改進的聚合酶的製作方法

2023-10-04 11:12:54 1

專利名稱：：改進的聚合酶的製作方法
技術領域：
：本發明涉及聚合酶，更具體地涉及經修飾的DNA聚合酶，其具有對DNA的親和力，從而所述聚合酶能夠在每個反應循環中將核苷酸摻入多個分開的DNA模板中，並能夠在每個反應循環中形成數目增加的生產性聚合酶-DNA複合物。本發明的範圍中還包括使用所述經修飾的聚合酶用於測序尤其是在聚簇陣列中的方法。
背景技術：
：某些DNA聚合酶的三維晶體結構顯示為三個單獨的亞結構域，稱為掌(palm)、指(finger)和拇指(thumb)(Joyce,C.M.和Steiz，T.A.(1994)FunctionandstructurerelationshipsinDNApolymerases,Annu.Rev.Biochem.,63，777-822)，每個亞結構域在DNA症合期間均發揮關鍵作用。已發現DNA聚合酶的C端拇指結構域與DNA結合和持續合成能力相關(Doublie等1998.Nature391,251;Truniger等2004.NucleicAcidsResearch32,371)。DNA聚合酶這一區域中的殘基與"引物:模板"雙鏈體相互作用。通過引入定點突變或者通過缺失少量胺基酸的截短來破壞這一區域的結構已證明變體的DNA親和力和持續合成能力降低，而其他物理特性如dNTP親和力和核苷酸插入保真度則沒有重大變化(Truniger等2004.NucleicAcidsResearch32,371;Minnick等1996.J.Biol.Chem.,271,24954;Polesky等1990.J.Biol.Chem.，265,14579)。聚合酶可分為兩個結構不同的家族，稱為A家族和B家族。對B家族聚合酶C端亞結構域的研究不多，但相信其參與DNA結合，這主要是基於對聚合酶RB69封閉形式(與DNA結合)X射線晶體結構的觀察。已經在兩個B家族類別實例(即Phi29和T4)的這一拇指結構域中進行了誘變研究。然而，這些研究僅限於該結構域中大部分胺基酸的缺失。對Klenow(A家族的聚合酶)進行了同樣類型的缺失。就其結合和摻入dNTP的能力、該缺失對保真度的影響、其對DNA的親和力及其與輔助蛋白的相互作用來評價這些研究中變體的性能。之前還未對來自嗜熱古細菌(thermophilicarchaeon)聚合酶的拇指結構域進行過研究。
發明內容本發明基於聚合酶與DNA模板的緊密結合併不總是有利特性這一認識。在每個反應循環中僅需要單個核苷酸摻入事件的測序反應中尤其是這樣。因此，對於與DNA緊密結合的聚合酶，該聚合酶參與將核苷酸摻入多個DNA鏈的能力較^J"DNA親和力較低的聚合酶變體來說受到限制。本發明:沒計了DNA測序方法，所述方法使用在3，糖羥基中具有修飾的核苷酸類似物，從而阻斷其它核苷酸的摻入(參閱WO03/048387的實施例及其所述引用文獻)。使用帶有3，阻斷的核苷酸允許以受控方式將連續的核苷酸摻入多核苷酸鏈中。在加入每個核苷酸後，3，阻斷的存在阻止其它核苷酸摻入所述鏈中。一旦確定了所摻入核苷酸的性質之後，可以去除該阻斷，留下游離的3，羥基基團用於加入下一個核苷酸。另外，在諸如涉及經修飾核苷酸的測序反應(如上所述，並在下文中有更詳細討論)之類的反應中，聚合酶的緊密結合實際上可能就反應的完成而言表現為某些缺點。例如，如果具有緊密DNA結合親和力的無活性聚合酶分子與模板DNA分子形成穩定的複合體，則該特定模板DNA分子不可能得到延伸。有了這樣的認識，本發明提供了與模板DNA具有較弱相互作用的改變的聚合酶。因此，本發明的所述聚合酶具有改進的能力，在反應循環中從一個模板DNA分子移動到另一個上。這種形成數目增加的生產性聚合酶-DNA複合物的能力優點在於可以顯著改進在每個反應循環中加入單個核苷酸的反應的水平或^Jl完成情況。未修飾的聚合酶傾向於以高親和力與DNA結合，從而方程、聚合S+DNA聚合嘛DNA強烈偏移而有利於形成[Pol:DNA複合物。相反，在本發明中，所述改變的聚合酶與DNA結合得較差，意味著平衡位置向左側移動。因此，本發明提供了改變的聚合酶，其具有降低的DNA親和力，從而該聚合酶能夠在每個反應循環中將核苷酸摻入多個分開的DNA模板中。"DNA模板"指可以與所述聚合酶結合併用作核酸合成模板的任何DNA分子。本文定義的"核苷酸"包括核普酸和核苷。就核苷酸而言，核苷包含通過糖普鍵與核糖或脫氧核糖連接的噪呤或嘧啶，但是它們缺乏使其成為核苷酸的磷酸殘基。該定義中包括合成的和天然存在的核苷酸。該定義中包括標記的核苷酸。該聚合酶的有利特性是由於它們對DNA模板的親和力降低，同時保持了與所摻入核苷酸的親和力和保真度。在一個優選的方面中提供了改變的聚合酶，其對DNA的親和力降低，從而所述聚合酶能夠在每個反應循環中將至少一個合成核苷酸摻入多個DNA模板中。在本發明之前，從未認識或提出過修飾聚合S^f吏之適合摻入非天然核苷酸、在降低其DNA親和力而同時保持其有利特性的問題。在一個實施方案中，所述核苷酸包含在熟知的Sanger測序反應中使用的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。這些核普酸可以是標記的，例如用任何質量標記、放射性標^己或螢光標記進^f於標記。在另一個實施方案中，所述核苷酸包含這樣的核苷酸其在3，糖羥基處進行了修飾，從而與對照聚合酶比較，該取代基大於天然存在的3，羥基。在優選的實施方案中，所述核苷酸包含具有嘌呤或嘧咬鹼基以及核糖或脫氧核糖糖部分的核苷酸，該糖部分具有與其共價連接的可去除的3'-OH阻斷基團，從而3，碳原子連接在以下結構的基團上-O-Z其中Z為-C(R，)2-0-R"、-C(R，)2-N(R")2、-C(R，)2-N(H)R"、-C(R，)2-S-R"和-C(R，)2-F中的任何一種，其中每個R"為可去除的保護基團或其部分；每個R，獨立地為氫原子、烷基、取代烷基、芳基烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、統基、氰基、烷氧基、芳氡基、雜芳氡基或M，或通過連接基連接的檢測標記；或者(R，)2代表式為二C(R，，，)2的亞烷基，其中每個R"，可以是相同的或不同的，並且選自氫、閨素原子和烷基；並且其中所述分子可以反應生成中間體，其中每個R"替換為H，或者當Z為-C(R，)2-F時，F替換為OH、SH或NH2，優選OH,所述中間體在水性M下解離以提供帶有游離3'OH的分子；其滿足以下條件當Z為-C(R，)2-S-R，，時，兩個R，基團不全是H。根據一個實施方案，通過本發明聚合酶摻入的核苷或核苷酸包含嘌呤或嘧咬鹼基以及核糖或脫氧核糖糖部分，該糖部分具有與其共價連接(優選在3，0位置)的阻斷基，所述阻斷基使所述分子可用於需要阻斷3'-OH基團以阻止摻入其他核苷酸的技術中，例如在測序反應、多核苷酸合成、核酸擴增、核酸雜交分析、單核苷酸多態性研究及其它此類技術。一旦去除所述阻斷基，便可能將另一個核苷酸摻入到游離的3'-OH基團上。優選的經修飾核苷酸在SolexaLimited名下的國際專利申請7>布號WO2004/018497中有舉例，所述參考文獻以其整體併入本文。在優選的實施方案中，經修飾核苷酸或核香的R，基團是烷基或取代烷基。在另一個實施方案中，經修飾核苷酸或核苷的-Z基團的式為-C(R')2-N3。在最優選的實施方案中，經修飾核苦酸或核苷包含Z基團，所述Z基團為疊氮基曱基基團。如下所詳述的，本發明的優選聚合酶特別優選用於摻入其中Z為疊氮基甲基基團的核苷酸類似物。所述經修飾核苷酸可通it^由期望的接頭與檢測標記連接，其中所述標記可以是例如螢光團。需要時，所述檢測標記也可以摻入式"Z，，的阻斷基中。所述接頭可以是酸不穩定的、光不穩定的或者含有二硫鍵。本發明可使用其它連接，尤其是可被磷化氫切割的含有疊氮化物的接頭，如WO2004/018497中的詳細描述，其內容以其整體併入本文。優選的標記和連接包括WO03/048387公開的標記和連接。此參考文獻以其整體併入本文。在一個實施方案中，所述經修飾的核香酸或核苷具有通過可切割的接頭與檢測標記連接的鹼基，其特徵在於所述可切割接頭含有選自以下的結構formulaseeoriginaldocumentpage12(其中X選自包括以下的集合O、S、NH和NQ，其中Q為Cw。的取代或未取代的烷基，Y選自O、S、NH和N(烯丙基)，T為氫或Cwo的取代或未取代烷基，*表示該部分與核苷酸或核苷的其它部分相連的位置)。在一個實施方案中，所述檢測標記包含螢光標記。合適的螢光團在本領域中是眾所周知的。在優選的實施方案中，每種不同的核苷酸類型帶有不同的螢光標記。這有利於識別和摻入特定的核苷酸。因此，例如4務飾的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧咬都與各自的螢光團結合，從而容易地將它們彼此進行區分。令人驚奇地，已發現改變的聚合酶能夠摻入帶有多種不同螢光標記的^務飾核苷酸類似物。而且，所述聚合酶能摻入所有四種威基。就本發明聚合酶在核酸測序方案中的用途而言，這些特性提供了重要的優勢。如上所述，優選的核苷酸類似物包括在3'位置包含O-疊氮曱基功能性的核苦酸類似物。應該理解，對於其它核苷酸類似物來"^兌，顯著影響DNA結合的C端拇指亞結構域區域中的優選聚合酶M酸序列可以為了實現最佳摻入而有所改變。對於任何給定的核苷酸類似物，可以通過實驗來確定C末端拇指亞結構區域(例如在RB69中的Lys7卯、800、844、874、878和Arg806殘基，以及在9°N聚合酶中的Arg743、Arg713和Lys705殘基，下文將有更詳細的討論)中最佳的序列偏好，例如構建文庫或離散數(discretenumber)的突變體，之後在摻入測定系統中測試各個變體。如上所提及的，本發明的改變聚合酶能夠改善所有核苷酸的摻入，包括多種具有不同尺寸和多種化學性質的大3，取代基的修飾核苷酸。所述聚合酶的有利特性是由於其對DNA模板的親和力降低，導致該聚合酶與DNA的解離增加，而不對與摻入核苷酸的親和力和保真度產生不利影響。由於本發明聚合酶的DNA結合親和力降低，因此能夠在單個反應循環中將一個或多個核苷酸摻入若干不同的DNA分子中。因此提高了反應的總體效率，引起完成水平的提高。"反應循環"指允許核苷酸摻入模板中的適當反應時間段。單個反應循環的示例性條件為一個30分鐘、45°C孵育的時間段。許多聚合反應在過量於聚合酶的DNA存在下發生。本發明的聚合酶使這樣的聚合反應更加有效地進行，因為該聚合酶可以在分開的模板DNA分子上催化多輪核苦酸摻入。另一方面，未改變的聚合酶特別是與DNA結合更為緊密的聚合酶不具備這種能力，因為它在每個反應循環中更可能只在單個模板上參與核苷酸摻入。本發明的聚合酶允許在就DNA濃度而言，聚合酶濃度為限制性的條件下實現高水平的反應完成。具體地，所述聚合酶在DNA:聚合酶比為至少約2:1、3:1或5:1的條件下表現出提高的將一個或多個核苷酸摻入分開的DNA分子的能力。然而，在高聚合酶濃度下，該提高可能被掩蓋。因此，改變的聚合酶具有對DNA的親和力，從而該聚合酶能夠在每個反應循環中形成數目增加的生產性聚合酶-DNA複合物。本發明聚合酶的改進特性可以與適當的對照進行比較。本文定義的"對照聚合酶"定義為改變聚合酶的活性與其進行比較的聚合酶。對照聚合酶與改變聚合酶為同樣的類型，但是不帶有降低聚合酶對DNA的親和力的改變。因此，在非常優選的實施方案中，所述對照聚合酶為9°N聚合酶，所述修飾聚合酶為同一9°N聚合酶，只是存在降低9°N聚合酶與DNA的親和力的一種或多種4務飾。在一個實施方案中，所述對照聚合酶為野生型聚合酶，對其進行改變以提供改變的聚合酶，所述改變聚合酶可以直接與未改變的聚合酶進行比較。在一個實施方案中，所述對照聚合酶在與9。NDNA聚合酶M酸序列中Leu408、Tyr409和Pro410功能等價的位置上包含替換突變。因此，在該實施方案中，該對照聚合酶具有以下替換突變第408位從亮氨酸替換為不同的胺基酸，第409位從酪氨酸替換為不同的胺基酸以及第410位從脯氨酸替換為不同的胺基酸；或者，如果該聚合酶不是9°NDNA聚合酶時則在功能等價的位置上。在另一個實施方案中，所述對照聚合酶在9°NDNA聚合酶JL^酸序列中包含與Leu408Tyr、Tyr409Ala和Pro410Val功能等價的替換突變。因此，在該實施方案中，該對照聚合酶帶有以下替換突變第408位從亮氨酸替換為酪氨酸，第409位從酪氨酸替換為丙氨酸以及第410位從脯氨酸替換為纈氨酸；或者，如果該聚合酶不是9。NDNA聚合酶時則在功能等價的位置上。在優選的實施方案中，所述對照聚合酶為包含所述替換突變的9。NDNA聚合酶。所述對照聚合酶還可以在與9°NDNA聚合酶M酸序列中Cys223功能等價的位置上包含替換突變。因此，在該實施方案中，所述對照聚合酶帶有第223位從半胱氨酸替換為不同的胺基酸的替換突變，或者如果該聚合酶不是9。NDNA聚合酶時則在功能等價的位置上。在優選的實施方案中，該對照聚合酶是包含所述替換突變的9。NDNA聚合酶。在另一個實施方案中，該對照聚合酶包含與9°NDNA聚合酶^J^酸序列中Cys223Ser功能等價的替換突變。因此，在該實施方案中，所述對照聚合酶具有第223位從半胱氨酸替換為絲氨酸的替換突變，或者如果該聚合酶不是9°NDNA聚合酶時則在功能上等同的位置上。在優選的實施方案中，該對照聚合酶是包含所述替換突變的9°NDNA聚合酶。優選地，所述對照聚合酶是包含上述突變的組合的9°NDNA聚合酶。所述聚合酶一般具有降低的DNA親和力。這可以通過解離常數來定義。因此，野生型聚合酶傾向於具有納摩爾-皮摩爾範圍內的解離常數。就本發明目的而言，與對照未改造聚合酶相比具有降低的DNA親和力的聚合酶是適合的。優選的，由於所述改變，該聚合酶的解離常數與對照未改造聚合酶相比提高至少或大約2倍、3倍、4倍或5倍。"功能等價，，指胺基酸替換認為在另一聚合酶中與所述酶功能相同的胺基酸位置上發生。例如，VentDNA聚合酶中第412位從酪氨酸替換為纈氨酸的突變(Y412V)與9。N聚合酶中第409位從酪氨酸替換為纈氨酸的替換(Y409V)功能等價。認為該胺基酸殘基的體積是作為阻斷核苷酸糖的2，-鞋基iiA結合位點的"立體閘門(stericgate)"。同樣地，認為Vent聚合酶中的488位殘基與9°N聚合酶中485位胺基酸等價，從而認為Vent中488位從丙氨酸變為亮氨酸的突變(A488L)與9°N聚合酶中A485L突變等價。通常地，兩個或多個不同聚合酶中功能等價的替換突變發生在這些聚合酶的AJ^酸序列中同源的M酸位置上。