作為親和配體的摻入有免疫球蛋白片段的蜘蛛絲融合蛋白結構的製作方法

2023-05-29 16:19:46 1

作為親和配體的摻入有免疫球蛋白片段的蜘蛛絲融合蛋白結構的製作方法
【專利摘要】一種包括部分B和CT，及任選地REP的重組融合蛋白，其中B包括至少一個免疫球蛋白片段，其提供與有機靶選擇性相互作用的能力；CT是從70至120個胺基酸殘基的部分，並衍生自蜘蛛絲蛋白的C端片段；及REP是從70至300個胺基酸殘基的部分，並衍生自蜘蛛絲蛋白的重複片段。
【專利說明】作為親和配體的摻入有免疫球蛋白片段的蜘蛛絲融合蛋白 結構
[0001] 發曰月的摶術領域
[0002] 本發明涉及重組融合蛋白的領域，且更具體地涉及包括衍生自蜘蛛絲蛋白（拖絲 蛋白）的部分的新穎融合蛋白。本發明提供了用於提供為包括重組融合蛋白的聚合物的蛋 白結構的方法，所述重組融合蛋白包括衍生自拖絲蛋白的部分。還提供了用於結合有機靶 的新穎蛋白結構。
[0003] 發明背景
[0004] 在應用蛋白化學中，一個常見的問題是如何向相關的活性位點配製或呈現生物活 性肽或蛋白，所述活性位點通常是有機革巴，諸如核酸、蛋白、蛋白複合體、蛋白和/或脂質和 /或碳水化合物和/或核酸的複合體。最簡單的解決方案是僅僅提供生物活性肽或蛋白的 水溶液。然而，許多應用的確要求一些進一步的手段來實現期望的目標。例如，可將肽/蛋 白締合於脂質混合物或化學地固定於支持結構。
[0005] 用於固定於支持結構的肽/蛋白的應用包括製備和分析性分離程序諸如生物工 藝、層析法、細胞捕獲和培養、主動過濾器（activefilters)和診斷學。基於胞外基質蛋白 例如膠原的結構公開在EP704532和EP985732中。
[0006] 還已經建議在支持結構中使用蜘蛛絲蛋白。蜘蛛絲是天然的高性能聚合物，由於 強度和彈性的組合而獲得了非同尋常的韌性和延伸性。蜘蛛具有多達七個不同的腺，這些 腺產生具有不同機械性質和功能的多種絲類型。由大壺狀腺產生的拖絲（draglinesilk) 是最堅韌的纖維。它由兩種主要的多肽組成，大多被稱為大壺狀腺拖絲蛋白（spidroin) (MaSp)l和2,但在例如，在十字園蛛（Araneusdiadematus)中被稱為ADF-3和ADF-4。這 些蛋白質具有200-720kDa範圍內的分子量。蜘蛛拖絲蛋白質或MaSp具有分成三部分的組 成：無重複的N-端結構域、由許多重複的聚Ala/Gly區段構成的中心重複區域和無重複的 C-端結構域。通常認為重複區域在絲纖維中形成分子間接觸，但不太清楚末端結構域的準 確功能。還認為與纖維形成相聯繫地，重複區域經歷從無規捲曲和a-螺旋構象到折 疊結構的結構轉化。拖絲蛋白的C端區域在蜘蛛種類和絲類型之間通常是保守的。
[0007] W0 07/078239 和Stark,M.等人，Biomacromolecules8:1695-1701，（2007)公開 了由具有高的Ala和Gly含量的重複片段和蛋白質的C端片段組成的微型蜘蛛絲蛋白，以 及包含蜘蛛絲蛋白的可溶性融合蛋白。在蜘蛛絲蛋白從其融合配體釋放後，自然地獲得蜘 蛛絲蛋白的纖維。
[0008] Rising，A.等人，CMLS68(2) :169-184(2010)綜述了在產生蜘蛛絲蛋白方面的進 展。
[0009] US2009/0263430公開了酶0-半乳糖苷酶與微型蜘蛛絲蛋白的膜的化學偶 聯。然而，化學偶聯可能要求對蛋白穩定性和/或功能不利的條件。包含衍生自蜘蛛絲 蛋白的重複區的區段的多個重複的蛋白已經被設計以包括RGD細胞結合區段（Bini，E等 人，Biomacromolecules7:3139-3145(2006))和/或R5肽（WongPoFoo，C等人，ProcNatl AcadSci103(25) :9428-9433(2006))或參與礦化作用（mineralization)的其它蛋白區 段（Huang,J等人，Biomaterials28:2358-2367(2007) ;W0 2006/076711)。在這些現有技 術文獻中，通過在變性的有機溶劑六氟異丙醇（HFIP)中增溶融合蛋白和乾燥來形成膜。
[0010] US2005/261479A1公開了用於純化由重複片段和親和性標籤組成的重組絲蛋白 的方法，包括從複雜混合物中磁親和性分離單獨的絲蛋白，而不形成絲蛋白纖維或其它聚 合物結構。
[0011] 已知的支持結構和相關的技術在以下方面具有某些缺陷，例如經濟性、效率、穩定 性、再生能力、生物活性和生物相容性。 發明概要
[0012] 本發明的一個目的是提供能夠與有機靶選擇性相互作用的新穎的重組融合蛋白。
[0013] 本發明的一個目的是提供能夠與有機靶選擇性相互作用的新穎蛋白結構。
[0014] 本發明的另一個目的是提供能夠與有機靶選擇性相互作用的蛋白結構，其中所述 結構的形成不使用可能對蛋白的二級結構或活性具有不可預測的作用和/或保持在蛋白 結構中的強溶劑。
[0015] 本發明的一個目的是提供能夠與有機靶選擇性相互作用的穩定蛋白結構，該蛋白 結構在使用後可容易地再生，例如通過化學處理再生。
[0016] 本發明的另一個目的是提供生物相容的並適於細胞培養和作為植入物的穩定蛋 白結構。
[0017] 本發明的又另一個目的是提供具有高密度的能夠與有機靶選擇性相互作用的均 勻間隔的官能團的蛋白結構。
[0018] 本發明的另一個目的是提供在+4°C或在室溫儲存數月後保持其選擇性結合能力 的蛋白結構。
[0019] 本發明的又一個目的是提供可高壓滅菌，即，在滅菌熱處理後保持其選擇性結合 能力的蛋白結構。
[0020] 本發明的另一個目的是提供在蛋白微陣列診斷中有用的蛋白結構。
[0021] 為了這些和其它目的，將從以下公開內容明顯的是，根據第一方面，本發明提供融 合蛋白和由包含該融合蛋白作為重複結構單元的聚合物組成的蛋白結構，如權利要求書中 所列出的。
[0022] 根據一個相關的方面，本發明提供編碼融合蛋白的分離的核酸和產生融合蛋白的 方法，如權利要求書中所列出的。
[0023] 根據另一個方面，本發明提供用於提供蛋白結構的方法，如權利要求書中所列出 的。
[0024] 根據另一個方面，本發明提供親和性介質，如權利要求書中所列出的。
[0025] 根據一個方面，本發明提供細胞支架材料，如權利要求書中所列出的。根據一個相 關的方面，本發明還提供根據權利要求書的細胞和細胞支架材料的組合。
[0026] 根據一個方面，本發明提供蛋白結構和融合蛋白的新穎用途，如權利要求書中所 列出的。
[0027] 根據另一個方面，本發明提供用於從樣品分離有機靶的方法，如權利要求書中所 列出的。
[0028] 根據另一個方面，本發明提供用於固定和任選地培養細胞的方法，如權利要求書 中所列出的。
[0029] 附圖簡沐
[0030] 圖1顯示拖絲蛋白C端結構域的序列比對。
[0031] 圖2顯示拖絲蛋白N端結構域的序列比對。
[0032] 圖3顯示Alexa647標記的抗原結合根據本發明的融合蛋白。
[0033] 圖4顯示生物素化的抗原結合根據本發明的融合蛋白，以Alexa647標記的鏈黴親 和素檢測。
[0034] 圖5顯示在泡沫格式中絲融合的抗體片段的顯微照片。
[0035] 圖6顯示純的和絲融合的抗體片段的抗原結合分析。
[0036] 所附序列的列表
[0037] SEQIDNO
[0038] 1 4Rep
[0039] 2 4RepCT
[0040] 3 NT4Rep
[0041] 4 NT4Rep
[0042] 5 NT4R印CTHis
[0043] 6 NT
[0044] 7 CT
[0045] 8共有NT序列
[0046] 9共有CT序列
[0047] 10 來自EuprosthenopsaustralisMaSpl的重複序列
[0048] 11共有G區段序列1
[0049] 12共有G區段序列2
[0050] 13共有G區段序列3
[0051] 14CTEuprosthenopsspMaSpl
[0052] 15CTEuprosthenopsaustralisMaSpl
[0053] 16CT三帶金蛛（Argiopetrifasciata)MaSpl
[0054] 17CT泉字雲斑蛛（Cyrtophoramoluccensis)Spl
[0055] 18CT幾何寇蛛（Latrodectusgeometricus)MaSpl
[0056] 19CT黑寡婦蜘蛛（Latrodectushesperus)MaSpl
[0057] 20CT赫氏粒突蛛（Macrotheleholsti)Spl
[0058] 21CT絡新婦蛛（Nephilaclavipes)MaSpl
[0059] 22CT斑絡新婦（Nephilapilipes)MaSpl
[0060] 23CT馬達加斯加金色球蜘蛛（Nephilamadagascanensis)MaSpl
[0061] 24CT帶狀裡金色圓網蜘蛛（Nephilasenegalensis)MaSpl
[0062] 25CT變異禍蛛（Octonobavarians)Spl
[0063] 26CT中華縷網蛛（Psechrussinensis)Spl
[0064] 27CT長爪綠色焚光蜘蛛（Tetragnathakauaiensis)MaSpl
[0065] 28CT多色肖銷（Tetragnathaversicolor)MaSpl
[0066] 29CT巨頭地衣圓蛛（Araneusbicentenarius)Sp2
[0067] 30CT悅目金蛛（Argiopeamoena)MaSp2
[0068] 31CT阿吉普奧蘭提亞金蛛（Argiopeaurantia)MaSp2
[0069] 32CT三帶金蛛MaSp2
[0070] 33CT多型棘腹蛛（Gasteracanthamammosa)MaSp2
[0071] 34 CT幾何寇蛛MaSp2
[0072] 35 CT黑寡婦蜘蛛MaSp2
[0073] 36 CT絡新婦蛛MaSp2
[0074] 37 CT馬達加斯加金色球蜘蛛MaSp2
[0075] 38 CT帶狀褪金色圓網蜘蛛MaSp2
[0076] 39CT褐灰色捕魚蜘蛛（Dolomedestenebrosus)Fbl
[0077] 40CT褐灰色捕魚蜘蛛Fb2
[0078] 41 CT十字園蛛ADF-1
[0079] 42 CT十字園蛛ADF-2
[0080] 43 CT十字園蛛ADF-3
[0081] 44 CT十字園蛛ADF-4
[0082] 45NTEuprosthenopsaustralisMaSpl
[0083] 46 NT幾何寇蛛MaSpl
[0084] 47 NT黑寡婦蜘蛛MaSpl
[0085] 48 NT絡新婦蛛MaSpl
[0086] 49 NT三帶金蛛MaSp2
[0087] 50 NT幾何寇蛛MaSp2
[0088] 51 NT黑寡婦蜘蛛MaSp2
[0089] 52 NTNephilainauratamadagascanensisMaSp2
[0090] 53 NT絡新婦蛛MaSp2
[0091] 54NT橫紋金蛛（Argiopebruennichi)圓柱狀拖絲蛋白1
[0092] 55NTNephilaclavata圓柱狀拖絲蛋白 1
[0093] 56 NT黑寡婦蜘蛛管狀拖絲蛋白
[0094] 57 NT絡新婦蛛鞭毛狀絲蛋白
[0095] 58 NTNephilainauratamadagascanensis鞭毛狀絲蛋白
[0096] 59 His6ScFvRep4CT(DNA)
[0097] 60 His6Rep4CTScFv(DNA)
[0098] 61 His6ScFvRep4CT
[0099] 62 His6Rep4CTScFv
[0100] 63 His6ScFvCT
[0101] 64 His6CTScFv
[0102] 65 His6ScFvNT-CT
[0103] 66 His6NT-CTScFv
[0104] 67 His6ScFvNTRep4CT
[0105] 68 His6NTRep4CTScFv
[0106] 69 His6ScFvNTNT-CT
[0107] 70 His6NTNT-CTScFv
[0108] 71 His6-scFvl-NTCT(DNA)
[0109] 72 His6-scFvl-NTCT
[0110] 73 His6-scFvl-CT(DNA)
[0111] 74 His6-scFvl-CT
[0112] 發明詳沐
[0113] 本發明總體是基於如下洞見：能夠與有機靶選擇性相互作用的固體蛋白結構可制 備為以重組融合蛋白作為重複結構單元的聚合物形式。融合蛋白包括能與有機靶（抗原 /表位）選擇性相互作用的至少一種免疫球蛋白（Ig)片段，和對應於蜘蛛絲蛋白的至少C 端片段的部分。意外地，衍生自蜘蛛絲蛋白的部分可被誘導以在結構上重排並因而形成聚 合、固體結構，而包括免疫球蛋白片段的部分，包括例如互補位，不在結構上重排，但保持其 期望的結構和功能，即，與該有機靶選擇性相互作用的能力。可獲得蛋白結構而無化學偶聯 步驟或變性方法步驟，這使得程序容易並改進獲得具有保持其部分的功能性的融合蛋白的 機會，尤其是當功能依賴於部分的二級結構時。這些融合蛋白聚合物的形成可被緊密地控 制，且這一洞見已被開發為進一步的新穎蛋白結構、產生該蛋白結構的方法、和該蛋白結構 在多種應用和方法中的用途。
[0114] 因此，根據本發明的融合蛋白具備期望的選擇性相互作用活性和蛋白結構中在生 理條件下採用的內部的固體支持活性二者。當拖絲蛋白部分在結構上重排以形成聚合、固 體結構時，融合蛋白的結合活性被保持，而包括免疫球蛋白片段的部分與拖絲蛋白部分共 價連接，一定是被認為令人驚訝的。事實上，提供選擇性相互作用活性的部分當被整合在根 據本發明的融合蛋白結構中時，可增加其熱和/或化學穩定性和/或結合活性。該蛋白結 構還提供對有機靶的選擇性相互作用活性的高和可預測的密度。具有選擇性相互作用活性 的有價值的蛋白部分的丟失被減到最小，因為所有表達的蛋白部分與固體支持物締合。
[0115] 從根據本發明的融合蛋白形成的聚合物是固體結構，由於其物理特徵而是有用 的，尤其是高強度、彈性和輕的重量的有用的組合。特別有用的特徵是，融合蛋白的拖絲蛋 白衍生部分是生化牢固的，適於用例如酸、鹼或離液劑再生，並適於加熱滅菌，例如在120°C 高壓滅菌20min。該聚合物還因為其支持細胞粘附和生長的能力而是有用的。衍生自拖絲 的性質在開發為了醫學或技術目的的新材料方面是有吸引力的。尤其是，根據本發明的蛋 白結構可用在製備和分析性分離程序中，諸如層析法、細胞捕獲、篩選和培養、主動過濾器 (activefilters)和診斷學。
