一種定量檢測人血型抗體濃度方法的建立與流程

2023-05-30 06:05:46 2

本發明涉及一種運用免疫比濁法定量檢測人外周血中抗a、抗b血型抗體濃度的方法，屬於臨床體外檢測試劑技術領域。

背景技術：

血型抗原作為人體三大抗原之一，其不僅分布在紅細胞膜上，也存在於肝、腎等組織細胞和血管內皮細胞表面。依紅細胞膜上抗原物質的異同，國際輸血學會公布的血型分型系統就多達30種，其中abo血型系統作為主要且常用的血型分型方法，廣泛的應用於人體輸血、器官移植等方面。

abo血型系統包含四種血型，即a型、b型、ab型和o型。四種不同血型人群在血型抗原和血型抗體方面的差別主要在於：a型血的紅細胞膜上表達血型a抗原，b淋巴細胞表達血型b抗原抗體，血漿預存一定濃度的血型b抗原抗體；b型血的紅細胞膜上表達血型b抗原，b淋巴細胞表達血型a抗原抗體，血漿中預存一定濃度的血型a抗原抗體；ab型血的紅細胞膜上表達血型a抗原和血型b抗原，b淋巴細胞不表達血型抗原抗體，血漿中無預存的血型抗原抗體；o型血的紅細胞膜上不表達血型抗原，b淋巴細胞表達血型a抗原抗體和血型b抗原抗體，血漿中預存一定濃度的血型a抗原抗體和血型b抗原抗體。

目前，國內外等待器官移植的患者人數一直居高不下，其主要原因是血型相容性器官的高度缺乏。基於此，abo血型不相容器官移植(abobloodgroupincompatibilityorgantransplantation，aboi-ot)在全球的成功開展，成為了解決器官來源緊缺的一條重要途徑。而術前清除受者體內預存血型抗體並控制術後血型抗體濃度反彈，成為影響aboi-ot的主要障礙。因此，監測並定量檢測aboi器官移植前後血型抗體的濃度成為aboi-ot手術方案制定的重要依據。

目前，臨床實驗室檢測血型抗體的方法主要有高效液相色譜法(hplc)和鹽水介質法、抗球蛋白介質法、低離子聚凝胺介質法、微柱凝膠檢測卡等。其中，hplc雖然為定量檢測方法，但因需要的設備複雜且昂貴，難以在臨床實驗室被廣泛使用；其餘檢測方法——尤其是目前臨床常用的微柱凝膠檢測卡，均為半定量檢測方法，難以提供定量的結果，且對檢測結果的判定易受試劑穩定性、人為因素等影響。而本發明中所運用的血型抗體免疫比濁法是基於血型抗體-血型抗原的特異性結合反應，其形成的免疫複合物在340nm波長有吸收峰值。該方法不需要昂貴的設備，且可實現自動化、大批量標本檢測，符合在臨床檢測應用的基本要求。此外，本發明中將人工合成血型抗原特異性三糖偶聯於鑰孔戚血藍素，可以確保檢測用試劑的純度單一性、濃度的確定性、保存的長久性，更提高了此方法在臨床檢測方面的推廣應用。

技術實現要素：

針對目前臨床人血型抗體濃度測定方法的不足，本發明提供了一種定量檢測血型檢測抗體濃度的方法，與微柱凝膠檢測卡相比，結果更具客觀性，有利於本發明中所闡述的血型抗體定量檢測方法在臨床檢測方面的推廣應用。

1.本發明所用試劑及組成

一種基於免疫比濁法的人血型抗體定量檢測方法，其特徵在於，包含試劑r1、試劑r2、試劑r3、校準品1和校準品2。其中試劑r1組成為0.01mph7.4的pbs緩衝液、0.008-0.012mg/ml的鑰孔戚血藍素偶聯血型a抗原(klh-a)；試劑r2組成為0.01mph7.4的pbs緩衝液、0.008-0.012mg/ml的鑰孔戚血藍素偶聯血型b抗原(klh-b)；試劑r3組成為0.01mph7.4的pbs緩衝液、0.15m的nacl、40-60g/l的peg-8000。

本發明所採用的klh-a、klh-b為albertainnovatestechenologyfutures公司合成，校準品1(鼠抗人血型a抗原抗體試劑)和校準品2(鼠抗人血型b抗原抗體試劑)購自abcam公司。