因此，本文使用的術語"功能等價"也包括與給定的突變"位置等價"或"同源"的突變，而不管該突變胺基酸的具體功能是否已知。基於序列比對和/或分子建模有可能鑑定兩個或多個不同聚合酶的M酸序列中位置等價或同源的氛基酸殘基。所述改變聚合酶一般是"分離的"或"純化的"多肽。"分離的多肽"指基本上與汙染細胞組分分離的多肽，所述汙染細胞組分為例如可與所述多肽天然相關的碳7jC化合物類、脂類、核酸類或其它蛋白質雜質。一般地，分離聚合酶的製備物包含高度純化形式的所述聚合酶，即至少約80%的純度，優選至少約90%的純度，更優選至少約95%的純度，更優選至少約98%的純度並且最優選至少約99%的純度。所述酶製備物的純度可通過例如在標準SDS-聚丙烯醯胺電泳凝膠上出現單一條帶來評估。所述改變聚合酶可以是"重組，，多肽。本發明的改變聚合酶可以是任何DNA聚合酶。更具體地，所述改變的聚合酶可以是B家族類型的DNA聚合酶，或者其突變體或變體。B家族DNA聚合酶包括許多古細菌DNA聚合酶，人DNA聚合酶a以及T4、RB69和(J)29噬菌體DNA聚合酶。對這些聚合酶的研究弱於包含諸如7i^和T7DNA聚合酶之類聚合酶的A家族聚合酶。在一個實施方案中，所述聚合酶選自任何B家族古細菌DNA聚合酶、人DNA聚合酶a或T4、RB69和小29噬菌體DNA聚合酶。所述古細菌DNA聚合酶在許多情況中來自超嗜熱古細菌(hyperthermophilicarchea)，這意味著該聚合酶常常是熱穩定性的。因此，在另一個優選的實施方案中，所述聚合酶是嗜熱古細菌聚合酶，並優選地選自Vent、DeepVent、9°N和Pfu聚合酶。Vent和DeepVent分別是分離自超嗜熱古細菌TT^nnococcws//似rafc和激烈熱球菌(i^racoccMS/im'os"s)的B家族DNA聚合酶的商品名。9°N聚合酶也鑑定自TT^twococcmsw。Pfu聚合酶分離自激烈熱球菌。如上所述，在本發明之前尚未研究過嗜熱聚合酶的拇指結構域。本發明中最優選的聚合酶是9°N聚合酶，包括其突變體和變體。9°N聚合酶不需要輔助蛋白。這與先前研究過的聚合酶相反，在所述聚合酶中拇指結構域的缺失顯示出對與輔助蛋白之間相互作用的不利影響，而不改變該聚合酶的其它特性。相反地，如下文實驗章節中所示，9°N中大量殘基的缺失對於9°N的重要特性具有顯著的不利影響，從而使催化活性嚴重受損。應該理解，本發明並不旨在限於B家族聚合酶的突變體或變體。所述改變的聚合酶也可以是a家族聚合酶或其突變體或變體，例如r"《或T7DNA聚合酶的突變體或變體，或既不屬於A家族也不屬於B家族的聚合酶，例如逆轉錄酶。然而，如本文所述的原因，B家族聚合酶是特別優選的。本發明考慮使聚合酶由於DNA親和力降低而表現出所需的特性的多種不同類型的改變。雖然添加和缺失突變也可以產生有用的聚合酶，但是特別優選在所述聚合酶的原始M酸序列中進行替換突變。適當的改變技術如定點誘變是本領域公知的。因此，"改變的聚合酶"指與對照聚合酶相比具有至少一個胺基酸改變的聚合酶。通常，這種改變包括至少將一個^酸替換成其他胺基酸。在優選的實施方案中，這些改變是非保守性改變，儘管本發明也考慮可以維持蛋白質的總體電荷分布的保守性改變。而且，本發明的預期中包括所述聚合酶序列中的修飾可以是蛋白質中一個或多個氛基酸的缺失或添加，只要得到的聚合酶與對照聚合酶相比具有降低的DNA親和力以及在每個反應循環中將核苷酸摻入多個分開的DNA模板中的能力。在一個實施方案中，形成本發明聚合酶的改變包含所述聚合酶殘基中的至少一種突變，優選至少一種替換突變，所述突變使該聚合酶與DNA的相互作用不穩定。