[0116] 通過一個優選的實施例，根據本發明的蛋白結構還可用於在蛋白微陣列診斷中固 定抗體片段。從本公開內容了解的許多優點中，可以預見的是，根據本發明的蛋白結構提供 了增強的靈敏度。現今許多疾病很難診斷並選擇正確的治療。在多路分子診斷領域，人們可 以證明隨著時間從DNA到mRNA和現在到蛋白的趨勢。由於蛋白的信息量比核酸豐富得多， 基於蛋白模式更精確的診斷的可能是解決更困難的診斷疾病狀態，以及個體化藥物需要的 關鍵。此外，這些診斷應該更能反映通過原始DNA提供的靜態視圖難以做到的，患者狀況的 疾病和健康的時空變化。
[0117] 通過對患者樣品（如血清）的蛋白含量變化進行徹底的調查，在分子水平上與疾 病相關的變化的理解將有助於闡明疾病生物學的潛在機理。疾病相關的分子特徵的調查可 以作為改進診斷、預後和患者分類的基礎。它還可能是選擇適合特定的治療的患者，及監測 治療幹預的作用的有用的工具。特定的蛋白結構域，諸如工程化抗體片段，如單鏈可變片段 (ScFv)，是用於分析樣品中特定蛋白含量的無價的工具。最具挑戰性的任務之一是以其三 維結構、功能性和結合位點被保持且可接觸這樣的方式將抗體片段固定在表面上。許多重 要的疾病標誌物是蛋白，其在容易獲得的樣品如血清中豐度低。為了實現高度精確的分子 特徵描繪，因此人們需增強當前的常規技術的靈敏度。我們在此描述了將抗體片段固定在 由重組蜘蛛絲製備的蛋白為基礎的環境上的新策略。這種溫和的固定化技術有助於保持抗 體片段穩定及阻礙變性，且從而增強對患者樣品中特定蛋白的靈敏度。
[0118] 蜘蛛絲具有非常引人注目的物理和生理特徵。重組微型蜘蛛絲蛋白Itep4CT可以在 大腸桿菌（Escherichiacoli)中製備並在非變性條件下純化。純的Rep4CT可進一步加工 成各種固體結構，或格式，諸如纖維、透明膜和三維多孔泡沫。其它蛋白結構域可以與CT或 Rep4CT融合而產生，且然後加工成以特定的蛋白功能功能化的固體格式。以這種方式，抗體 片段可以共價連接至CT或Itep4CT，且然後加工成為以抗原結合的功能功能化的小、但強的 斑點。這些絲固定的抗體片段也可以布點在微陣列晶片表面上，並用於在身體樣品如血清 中檢測疾病分子。
[0119] 使用這種策略，抗體片段被包含在以蛋白為基礎的環境中，且抗體片段的主要部 分將在其活性形式中。新的策略可以與傳統的在表面上直接乾燥抗體片段相比，其中片段 的更大的比例將隨機地定向和變性，且因此，不能結合抗原。此外，當與蜘蛛絲連接時，抗體 片段將與抗原結合位點被定向朝著溶液中的分子。由於靈敏度與活性抗體片段的數目關 聯，可用的和活性抗體片段的比例越高，靈敏度越高。
[0120] 根據本發明的蛋白結構還可用在醫療裝置中，諸如植入物和醫學產品，諸如傷口 閉合系統、創可貼、縫線、傷口敷料、和用於細胞固定、細胞培養、組織工程和引導細胞再生 的支架。
[0121] 本發明提供能夠與有機靶選擇性相互作用的重組融合蛋白，該融合蛋白包括部分B和CT、和任選的REP和/或NT。本發明還提供能夠與有機靶選擇性相互作用的蛋白結構， 其中所述蛋白結構是包括根據本發明的重組融合蛋白、和任選地由根據本發明的重組融合 蛋白組成的聚合物，即，包括部分B和CT、和任選的NT，和任選地由部分B和CT、和任選的 REP和/或NT組成。
[0122] 儘管在實施例中融合蛋白的CT、REP和NT部分不得已地涉及具體蛋白，例如衍生 自來自Euprosthenopsaustralis的大拖絲蛋白l(MaSpl)的蛋白，為了產生根據本發明的 融合蛋白結構的目的，考慮本公開內容可適用於任何結構上相似的部分。而且，儘管在實施 例中提供融合蛋白的選擇性相互作用活性的B部分不得已地涉及具體蛋白部分，例如衍生 自免疫球蛋白的部分，為了產生根據本發明的融合蛋白結構的目的，考慮本公開內容可適 用於能夠與有機靶選擇性相互作用的任何結構上和/或功能上相似的B部分。
[0123] 根據本發明的具體融合蛋白以式Bx-CT-Bz、Bx-REP-By-CT-BjPBx-CT-By-REP-BzS 義，其中x、y和z是從0至5的整數；且x+y+z多1，任選地在融合蛋白的任一端或融合蛋 白中任何兩個蛋白部分之間還包含一個NT部分。如果x+y+z>l，即，如果存在兩個或更多 個B部分，它們可以是相同或不同的。兩個或更多個B部分可具有與相同有機祀或與不同 有機靶選擇性相互作用的能力。優選地，兩個或更多個B部分是大致上相同的，各具有與相 同有機靶選擇性相互作用的能力。可替代地，優選兩個或更多個B部分是不相同的，且它們 一起提供與有機靶選擇性相互作用的能力。
[0124] 在根據本發明的優選融合蛋白中，x、y和z是0至2、優選地0至1的整數。在根 據本發明的某些優選融合蛋白中，y= 0。在根據本發明的更優選的具體融合蛋白中，y= 〇 且X或Z是 0,即，融合蛋白以式Bx-CT、CT-Bz、Bx-REP-CT、Bx-CT-REP、REP-CT-BjPCT-REP-Bz 定義，其中x和z是從1至5的整數。在根據本發明的優選融合蛋白中，y= 0，x和z是從0 至1的整數；且x+z= 1。如此，根據本發明的某些優選融合蛋白以式B-CT、CT-B、B-REP-CT、 B-CT-REP、REP-CT-B和CT-REP-B定義。在根據本發明的優選融合蛋白中，任選的REP部分 不存在。在缺乏REP部分的融合蛋白中，B部分對其它分子相比對其抗原靶的非特異性結 合的降低已有利地觀察到。從缺乏REP部分的融合蛋白自發形成固體結構特別令人驚訝。 在另一個根據本發明的優選融合蛋白中，任選的NT部分不存在。
[0125] 術語"融合蛋白"此處指通過由重組核酸，即通過組合正常情況下不會一起出現的 兩個或更多個核酸序列而人工創造的DNA或RNA表達而製備的蛋白質（遺傳工程）。根據 本發明的融合蛋白是重組蛋白，且因此其不同於天然存在的蛋白質。特別地，因為野生型拖 絲蛋白不是由以上列出的重組核酸表達的，所以其不是根據本發明的融合蛋白。組合的核 酸序列編碼具有特定功能特性的不同蛋白質、部分蛋白質或多肽。所得的融合蛋白或重組 融合蛋白是具有衍生自原始蛋白質、部分蛋白質或多肽中的每一種的功能特性的單一蛋白 質。而且，根據本發明的融合蛋白和相應的基因是嵌合的，即，該蛋白/基因部分衍生自至 少兩種不同的物種。CT部分，以及任選的REP和NT部分均衍生自蜘蛛絲蛋白。為了避免疑 問，根據本發明的B部分是非拖絲蛋白的蛋白或多肽，S卩，其不是衍生自蜘蛛絲蛋白。具體 地，根據本發明的B部分不是衍生自蜘蛛絲蛋白的C端、重複或N端片段。
[0126] 融合蛋白通常由從170至2000個胺基酸殘基、諸如從170至1000個胺基酸殘基、 諸如從170至600個胺基酸殘基、優選地從170至500個胺基酸殘基、諸如從170至400個 胺基酸殘基組成。小的尺寸是有利的，因為包含蜘蛛絲蛋白片段的較長蛋白可能形成無定 形的聚集物，這需要使用強力的溶劑來增溶和聚合。重組融合蛋白可包含多於2000個殘 基，尤其是在蜘蛛絲蛋白包含多於一個B部分和/或當其包含NT部分，例如1-2個NT部分 的情形時。
[0127] 術語〃拖絲蛋白（spidroin) 〃和〃蜘蛛絲蛋白（spidersilkprotein) 〃遍及本 說明書可互換地使用，並涵蓋所有已知的蜘蛛絲蛋白，包括大壺狀腺蜘蛛絲蛋白，其通常縮 寫為〃MaSp〃，或在十字園蛛的情形縮寫為〃ADF"。這些大壺狀腺蜘蛛絲蛋白一般為兩種類 型，1和2。這些術語還包括與已知蜘蛛絲蛋白具有高程度的同一性和/或相似性的非天然 蛋白。
[0128] 所以，術語〃非拖絲蛋白〃意指不是衍生自蜘蛛絲蛋白的蛋白，S卩，與蜘蛛絲蛋白 具有低（或無）程度的同一性和/或相似性。
[0129] 根據本發明的蛋白結構能夠與有機靶選擇性相互作用。這一能力存在於根據本發 明的融合蛋白中，更具體地存在於融合蛋白的B部分中。CT部分、以及任選的REP和NT部 分，與有機分子的任何相互作用不被術語"能夠與有機靶選擇性相互作用"涵蓋。為了避 免疑問，術語"能夠與有機靶選擇性相互作用"不涵蓋根據本發明的融合蛋白的依賴於包 括CT部分、以及任選的REP和NT部分的相互作用的二聚、寡聚或聚合。
[0130] 術語〃有機靶〃涵蓋含碳原子的所有化學分子，例外是通常本領域技術人員認為 是無機分子的那些，例如碳酸鹽、碳的簡單氧化物、氰化物、金剛石和石墨。為了避免疑問， 無機分子、鹽和離子，諸如矽石和氯化鈣，不是有機的。有機靶可以是包含有機分子或由有 機分子組成的複合體，例如，細胞表面上的受體複合體。有機靶可以是一種或更多種有機分 子類型的單體、二聚體、寡聚體或聚合物，可以由共價鍵或其它類型的締合保持在一起。當 然，它還可以簡單地是單個有機分子。根據本發明的優選的有機靶包括但不限於，核酸、蛋 白和多肽、脂質和碳水化合物、以及其組合。根據本發明的另外的優選的有機靶包括但不限 於，免疫球蛋白、包括免疫球蛋白或其衍生物的分子、白蛋白、包括白蛋白或其衍生物的分 子、生物素、包括生物素或其衍生物或類似物的分子、及生物疾病標誌物，例如來自血液、血 清、尿、唾液或來自身體組織的其它樣品。
[0131] 在本發明的上下文中，配體例如根據本發明的融合蛋白的B部分與其靶的"特異 "或"選擇性"相互作用是指，該相互作用使得特異性與非特異性、或選擇性或非選擇性的 相互作用之間的差別變得有意義。兩種蛋白之間的相互作用有時以解離常數測量。解離常 數描述兩種分子之間的結合強度（或親和性）。通常抗體與其抗原（表位）之間的解離常 數是從1(T7至l(TnM。然而，高特異性不必要求高親和性。對其對應物具有低親和性（在 摩爾範圍中）的分子已經顯示為與具有高的多的親和性的分子同樣特異性。在本發明的情 形中，特異或選擇性相互作用是指在指定條件下，在天然存在的或經加工的生物或生化流 體的樣品中其它蛋白的存在下，特定方法可用於確定特定蛋白、靶蛋白或其片段的存在和/ 或量的程度。換言之，特異性或選擇性是區分相關蛋白的能力。特異和選擇性在本說明書 中有時可互換地使用。
[0132] 根據本發明的融合蛋白還可包含一個或更多個接頭肽。接頭肽可布置在融合蛋白 的任何部分之間，例如，兩個B部分之間、B和CT部分之間、CT和REP部分之間、和B和REP 部分之間，或可布置在融合蛋白的任一末端。如果B部分包含兩個或更多個Ig片段，接頭肽 還可布置在兩個Ig片段之間。如果融合蛋白包含兩個或更多個B部分，接頭肽還可布置在 兩個B部分之間。接頭可在融合蛋白的功能單元之間提供間隔區，而且還可構成用於鑑定 和純化該融合蛋白的工具，例如，His和/或Trx標籤。如果融合蛋白包含用於鑑定和純化 融合蛋白的兩個或更多個接頭肽，優選它們被間隔序列隔開，例如His6-間隔區-His6-。接 頭還可構成將融合蛋白導向膜和/或致使融合蛋白從宿主細胞分泌到周圍介質中的信號 肽，例如信號識別顆粒。融合蛋白還可在其胺基酸序列中包括允許裂解並去除接頭和/或 其它相關部分，通常是一個或更多個B部分的裂解位點。多種裂解位點是本領域技術人員 已知的，例如，針對化學劑的裂解位點，例如Met殘基之後的CNBr裂解位點和Asn-Gly殘基 之間的羥胺裂解位點，針對蛋白酶例如凝血酶或蛋白酶3C的裂解位點，和自我剪接序列， 例如內蛋白（intein)自我剪接序列。
[0133] CT和B彼此直接或間接連接。直接連接指部分之間的直接共價結合而無間插序列 例如接頭。間接連接也是指部分通過共價鍵連接，但是存在間插序列，例如接頭和/或一個 或更多個另外的部分，例如REP和/或NT部分。
[0134] 一個或更多個B部分可布置在融合蛋白的內部或任何一端，S卩，布置在C端或布置 在N端。優選一個或更多個B部分布置在融合蛋白的N末端。如果融合蛋白包含用於鑑定 和純化融合蛋白的一個或更多個接頭肽，例如，His或Trx標籤，優選地其被布置在融合蛋 白的N末端。
[0135] 優選的融合蛋白具有布置在N端的B部分通過1-30個胺基酸殘基，經由例如1-10 個胺基酸殘基的接頭肽偶聯到布置在C端的REP和CT部分的形式。接頭肽可包含裂解位 點。任選地，融合蛋白具有可包含純化標籤例如His標籤和裂解位點的N端或C端接頭肽。
[0136] 另一種優選的融合蛋白具有布置在N端的B部分直接偶聯到布置在C端的REP和CT部分的形式。任選地，融合蛋白具有可包含純化標籤例如His標籤和裂解位點的N端或 C端接頭妝。
[0137] 根據本發明的蛋白結構是包含根據本發明的重組融合蛋白作為重複結構單元的 聚合物，這是意指，其包含有序的多個根據本發明的融合蛋白，通常遠多於100個融合蛋白 單元、例如，1000個融合蛋白單元或更多。任選地，聚合物可包含無B部分的互補蛋白、優選 地衍生自蜘蛛絲的蛋白作為另外的重複結構單元。如果融合蛋白的B部分是大和/或龐大 的，這可以是有益的。這些互補蛋白通常包括，REP部分和CT部分，及任選地NT部分，例如 1-2個NT部分。根據本發明的優選的互補蛋白可具有本文列出的結構的任一種，並缺失B 部分。優選地，互補融合蛋白與缺失B部分的融合蛋白基本上相同。然而優選地，根據本發 明的蛋白結構是由根據本發明的重組融合蛋白作為重複結構單元組成的聚合物，即，根據 本發明的蛋白結構是根據本發明的重組融合蛋白的聚合物。
[0138] 聚合物中融合單元的量值意指該蛋白結構獲得顯著的尺寸。在優選的實施方案 中，蛋白結構在至少兩個維度上具有至少〇. 1ym的尺寸。因此，本文使用的術語〃蛋白結 構"涉及具有至少〇. 1um的厚度的融合蛋白聚合物，優選地人眼可見的宏觀聚合物，S卩，具 有至少lym的厚度。術語〃蛋白結構〃不涵蓋無結構的聚集物或沉澱物。儘管融合蛋白 的單體是水溶性的，應理解的是，根據本發明的蛋白結構是固體結構，即，不溶於水。該蛋白 結構是包含根據本發明的重組融合蛋白作為重複結構單元單體的聚合物。
[0139] 優選地，根據本發明的蛋白結構是以選自由纖維（fiber)、膜（film)、泡沫 (foam)、網狀物（net)、網（mesh)、球（sphere)和膠囊（capsule)組成的組的物理形態。
[0140] 優選地，根據本發明的蛋白結構是厚度為至少lnm例如至少0. 1ym、優選地至 少1ym的纖維或膜。優選地，纖維或膜具有範圍在lnm-400ym，例如1-400ym、且優選地 60-120ym中的厚度。優選地，纖維具有範圍在0. 5-300cm、優選地l-100cm中的長度。其 它優選的範圍是0.5-30cm和l-20cm。纖維具有在物理操作期間保持完整的能力，S卩，可用 於旋轉、編織、扭轉、鉤編和類似程序。膜是有利的，因為其是一致的並粘附於固體結構，例 如，微量滴定板中的塑料製品。膜的這一特徵有助於洗滌和再生程序，對於分離目的是非常 有用的。
[0141] 還優選地，根據本發明的蛋白結構具有高於IMPa、優選地高於2MPa、更優選地 lOMPa或更高的抗張強度。優選地根據本發明的蛋白結構具有高於lOOMPa、更優選地 200MPa或更高的抗張強度。
[0142] CT部分是包含70至120個胺基酸殘基的蛋白片段，並衍生自蜘蛛絲蛋白的C端 片段。表述〃衍生自〃意指在根據本發明的CT部分的上下文中，它與蜘蛛絲蛋白的C端氨 基酸序列具有高度的相似性。如圖1中所示，該胺基酸序列在各個物種和蜘蛛絲蛋白，包括MaSpl和MaSp2之間相當保守。以SEQIDN0:9提供了MaSpl和MaSp2的C端區域的共有 序列。在圖1中，比對了以GenBank登記條目（如果可用）表示的下列MaSp蛋白質（SEQ IDNO:14-44)：
[0143]表1 -拖絲蛋白CT部分
【權利要求】
1. 一種重組融合蛋白，所述重組融合蛋白包括部分B和CT，及任選地REP,其中： B包括至少一個免疫球蛋白片段，其提供與有機祀選擇性相互作用的能力； CT是從70至120個胺基酸殘基的部分，並衍生自蜘蛛絲蛋白的C端片段；及 REP是從70至300個胺基酸殘基的部分，並衍生自蜘蛛絲蛋白的重複片段。
2. 根據權利要求1所述的重組融合蛋白，其中所述B部分的每個免疫球蛋白片段選自 免疫球蛋白可變區。
3. 根據前述任一項權利要求所述的重組融合蛋白，其中所述B部分包括至少一個重鏈 可變區（Vh)和至少一個輕鏈可變區（VJ。
4. 根據前述任一項權利要求所述的重組融合蛋白，其中所述B部分選自由單鏈可變片 段（scFv片段）、抗原結合片段（F油片段）、F(ab'）2片段、結構域抗體（dAb)和單結構域抗 體（sdAB)所組成的組。
5. 根據權利要求4所述的重組融合蛋白，其中所述B部分是單鏈可變片段（scFv)。
6. 根據前述任一項權利要求所述的重組融合蛋白，其中所述B部分包含30-1000個氨 基酸殘基，諸如150-400個胺基酸殘基。
7. 根據前述任一項權利要求所述的重組融合蛋白，其中所述CT部分與SEQ ID NO:9具 有至少50%的同一性，或與SEQ ID NO:7具有至少80%的同一性。
8. 根據前述任一項權利要求所述的重組融合蛋白，所述重組融合蛋白選自由式 Bx-CT-Bz、Bx-REP-By-CT-Bz和 B x-CT-By-REP-Bz所定義的蛋白的組， 其中x、y和Z是從0到5的整數； 且 x+y+z > 1。
9. 根據權利要求8所述的重組融合蛋白，所述重組融合蛋白選自由式B X-CT、CT-Bz、 Bx-REP-CT、Bx-CT-REP、REP-CT-Bz和 CT-REP-B Z所定義的蛋白的組； 其中X和Z是從1到5的整數。
10. 根據權利要求9所述的重組融合蛋白，所述重組融合蛋白選自由式B-CT、CT-B、 B-REP-CT、B-CT-REP、REP-CT-B 和 CT-REP-B 所定義的蛋白的組。
11. 根據前述任一項權利要求所述的重組融合蛋白，其中所述REP部分選自L(AG)山、 L (AG) nAL、L KA)山、L (GA) nGL 的組，其中 n是從2至10的整數； 每個單獨的A區段是從8至18個胺基酸殘基的胺基酸序列，其中所述氨酸殘基的0至 3個不是Ala,且其餘胺基酸殘基是Ala ; 每個單獨的G區段是從12至30個胺基酸殘基的胺基酸序列，其中所述胺基酸殘基的 至少40%是Gly ;及 每個單獨的L區段是從0至20個胺基酸殘基的接頭胺基酸序列。
12. 根據前述任一項權利要求所述的重組融合蛋白，所述重組融合蛋白選自由SEQ ID N0:61-70 ;和與該些序列的任一種具有至少80%同一性的蛋白組成的組。
13. -種分離的核酸，所述分離的核酸編碼根據權利要求1-12中任一項所述的融合蛋 白。
14. 根據權利要求13所述的分離的核酸，所述分離的核酸選自由編碼根據權利要求12 所述的融合蛋白的核酸組成的組及由沈Q ID N0:59-60所組成的組。
15. -種能夠與有機祀選擇性相互作用的蛋白結構，其中所述蛋白結構是包含根據權 利要求1-12中任一項所述的重組融合蛋白作為重複結構單元的聚合物，其中所述B部分提 供與所述有機祀選擇性相互作用的能力。
16. 根據權利要求15所述的蛋白結構，其中所述蛋白結構在至少兩個維度上具有至少 0. 1 ym的尺寸。
17. 根據權利要求15-16中任一項所述的蛋白結構，其中所述蛋白結構是W選自由纖 維、膜、泡沫、網狀物、網、球和膠囊組成的組的物理形態。
18. 根據權利要求1-12中任一項所述的重組融合蛋白用於產生能夠與有機祀選擇性 相互作用的蛋白結構的用途，其中所述蛋白結構是包含所述重組融合蛋白作為重複結構單 元的聚合物，且其中所述B部分提供與所述有機祀選擇性相互作用的能力。