2.本發明中血型抗體定量檢測方法建立

1.人血型抗原的特異性結合位點為紅細胞膜上的特異性三糖，此側鏈為糖基轉移酶催化特異性三糖基團偶聯至細胞膜上蛋白，如紅細胞膜上的band3、band4.5蛋白，腎臟組織的vwf、plvap、pecam1蛋白。因此，本發明中為保證抗原的純度及抗原性，人工合成血型a和b抗原特異性三糖後，將之偶聯於klh蛋白上(klh-a，klh-b)。

2.檢測常用的人血型抗原抗體均為鼠抗人血型抗原抗體血漿，含有多種細胞培養液蛋白成份。因此，本發明中運用page電泳結合western-blotting技術，鑑定並分析鼠抗人血型a、b抗體濃度，具體操作及結果如下：

血型抗體實際中有效成份的鑑定

將1μl鼠抗人血型a抗原抗體血漿或4μl鼠抗人血型b抗原抗體血漿經8％膠濃度的page電泳後，300ma恆流冰浴電轉90min，tbs洗膜5min×3次，羊抗鼠igm-hrp(1∶2000)常溫孵育40min，tbs洗膜10min×2次，ecl發光分析。

結果如圖1所示，鼠抗人血型a抗原抗體血漿和鼠抗人血型b抗原抗體血漿中均存在多種非igm分子，且兩份血漿抗體中只有鼠抗人血型a抗原抗體或鼠抗人血漿b抗原抗體與羊抗鼠igm-hrp結合反應。

血型抗體試劑試劑中有效成份濃度的分析

以bsa為標準品，通過page電泳分離0.5μg、1μg、2μg、4μg、8μgbsa蛋白，考斯亮藍染色並充分脫色後，運用pdquest軟體分析聚丙烯醯胺凝膠中各濃度bsa條帶灰度值，並建立蛋白量-灰度值標準曲線。在次基礎上，分別取1μl鼠抗人血型a抗原抗體或1μl鼠抗人血型b抗原抗體，經8％膠濃度的page電泳並充分考馬斯亮藍染色脫色後，以pdquest軟體分析其灰度值，並依據標準曲線計算鼠抗人血型a抗原抗體和鼠抗人血型b抗原抗體的濃度。每組數據均重複三次。

結果如圖2所示，bsa蛋白含量-灰度值標準曲線的相關係數為0.9952，曲線結果可信。經計算分析，鼠抗人血型a抗原抗體和鼠抗人血型b抗原抗體的濃度分別為0.90μg/μl和0.57μg/μl。

3.在上述結果的基礎上，運用免疫比濁法分析鼠抗人血型b抗原抗體與klh-b抗原的結合速率曲線，以確定最佳的檢測時間，所用檢測儀器為biophotometerplus核酸蛋白定量檢測儀(本發明λ340nm吸光值的測定均用此型號儀器)，具體操作及結果如下：

為驗證當前實驗條件下，最佳的吸光值測定時間點。本發明選取實際r2和校準品2作為測定對象，以確定本發明所應採取的最佳檢測時間點。

首先，取5支小試管，每管加入生理鹽水0.1ml，在第1管中加入0.1ml標準品2，混勻後吸取0.1ml加入第2管，依此類推，至第5管，最後棄去0.1ml。接著，以100μl的試劑r2調零後，將99μl的試劑r2與1μl稀釋後的樣品混合，從第3min開始，每分鐘檢測混合樣品在λ340nm的吸光值，直至第10min。每組數據重複三次，取其平均值建立鼠抗人血型抗原抗體與抗原結合速率曲線。

結果如圖3所示，鼠抗人血型b抗原抗體和klh-b的結合速率在第5min達到最大值，之後結合速率變化逐漸降低。因此，為能更好的反應抗原-抗體的結合情況，本發明將採取第5min時作為檢測時間點。所取檢測時間點與相關報導相符。

4.進一步通過運用免疫比濁法制定鼠抗人血型a抗原抗體與klh-a、鼠抗人血型b抗原抗體與klh-b的抗體濃度-吸光值標準曲線(抗原抗體結合曲線呈三次函數關係)，具體操作及結果如下：