因此，得到的聚合酶以較不穩定的方式與DNA相互作用。如上所述，該聚合酶對DNA親和力的降低使其在單個反應循環中將一個或多個核苷酸摻入若干不同DNA分子中。因此，反應的總體效率得到提高，引^^應完成水平的提高。在另一個實施方案中，所述改變包括所述聚合酶中與DNA結合的殘基處至少一種突變，優選至少一種替換突變。可以根據適當聚合酶的可用晶體結構選捧用於突變的適當靶殘基，特別是在以封閉狀態(與DNA結合)結晶時。通過減少與DNA結合接觸的數目，可以實現DNA結合親和力的總體降低。因此，所得的聚合酶在核香酸摻7^應中表現出的改進的特徵，在所述核苷酸摻入反應中與DNA的緊密結合是不利的。以相似的方式，所述聚合酶也可以帶有包含這樣的改變其包含所述聚合酶DNA結合結構域中的戎基處的至少一種突變，優選至少一種替換突變。同樣，預計這樣的突變降低所述改變聚合酶的DNA結合親和力，以j吏其能夠在反應期間更容易地與分開的模板DNA分子結合和解離。在一個實施方案中，該聚合酶包含這樣的改變其包含所述聚合酶中鹼性氛基酸處的至少一種突變，優選至少一種替換突變。如本領域所公知，聚合酶中許多帶正電荷的胺基酸殘基與整體帶負電荷的DNA雙螺旋相互作用，尤其與DNA中核苷酸的特定磷g團相互作用。如上所述，得到本發明聚合酶的優選改變類型包含至少一種替換突變。如以下實驗章節所示，在所述聚合酶^J^酸序列中缺失殘基可導致DNA親和力降低同時由於催化活性被破壞而不具有總體有利特性的聚合酶。在一個特別優選的實施方案中，所述聚合酶包含兩個替換突變，也可以包含四、五、六或七個等突變，只要得到的聚合酶具有所需特性。優選地，所述聚合酶與核苷酸的親和力基本不受所述改變的影響。如實驗章節(尤其是實施例6)所示，有可能突變聚合酶以使其DNA親和力降低，而該聚合酶與核苷酸的親和力不受負影響，所述核苷酸可以是例如dNTP或ddNTP或其修飾形式(參見上文對核苦酸的定義)。在該上下文中，"基本不受影響"指與核普酸的親和力維持在與未改變聚合酶相同的數量級。優選地，與核苷酸的親和力不受改變的影響。優選地，所述聚合酶的保真復基本不受改變的影響。如實驗章節(尤其是實施例6)所示，可以突變聚合酶以使其DNA親和力降低，同時該聚合酶的保真度基本不受該改變的影響。在該上下文中，"基本不受影響，，指每個核苷酸的誤摻入率的數量級與未改變聚合酶相同。優選地，對核苦酸的保真度不受所述改變的影響。就具體的和優選的結構突變體而言，它們可以基於最優選的聚合酶，即9°NDNA聚合酶。如下文實施例1中所述，使用對9。N-7DNA聚合酶開放形式的晶體結構(PDB=lqht)、密切相關的DNA聚合酶RB69的開放結構(PDB=lih7)以及RB69的封閉形式(PDB=lig9)進行的能量最小化重疊比對(通過Cresset實現)作為鑑定參與DNA結合的關鍵殘基的結構才莫型。因此，改變的聚合酶在9°NDNA聚合酶M酸序列中Lys705、Arg713和/或Arg743位置或與其功能等價的位置上包含或摻入了一個、兩個或三個替換成不同胺基酸的M酸替換突變。優選地，所述聚合酶為包含這些突變的9。NDNA聚合酶。所有一個、兩個或三個突變的組合和排列均考慮在本發明的範圍內。基於"開放式"(即不與DNA結合)9°NDNA聚合酶結構和與DNA結合的RB69聚合酶已知晶體結構的比對，也可以在其它特定殘基處產生突變。因此，改變的聚合酶在9°NDNA聚合酶M酸序列中Arg606和/或His679位置或與其功能等價的位置上包含或摻入了一個或兩個替換成不同胺基酸的M酸替換突變。優選地，所述聚合酶為包含這些突變的9°NDNA聚合酶。所有不同的突變的組合和排列均考慮在本發明的範圍內。