19. 根據權利要求15-17中任一項所述的蛋白結構在從樣品分離有機祀中的用途。
20. 根據權利要求15-17中任一項所述的蛋白結構在細胞培養中的用途。
21. -種產生融合蛋白的方法，所述方法包括W下步驟： a) 在適當的宿主中表達根據權利要求1-12中任一項所述的融合蛋白；及 b) 獲得包含所述融合蛋白的混合物，和任選地分離所述融合蛋白。
22. -種提供根據權利要求15-17中任一項所述的蛋白結構的方法，所述蛋白結構展 示對有機祀的結合活性，所述方法包括W下步驟： (a)提供根據權利要求1-12中任一項所述的重組融合蛋白； 化）將所述融合蛋白經受實現包含所述重組融合蛋白的聚合物的形成的條件。
23. -種用於固定有機祀的親和性介質，所述親和性介質包含根據權利要求1-12中任 一項所述的融合蛋白，其中所述B部分能夠與所述有機祀選擇性相互作用。
24. 根據權利要求23所述的親和性介質，所述親和性介質包含根據權利要求15-17中 任一項所述的蛋白結構，所述蛋白結構是包含所述重組融合蛋白的聚合物。
25. 根據權利要求23-24中任一項所述的親和性介質，所述親和性介質還包含所述有 機祀，其中所述B部分能夠與所述有機祀選擇性相互作用並結合。
26. 根據權利要求25所述的親和性介質，其中所述有機祀能夠與第二有機祀選擇性相 互作用。
27. -種用於培養細胞的細胞支架材料，所述細胞具有存在於所述細胞表面上的有機 祀，所述細胞支架材料包含根據權利要求15-17中任一項所述的蛋白結構。
28. 根據權利要求27所述的細胞支架材料，其中所述B部分能夠與存在於所述細胞表 面上的所述有機祀選擇性相互作用。
29. 根據權利要求27所述的細胞支架材料，其中所述細胞支架材料還包含中間有機 祀，其中所述B部分能夠與所述中間有機祀選擇性相互作用並結合，且其中所述中間有機 祀能夠與存在於所述細胞表面上的所述有機祀選擇性相互作用。
30. 細胞與根據權利要求27-29中任一項所述的細胞支架材料的組合。
31. -種從樣品分離有機祀的方法，所述方法包括W下步驟： 提供包含所述有機祀的樣品； 提供根據權利要求23-26中任一項所述的親和性介質，其中所述親和性介質能夠與所 述有機祀選擇性相互作用； 在實現所述親和性介質與所述有機祀之間的結合的適當條件下將所述親和性介質與 所述樣品接觸；和 除去未結合的樣品。
32. 根據權利要求31所述的方法，所述方法還包括在實現第一有機祀與第二有機祀之 間的結合的適當條件下將所述親和性介質和固定的有機祀與所述第二有機祀接觸的步驟， 所述第二有機祀能夠與所述第一有機祀選擇性相互作用。
33. 根據權利要求31-32中任一項所述的方法，其中當將所述親和性介質與所述樣品 接觸W實現所述親和性介質與所述有機祀之間的結合時，所述親和性介質中的所述融合蛋 白W如根據權利要求15-17中任一項所述的蛋白結構存在。
34. 根據權利要求31-32中任一項所述的方法，其中當將所述親和性介質與所述樣品 接觸W實現所述親和性介質與所述有機祀之間的結合時，所述親和性介質中的所述融合 蛋白在溶液中存在，且其中允許融合蛋白與所述有機祀結合的複合體形成根據權利要求 15-17中任一項所述的融合蛋白結構。
35. 根據權利要求31-34中任一項所述的方法，所述方法還包括檢測、和任選地定量所 述親和性介質上的固定的祀的存在的步驟。
36. 根據權利要求31-35中任一項所述的方法，所述方法還包括從所述親和性介質釋 放和收集所述有機祀的步驟。
37. 根據權利要求31-36中任一項所述的方法，所述方法還包括通過化學處理和/或滅 菌熱處理再生所述親和性介質的最後步驟。
38. 根據權利要求37所述的方法，其中所述化學處理包括用化0H和/或脈處理。
39. -種固定細胞的方法，所述方法包括 提供包含目標細胞的樣品； 將所述樣品應用到根據權利要求27-29中任一項所述的細胞支架材料，其中所述細胞 支架材料能夠與存在於所述細胞表面上的有機祀選擇性相互作用；和 通過所述細胞表面上的所述有機祀與所述細胞支架材料之間的結合，允許所述細胞固 定於所述細胞支架材料。
40. -種用於培養細胞的方法，所述方法包括 根據權利要求39所述的方法固定目標細胞到細胞支架材料；和 在適合細胞培養的條件下維持具有對其應用的細胞的所述細胞支架材料。
【文檔編號】C12N15/62GK104470607SQ201380035379
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年5月2日 優先權日:2012年5月2日
【發明者】麥·赫德哈馬爾, 揚·約翰松, 安娜·裡辛, P-A·尼格倫 申請人:思百博技術股份公司, 伊繆諾維亞公司