagaattcca；rnapcrprimer(rp1),part#15013198，5』
aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttcagagttctacagtccga)。
本發明具有如下優點：
通過利用高通量的二代測序技術分析幹細胞的mirnas表達譜，對於檢測牙髓幹細胞與根尖牙乳頭幹細胞中的差異mirnas表達譜，了解幹細胞特性，具有深遠的意義。
附圖說明
下面參照附圖結合實施例對本發明作進一步的說明。
圖1是本發明實施例二中的差異表達mirnas譜火山圖。
圖2是本發明實施例一中牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞乾性鑑定結果圖；其中a：牙髓幹細胞(dpscs)茜素紅染色、b：根尖牙乳頭幹細胞(scap)茜素紅染色、c：牙髓幹細胞(dpscs)油紅o染色、d：根尖牙乳頭幹細胞(scap)油紅o染色。
具體實施方式
本發明列舉了以下幾個代表性實施例，這些實施例僅是示例性的，且不用於限制本發明的範圍，這些實施例僅用於說明本發明的實施方法。
實施例一
應用二代測序技術分析牙髓幹細胞與根尖牙乳頭幹細胞差異mirnas表達譜的方法，步驟如下：
(1)培養牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞：選取臨床17-20歲健康的第三磨牙，在無菌條件下取出牙髓或者根尖牙乳頭組織，將組織剪碎，並採用i型膠原酶及dispase酶於37℃下消化30min，之後離心重懸，用細胞篩過濾重懸液，獲得單細胞懸液；
(2)牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞的分選：對步驟(1)中獲得的單細胞懸液，利用胰酶消化收集其中對數生長期的細胞，並依據抗體說明書採用stro-1-pe標記細胞，經免疫磁珠分選收集stro-1陽性細胞，所收集到的stro-1陽性細胞即為所需的牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞；
(3)成骨細胞定向誘導分化和成骨細胞的鑑定：將步驟(2)經分選後的幹細胞分別接種於6孔板或者24孔板中，24h後改用誘導液培養，誘導液中的礦化液包括：10％的胎牛血清、10-6mol/l地塞米松、50mg/lα-抗壞血酸以及10mmol/lβ-甘油磷酸鈉的α-mem；取誘導後的細胞，進行茜素紅染色成骨特性檢測；
(4)成脂細胞定向誘導分化和成脂細胞的鑑定：將步驟(2)經分選後的幹細胞分別接種於6孔板或者24孔板中，24h後改用誘導液培養，誘導液中的礦化液包括：10％的胎牛血清、1μmol/l地塞米松、10μmol/l胰島素、200μmol/l吲哚美辛、0.5mmol/libmx、1％雙抗的α-mem；取誘導後的細胞，進行油紅o染色；
(5)二代測序技術檢測細胞mirnas表達譜：經步驟(3)茜素紅染色顯示橙紅色礦化結節，步驟(4)油紅o染色顯示油脂滴形成，證明步驟(2)經分選後的幹細胞確為二代測序實驗所需要的幹細胞；分別取步驟(2)經分選後的牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞，加入trizol混合後抽提總rna。使用truseqsmallrnasampleprepkit，按照廠家的標準流程，主要步驟如下：使用nanodrop測定rna的濃度、瓊脂糖凝膠電泳檢查rna的完整性、以及agilent2100bioanalyzer測定rna的rin值。完成rna樣本質檢後，使用特異性接頭(接頭序列如下：rna5』adapter(ra5),part#15013205，5』guucagaguucuacaguccgacgauc；rna3』adapter(ra3),part#15013207，5’tggaattctcgggtgccaagg)對切膠回收的20-40nt的mirnas的3』與5』端進行連接，逆轉錄合成cdna第一鏈。隨後用一對引物(pcr引物序列如下：rnartprimer(rtp),part#15013981，5』gccttggcacccgagaattcca；rnapcrprimer(rp1),part#15013198，5』
aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttcagagttctacagtccga)將合成的一鏈產物進行15個循環的pcr擴增，其中一個引物帶有特異性的barcode序列，用以區分樣本的來源。pcr擴增產物經page電泳質檢、切膠純化、qubit濃度測定以及2100質檢後，將濃度統一調整為2nm，mirnas文庫構建即告完成。待測mirnas文庫在cbot上完成簇類生長，然後將流通池轉移到hiseq2000型測序系統上，按照標準流程進行二代測序及數據分析。實驗重複2次。
實驗結果
在顯微鏡下觀察幹細胞，牙髓幹細胞和根尖牙乳頭幹細胞呈長梭形的類似成纖維細胞，傳代培養後大約4h開始貼壁。在進入指數生長期之後，細胞的增殖速度很快，4到6d就可以進入平臺期，細胞的生長速度平穩，並且持續呈單層貼壁生長。在幹細胞成骨誘導和成脂誘導21d之後進行化學染色，茜素紅染色顯示橙紅色礦化結節，油紅o染色顯示油脂滴形成。如圖2中所示。這證明分選後的細胞確為後續二代測序實驗中所需要的幹細胞。
應用高通量的二代測序技術檢測兩種幹細胞mirnas表達譜後，應用rpackagedeseq2(version1.6.1)軟體，在每組數據中選取變化倍數值＞1.5，p＜0.05的mirnas。與dpscs相比，scap中顯著下調的mirnas有7個，分別是hsa-mir-224-5p、hsa-mir-1247-5p、hsa-mir-3065-3p、hsa-mir-452-5p、hsa-mir-767-5p、hsa-mir-4284、hsa-mir-146a-5p，無顯著上調的mirnas。其差異表達圖如圖1中所示。
然後，經t檢驗統計分析，對於細胞中表達差異有統計學意義的7個mirnas，應用diana-microt、miranda、mirbase、pictar和targetscans等軟體聯合進行生物信息學分析，搜索靶基因，共有32157個。基於geneontology資料庫，對靶基因進行go分類和keggpathway的功能分析，進行顯著性基因功能篩選。結果顯示，差異表達mirnas可能參與了細胞的遷移、分化和凋亡。
雖然以上描述了本發明的具體實施方式，但是熟悉本技術領域的技術人員應當理解，我們所描述的具體的實施例只是說明性的，而不是用於對本發明的範圍的限定，熟悉本領域的技術人員在依照本發明的精神所作的等效的修飾以及變化，都應當涵蓋在本發明的權利要求所保護的範圍內。
sequencelisting
福建醫科大學附屬口腔醫院
應用二代測序技術分析牙髓幹細胞與根尖牙乳頭幹細胞差異mirnas表達譜的
方法
4
patentinversion3.3
1
26
dna
人工序列
misc_feature
(2,3,9,10,12,17,25)
y=u
1
gyycagagyycyacagyccgacgayc26
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人工序列
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4
50
dna
人工序列
4
aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttcagagttctacagtccga50