分離篩選異養硝化細菌的方法

2023-05-29 16:59:56 2

專利名稱：分離篩選異養硝化細菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離篩選異養硝化細菌的方法，具體涉及一種從處理人工模擬城市生活汙水系統中分離篩選並鑑定具有硝化活性的異養細菌的方法，屬於微生物技術領域。
背景技術：
在自然環境中，硝化作用主要是依靠微生物的硝化能力來完成的，目前提及的硝化概念，一般是指氨氮氧化為亞硝酸鹽氮，再進一步氧化為硝酸鹽氮的過程。這個過程是由兩類不同的細菌所完成一類是氨氧化細菌，將氨氮氧化為亞硝酸鹽氮；另一類是亞硝酸氧化細菌，將亞硝酸鹽氮氧化為硝酸鹽氮。目前普遍認為硝化作用的主體是化能自養型的菌種。
近年來，國內外學者對廢水生物脫氮工程實踐中揭示出的問題和現象進行了大量理論和試驗研究，力求進一步完善對氮素轉化過程的認知，並提出了一些突破傳統理論的新認識，其中就包括異養硝化概念的提出。異養硝化概念中認為氨氮不僅可以由自養菌來完成傳統意義上的硝化過程，某些異養菌也可以進行對氨氮的氧化作用，並且異養硝化作用的底物範圍更廣，既可以是無機態氮也可以是有機態氮，甚至可以將有機氮直接氧化為硝酸鹽氮，而跨過有機氮分解為氨氮、再氧化為亞硝酸鹽氮兩步。相對於自養硝化菌而言，異養菌雖有較低的分解效率，但是由於它在環境中的數量上往往遠大於自養菌，因此在某些環境之中，異養硝化作用的貢獻可以與自養菌相當，甚至超出。有些異養菌可以同時硝化和反硝化，使得在水中的氨或亞硝酸在氧化後，可以經脫氮作用，以氣體的形式釋放到大氣中，此種能力也能提供該菌種在環境上的競爭優勢。
目前對異養硝化菌的研究中，真菌被認為是數量最大、效率最高的異養硝化菌，如青黴菌和香麴黴菌、輪枝菌等等。此外，某些放線菌、細菌甚至藻類在自然界或實驗室的純培養中，也被確定為具有硝化能力的異養微生物。如反硝化假單胞菌、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginos)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、產鹼桿菌、節桿菌、糞產鹼菌(Alcaligenus faecalis)、PB16假單胞菌以及一些新發現的菌種(或屬)等等。
為了有效的調控、監測和評價硝化作用，對脫氮系統活性汙泥中微生物種群分布進行一定的研究，建立的一套新型可靠的分離異養硝化細菌的分離方法對系統中混合微生物菌群中的異養硝化細菌進行分離活性鑑別顯得十分重要和必要，具有重要的理論和應用價值。
Winogradsky認為自養硝化作用不能在牛肉明膠平板上發生生長，硝化細菌特別是銨鹽氧化細菌只能在無機鹽中運用特異性的化能自養方式生活，根本不能在營養明膠或營養瓊脂平板上生長。據此在分離自養硝化細菌的過程中為了證實分離自養硝化菌株的培養液中是否存在有機營養微生物汙染，就會用到肉膏瓊脂平板來進行檢驗，即肉膏瓊脂營養平板成為了檢驗「自養硝化細菌」純度的輔助工具，其上生長的為非分離目的自養硝化菌株的雜菌，而從不用以分離自養硝化細菌。
20世紀50年代，Quasel等對傳統的硝化作用自養細菌發生說提出了質疑，並以丙酮肟為唯一碳氮源，採用土柱滲濾進行選擇性加富培養，獲得了具有產生NO2-能力的異養菌株，後來的研究者多採用相似的方法進行異養硝化活性菌株的分離。目前常用的培養基有丙酮酸肟，乙醯胺及其它一些有機物如肟、吡啶等。這些方法的缺點是樣品前處理比較繁瑣，耗時費力，重複性差，分離的菌株單一且缺乏代表性。
經文獻檢索發現，申請號為03118598.3的中國發明專利公開了一種分離鑑定純化異養硝化微生物的方法，該專利的特徵為將待檢樣品塗布於牛肉浸膏-蛋白腖瓊脂平板後，挑取單菌落至上述牛肉浸膏-蛋白腖瓊脂平板繼續劃線純化，經28℃培養10天，格利斯試劑直接點滴到平板，進行硝化活性確認，並以不接菌的平板作空白對照。雖然這項專利所述方法操作相對簡便且所需時間較短，因此具較高實用性，然而，其所述的方法存在以下不足在應用上述方法時，由於試劑的純度不高所帶來的影響不易排除，因此需要對培養基的成分做較高要求，比如對其中的亞硝酸鹽及硝酸鹽的含量需要進行提前的驗證。由於目前國內市售的蛋白腖及牛肉膏中成分複雜，如果為了降低成本而使用市面上較易購得的蛋白腖後，往往在實驗分離過程中的塗布及劃線過程前，菌落周圍就由於培養基的影響而具有一定量的亞硝酸鹽或硝酸鹽，這樣勢必給實驗結果的判斷帶來很大的影響，從而影響到對異養硝化細菌的分離結果。

發明內容
本發明的目的在於針對以上所述各種分離方法的不足，提出一種新的分離篩選異養硝化細菌的方法，簡化實驗操作步驟，降低實驗試劑中雜質對實驗結果的幹擾，從而提高檢出率。
為實現這一目的，本發明首先製備牛肉膏-蛋白腖液體培養基，加入瓊脂後加熱滅菌，冷凝成平板固體培養基，然後將混合微生物菌群均勻塗布於牛肉膏-蛋白腖平板，靜置冷凝後於生化培養箱30℃下培養7-10天，在形成的菌落中挑取單菌落到牛肉膏-蛋白腖平板劃線純化得到純菌，然後將純菌菌苔接種於氨氧化能力鑑定培養液，採用格利斯試劑直接點滴入適量培養液中進行硝化活性鑑定，鑑定試驗以不接純化菌株的氨氧化能力鑑定培養液作空白對照。
本發明的方法具體包括如下步驟1、牛肉膏-蛋白腖培養基的製備按牛肉膏10g，蛋白腖10g，NaCl5g，1000mL蒸餾水的比例配製液體培養基，先將牛肉膏、蛋白腖、NaCl溶解於蒸餾水中，用1mol/L的NaOH調節培養基pH為7.0～8.0形成液體培養基，經121℃高溫高壓滅菌15～20分鐘。在上述牛肉膏-蛋白腖液體培養基中加入15～20g瓊脂，加熱使其充分溶解後裝於錐形瓶中，於121℃下滅菌15～20分鐘，待培養基冷卻至45～50℃後傾倒至滅菌的培養皿中，靜置冷凝成平板，得到牛肉膏-蛋白腖培養基。
2、混合微生物菌群的稀釋將樣品與無菌蒸餾水按體積比為1∶9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密閉後振蕩稀釋，得到稀釋10倍的樣品。然後取稀釋後的樣品與無菌蒸餾水按同樣的比例再次進行振蕩稀釋，共進行10次，每次稀釋倍數為10倍，得到10種不同稀釋度的樣品。
3、混合微生物菌群的塗布從各個稀釋度的樣品中均取0.1mL分別加入到製備好的牛肉膏-蛋白腖培養基平板上，用滅菌的塗布棒將稀釋樣品分散攤開使其乾燥。每個稀釋度的樣品三個重複，每變化一次稀釋度系列，要重新換移液管。靜置冷凝後，將培養基平板扣過來放於生化培養箱30℃下培養7-10天。
4、細菌的純化分離在形成菌落的平板內，挑選出90-110個孤立菌落的平板。在水平層流雙人淨化工作檯上，把裝有選出平板的培養皿中的孤立菌落用接種環挑出，移植到牛肉膏-蛋白腖培養基上，30℃條件下培養7-10天，然後，再用接種環挑取一菌環細菌菌苔放到無菌水中，充分振蕩。用此細菌懸液，按照活菌數測定方法在平板上塗布，使其在培養皿上形成30-50個孤立的菌落，而後把孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，反覆2-3次，即可得到經分離純化後的異養菌株。
5、氨氧化能力鑑定培養液的製備氨氧化能力鑑定培養液的製備取葡萄糖5g/L，(NH4)2SO40.5g/L，NaCl0.3g/L，K2HPO41.0g/L，MgSO4.7H2O0.3g/L，FeSO4.7H2O0.03g/L，CaCO37.5g/L，充分混合溶解後分裝於玻璃試管中，每隻試管分裝3mL，用矽膠塞塞緊，於110℃下高壓滅菌20min，製得氨氧化能力鑑定培養液。
6、格利斯試劑的配製稱取對氨基苯璜酸0.5g，溶於30mL冰醋酸和100mL蒸餾水的混合液中，過濾後製得對氨基苯磺酸溶液；稱取0.1gα-萘胺溶解於100mL熱蒸餾水中，冷卻後，加入30mL冰醋酸，過濾後製得α-萘胺溶液。將兩種溶液等量混合成格利斯試劑使用。
7、液體純培養的硝化活性驗證將經分離純化後獲得的異養菌株用接種環挑取一菌環菌苔接種於氨氧化能力鑑定培養液，於30℃條件下培養7-10天，培養期間每隔3天取2mL培養液至潔淨試管，將格利斯試劑1-2滴直接點滴入試管中進行硝化活性確認，並以不接純化菌株的氨氧化能力鑑定培養基作空白對照。若培養液變紅即可確定菌株具有硝化活性。
在將分離純化後的單菌落菌苔移至液體氨氧化能力鑑定培養液的過程中，注意接種環切莫觸碰瓊脂，以免瓊脂培養基中的雜質帶入液體氨氧化能力鑑定培養液，從而影響鑑定結果；且移入氨氧化能力鑑定培養液時，注意不要觸碰試管壁。
本發明中所適用的格利斯試劑需要在4℃冰箱中避光保存，要在兩周內使用，一旦發現混濁需要重新配置。
本發明通過牛肉膏-蛋白腖瓊脂平板分離，氨氧化能力鑑定液體培養基培養和格利斯試劑顯色等步驟可從混合微生物系中分離篩選異養硝化細菌，與現在所使用的方法相比，具有簡便，重複性好，分離菌株效果好，準確可靠的特點。
具體實施例方式
以下結合具體的實施例對本發明的技術方案作進一步描述。
本發明的一個實施例是在處理城市生活模擬汙水的高效膜生物反應器中對異養硝化細菌進行了分離篩選過程。
方法使用的主要實驗儀器和設備有立式壓力蒸汽滅菌器上海博訊實業有限公司醫療設備廠生產，型號YXQ-LS-50SI；生化培養箱廣東省醫療器械廠生產，型號LRH-250A；水平層流雙人淨化工作檯江蘇蘇州淨化設備有限公司生產，型號HS-1300；恆溫振蕩器江蘇常州國華電器有限公司生產，型號SHZ-82；顯微鏡日本Olympus生產，型號BX51TF。
本發明的方法按如下步驟進行1、牛肉膏-蛋白腖培養基的製備製備牛肉膏-蛋白腖液體培養基的配方如下牛肉膏10g/L，蛋白腖10g/L，NaCl5g/L。
製作過程稱取牛肉膏10g，蛋白腖10g，NaCl5g溶解於1000mL蒸餾水中，用1mol/L的NaOH調節培養基pH為7.0-7.2，形成液體培養基，經高溫高壓滅菌(121℃，15-20min)待用。
在上述牛肉膏-蛋白腖液體培養基中加入15-20g瓊脂，加熱使其充分溶解後裝於錐形瓶中，於121℃下滅菌15-20min，待培養基冷卻至45-50℃後傾倒至滅菌的培養皿中，靜置待冷凝成平板。使用時可放在沸水中溶解後使用。
2、混合微生物菌群的稀釋吸取膜生物反應器中的活性汙泥20mL加入到盛有180mL的無菌蒸餾水和玻璃珠的500mL三角瓶中，塞上滅菌的棉花塞，於恆溫振蕩器上以100r/min轉速30℃下振蕩10小時，而後取5mL稀釋液接於含有45mL無菌蒸餾水和玻璃珠的250mL三角瓶中，塞上滅菌的矽膠塞，於恆溫振蕩器上以100r/min轉速振蕩10分鐘。這是第二次稀釋倍數為10的稀釋，而後迅速用滅菌的移液管吸取10mL加入到90mL滅菌的無菌水中。第三次稀釋完畢後塞上經滅菌的棉塞，用手振蕩40次，取1mL加到9mL的無菌水中，此為第四次稀釋，而後一直再按照第三次稀釋方法連續稀釋6次。共進行10次稀釋，得到10種不同稀釋度的樣品。
3、混合微生物菌群的塗布從各個稀釋度的樣品中均取0.1mL分別加入到製備好的牛肉膏-蛋白腖培養基平板上，用滅菌的塗布棒將稀釋樣品分散攤開使其乾燥。每個稀釋度的樣品三個重複，每變化一次稀釋度系列，要重新換移液管。靜置冷凝後，將培養基平板扣過來放於生化培養箱30℃下培養7-10天。
4、細菌的純化分離在形成菌落的平板內，挑選出90-110個孤立菌落的平板。在水平層流雙人淨化工作檯上，把裝有選出的平板的培養皿中的孤立菌落用接種環挑出，劃線分離。
通常，可以認為一個菌落是由一個細胞發育來的，因此是由一個種類細菌組成的。可是，也有由種類不同的幾個細菌細胞形成一個菌落的可能性。所以，為慎重起見需要對這些菌進行純化。待形成菌落後，再用接種環移植到固體培養基上，30℃條件下培養7-10天，然後，再挑取一接種環的細菌菌苔放到無菌水中，充分振蕩。用此細菌懸液，按照活菌數測定方法在平板上塗布，使其在培養皿上形成30-50個孤立的菌落，而後把孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，反覆2-3次，即可得到經分離純化後的異養菌株。並以不接菌的平板做空白對照。
5、氨氧化能力鑑定培養液的製備配方如下葡萄糖5g/L，(NH4)2SO40.5g/L，NaCl0.3g/L，K2HPO41.0g/L，MgSO4.7H2O0.3g/L，FeSO4.7H2O0.03g/L，CaCO37.5g/L。
製作過程稱取以上各物質相應質量，充分混合溶解後將其分裝於玻璃試管中，規格為18×150毫米，每隻試管分裝3mL，用矽膠塞塞緊，於110℃下高壓滅菌20min。製得氨氧化能力鑑定培養液。
6、格利斯試劑的配製格利斯試劑由兩種溶液混合使用。1、對氨基苯磺酸溶液稱取對氨基苯璜酸0.5g，溶於30mL冰醋酸和100mL蒸餾水的混合液中，過濾，避光保存，此試劑一個月內可用；2、α-萘胺溶液稱取0.1gα-萘胺溶解於100mL熱蒸餾水中，冷卻後，加入30mL冰醋酸，過濾，避光保存，此試劑一個星期內可用。
臨用前兩種溶液等量混合。
7、液體純培養的硝化活性驗證將獲得的經分離純化後的異養菌株由牛肉膏-蛋白腖固體培養基中用接種環挑取一菌環純菌菌苔接種於氨氧化能力鑑定培養基，30℃條件下培養7-10天，培養期間每隔3天取2mL培養液至潔淨試管，將格利斯試劑1-2滴直接點滴入試管中進行硝化活性確認，並以不接純化菌株的氨氧化能力鑑定培養基作空白對照。如現紅色乃至褐色，則說明由於硝化作用而積蓄了亞硝酸鹽。2-3分鐘後再在未顯色的試管中用小藥匙加入鋅粉少許，靜置，觀察是否呈現紅色。如加入鋅粉後顯紅色，則說明培養液中的產生了硝酸鹽。即菌株也具有硝化活性，初步確認為硝化活性菌。
本發明由膜生物反應器系統的混合菌群中分離篩選出了具有硝化活性的異養細菌，分別編號為B1及B2，並分別進行了相關的細菌學鑑定以及生理生化試驗研究，結果如下菌株B1在牛肉膏蛋白腖培養基平板上培養1-2天後形成的菌落呈乳白色，不透明，革蘭氏陽性芽孢桿菌，細菌大小為(0.5-0.6)μm×(1.6-2.6)μm，具球桿變化周期，60℃不生長，不具抗酸性。接觸酶陽性，V-P試驗陰性，澱粉水解陰性，厭氧洋菜不生長，葡萄糖不產酸，除個別生理生化特徵(可利用葡萄糖做有機碳源等)外，其主要特徵與Bacillus macroides基本一致。
菌株B2在牛肉膏蛋白腖培養基平板上培養1天後形成的菌落呈乳白色偏灰，不透明，細菌大小為(0.4-0.6)μm×(1.2-2.1)μm，具球桿變化周期。革蘭氏染色實驗中，菌株在培養初期為呈陽性的芽孢桿菌，但革蘭氏染色不穩定，在生長至7天左右染色卻呈陰性，且菌落變至褐色。60℃不生長，不具抗酸性。接觸酶陽性，V-P試驗陽性，澱粉水解陰性，厭氧洋菜不生長，葡萄糖產酸，除個別生理生化特徵(不具抗酸性，不在銨態氮上生長)外，其主要特徵與短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)基本一致。
權利要求
1.一種分離篩選異養硝化細菌的方法，其特徵在於包括如下步驟1)牛肉膏-蛋白腖培養基的製備按牛肉膏10g，蛋白腖10g，NaCl 5g，1000mL蒸餾水的比例配製液體培養基，先將牛肉膏、蛋白腖、NaCl溶解於蒸餾水中，用1mol/L的NaOH調節培養基pH為7.0～8.0形成液體培養基，經121℃高溫高壓滅菌15～20分鐘；在上述牛肉膏一蛋白腖液體培養基中加入15～20g瓊脂，加熱使其充分溶解後裝於錐形瓶中，於121℃下滅菌15～20分鐘，待培養基冷卻至45～50℃後傾倒至滅菌的培養皿中，靜置冷凝成平板，得到牛肉膏-蛋白腖培養基；2)混合微生物菌群的稀釋將樣品與無菌蒸餾水按體積比為1∶9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密閉後振蕩稀釋，得到稀釋10倍的樣品，然後取稀釋後的樣品與無菌蒸餾水按同樣的比例再次進行振蕩稀釋，共進行10次，每次稀釋倍數為10倍，得到10種不同稀釋度的樣品；3)混合微生物菌群的塗布從各個稀釋度的樣品中均取0.1mL分別加入到製備好的牛肉膏-蛋白腖培養基平板上，用滅菌的塗布棒將稀釋樣品分散攤開使其乾燥，每個稀釋度的樣品三個重複，每變化一次稀釋度系列，要重新換移液管，靜置冷凝後，將培養基平板扣過來放於生化培養箱30℃下培養7-10天；4)細菌的純化分離在形成菌落的平板內，挑選出90-110個孤立菌落的平板，在水平層流雙人淨化工作檯上，把裝有選出平板的培養皿中的孤立菌落用接種環挑出，移植到牛肉膏-蛋白腖培養基上，30℃條件下培養7-10天，然後，再用接種環挑取一菌環細菌菌苔放到無菌水中，充分振蕩，用此細菌懸液按照活菌數測定方法在平板上塗布，使其在培養皿上形成30-50個孤立的菌落，而後把孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，反覆2-3次，即可得到經分離純化後的異養菌株；5)氨氧化能力鑑定培養液的製備取葡萄糖5g/L，(NH4)2SO40.5g/L，NaCl0.3g/L，K2HPO41.0g/L，MgSO4.7H2O0.3g/L，FeSO4.7H2O0.03g/L，CaCO37.5g/L，充分混合溶解後分裝於玻璃試管中，每隻試管分裝3mL，用矽膠塞塞緊，於110℃下高壓滅菌20min，製得氨氧化能力鑑定培養液；6)格利斯試劑的配製稱取對氨基苯璜酸0.5g，溶於30mL冰醋酸和100mL蒸餾水的混合液中，過濾後製得對氨基苯磺酸溶液；稱取0.1gα-萘胺溶解於100mL熱蒸餾水中，冷卻後，加入30mL冰醋酸，過濾後製得α-萘胺溶液；將兩種溶液等量混合成格利斯試劑使用；7)液體純培養的硝化活性驗證將經分離純化後獲得的異養菌株用接種環挑取一菌環細菌菌苔接種於氨氧化能力鑑定培養液，30℃條件下培養7-10天，培養期間每隔3天取2mL培養液至潔淨試管，將格利斯試劑1-2滴直接點滴入試管中進行硝化活性確認，並以不接純化菌株的氨氧化能力鑑定培養基作空白對照，若培養液變紅即可確定菌株具有硝化活性。
全文摘要
本發明涉及一種分離篩選異養硝化細菌的方法，首先製備牛肉膏—蛋白腖液體培養基，加入瓊脂後加熱滅菌，冷凝成平板固體培養基，然後將混合微生物菌群均勻塗布於牛肉膏—蛋白腖平板，靜置冷凝後於生化培養箱30℃下培養7－10天，在形成的菌落中挑取單菌落到牛肉膏—蛋白腖平板劃線純化得到純菌，然後將純菌菌苔接種於氨氧化能力鑑定培養液，採用格利斯試劑直接點滴入適量培養液中進行硝化活性鑑定，鑑定試驗以不接純化菌株的氨氧化能力鑑定培養液作空白對照。本發明通過牛肉膏—蛋白腖瓊脂平板分離，氨氧化能力鑑定液體培養基培養和格利斯試劑顯色等步驟，可從混合微生物系中分離篩選異養硝化細菌，具有簡便，重複性好，準確可靠的特點。
文檔編號C12N1/20GK1786184SQ20051003045
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月13日 優先權日2005年10月13日
發明者林燕, 何義亮, 孔海南 申請人:上海交通大學