血型a抗原抗體與血型a抗原的結合標準曲線

首先，取5支小試管，每管加入生理鹽水0.1ml，在第1管中加入0.1ml標準品1，混勻後吸取0.1ml加入第2管，依此類推，至第5管，最後棄去0.1ml。接著，以100μl的試劑r1調零後，將99μl的試劑r1與1μl稀釋後的樣品混合，室溫孵育5min後，於λ340nm檢測其吸光值。每組數據重複三次後，取其平均值建立血型a抗原抗體與血型a抗原的結合標準曲線。

血型b抗原抗體與血型b抗原的結合標準曲線

首先，取5支小試管，每管加入生理鹽水0.1ml，在第1管中加入0.1ml標準品2，混勻後吸取0.1ml加入第2管，依此類推，至第5管，最後棄去0.1ml。接著，以100μl的試劑r2調零後，將99μl的試劑r2與1μl稀釋後的樣品混合，室溫孵育5min後，於λ340nm檢測其吸光值。每組數據重複三次後，取其平均值建立血型b抗原抗體與血型b抗原的結合標準曲線。

結果如圖4和圖5所示，圖4為鼠抗人血型a抗原抗體與klh-a結合標準曲線，曲線的相關係數為0.9957，結果真實可信；圖5為鼠抗人血型b抗原抗體與klh-b結合標準曲線，曲線的相關係係數為0.9966，結果真實可信。

5.最後與微柱凝膠檢測卡比較，以驗證本發明中所用血型抗體定量檢測方法對正常人外周血中血型抗體濃度測定的準確性。

附圖說明

圖1.鼠抗人血型a、b抗原抗體的鑑定。(a)鼠抗人血型a抗原抗體的western-blotting分析，lane1.marks，lane2.page分析，lane3.western-blotting分析，二抗為羊抗鼠血型抗原igm-hrp(1∶2000)；(b)鼠抗人血型b抗原抗體的western-blotting分析，lane1.marks，lane2.page分析，lane3.western-blotting分析，二抗為羊抗鼠血型抗原igm-hrp(1∶2000)。

圖2.bsa標準蛋白濃度-灰度值曲線分析。(a)page電泳，lane1.0.5μgbsa，lane2.1μgbsa，lane3.2μgbsa，lane4.4μgbsa，lane5.8μgbsa；(b)bsa蛋白量-灰度值分析

圖3.血型b抗原與鼠抗人血型b抗原抗體結合時間速率-變化曲線圖

圖4.人血型a抗原抗體標準曲線分析

圖5.人血型b抗原抗體標準曲線分析

具體實施方式

實施例一.與微柱凝膠檢測卡比較，驗證本發明中所用血型抗體濃度定量檢測方法的準確性。

1.微柱凝膠檢測卡分別驗證a、b型健康人血漿中血型抗體的效價。

首先，取5支小試管，每管加入生理鹽水0.1ml。在第1管中加入0.1mla型或b型血血漿，混勻後吸取0.1ml加入第2管，依此類推，至第5管，最後棄去0.1ml。接著，每管微柱凝膠檢測卡中加一定量標準a型血或b型血紅細胞生理鹽水懸液(3％稀釋)和檢測用b血型血漿或a型血血漿，37℃孵育15min。於1000rpm離心10min後，取出檢測卡，肉眼觀察結果。

2.免疫比濁法測定a、b型健康人血漿中血型抗體的濃度

首先，取5支小試管，每管加入生理鹽水0.1ml。在第1管中加入0.1mla型或b型血血漿，混勻後吸取0.1ml加入第2管，依此類推，至第5管，最後棄去0.1ml。接著，以100μl的試劑r2調零後，將99μl的試劑r1與1μl稀釋後的樣品混合，室溫孵育5min後，於λ340nm檢測其吸光值。

結果如表1和表2所示：

表1.微柱凝膠檢測卡和免疫比濁法分析a型血血漿中血型抗體

表2.微柱凝膠檢測卡和免疫比濁法分析b型血血漿中血型抗體

表1和表2中所述數據顯示，與微柱凝膠檢測卡相比，伴隨血漿的倍比稀釋，免疫比濁法測定的數據呈現接近2倍的遞比減少，說明本發明中所用免疫比濁法亦能很好的反應血型抗體的變化趨勢，且可以以定量化的結果顯示樣品中血型抗體的濃度，並能在一定程度上排除試劑穩定性、人為因素等對結果造成的誤判。