因此，這些突變可以與上述其它突變組合產生。在一個優選的實施方案中，所述聚合酶在9°NDNA聚合酶M^列中Arg713或Arg743位置或與其功能等價的位置包含至少一個替換為不同胺基酸的替換突變。如下文實驗章節中更詳細的描述，這兩個位置代表了特別優選的突變位點。可以將同一個聚合酶中的這兩個殘基都突變為不同的氛基酸。就所述不同胺基酸的性質而言，所述替換突變或突變優選地將4皮替換胺基酸轉換為非鹼性胺基酸(即，不是賴氨酸或精氨酸)。可以選擇任何非鹼性氬基酸。優選的替換突變或突變將被替換胺基酸轉換為以下的胺基酸①酸性氬基酸，(ii)芳香胺基酸，尤其是酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F);和(iii)非極性胺基酸，尤其是丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或曱硫氨酸(M)。在一個實施方案中，所述替換突變或突變將替換M酸轉換為丙氨酸。在更具體的實施方案中，改變的聚合酶包含與9。NDNA聚合酶M酸序列中Lys705Ala和/或Arg713Ala和/或Arg743Ala功能等價的替換突變或突變。因此，在該實施方案中，所述聚合酶具有以下替換突變705位從賴氨酸替換為丙氨酸和/或713位^Mt氨酸替換為丙氨酸和/或743位從精氨酸替換為丙氨酸，或者如果該聚合酶不是9°NDNA聚合酶時則在功能等價的位置上。在優選的實施方案中，所述聚合酶是包含所述替換突變的9°NDNA聚合酶。在一個實施方案中，所述改變的聚合酶包含與Arg713Ala功能等價的胺基酸替換，並且在另一個實施方案中，所述改變的聚合酶包含與Arg743Ala功能等價的M酸替換。優選地，改變的聚合酶為9°NDNA聚合酵。特定的結構突變體也可以基於其它類型的聚合酶，如"開放式"和"封閉式"結構已知的RB69聚合酶。因此，改變的聚合酶在RB69DNA聚合酶^J^財列中Lys790、Lys800、Arg806、Lys844、Lys874和/或Lys878位置或與其功能等價的位置上包含或摻入了一個、兩個、三個、四個、五個或六個替換為不同胺基酸的JL&酸替換突變。優選地，所述聚合酶為包含這些類似的或功能等價的突變的9°NDNA聚合酶。所有一個、兩個、三個、四個、五個或六個突變的組合和排列均考慮在本發明的範圍內。就所述不同胺基酸的性質而言，所述替換突變或突變優選地將4皮替換胺基酸轉換為非鹼性胺基酸(即，不是賴氨酸或精氨酸)。可以選擇任何非鹼性胺基酸。優選的替換突變或突變將被替換胺基酸轉換為以下的胺基酸(i)酸性胺基酸，(ii)芳香胺基酸，尤其是酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F);和(iii)非極性胺基酸，尤其是丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或曱硫氨酸(M)。在一個實施方案中，所述替換突變或突變將被替換胺基酸轉換為丙氨酸。應該注意，本發明不限於只以上述方式進行改變的聚合酶。本發明的聚合酶可以包括^午多其他突變，例如詳細v^開於WO2005/024010的優選的突變體聚合酶。具體地，考慮在與9°NDNA聚合酶M酸序列中Leu408和Tyr409和Pro410功能等價位置上包含替換突變的聚合酶。在優選的實施方案中，該聚合酶為包含所述替換突變的9°NDNA聚合酶。在具體的實施方案中，所述聚合酶包含與9°NDNA聚合酶M^列中Leu408Tyr、Tyr409Ala和Pro410Val中至少一種或兩種但優選全部功能等價的替換突變。在優選的實施方案中，所述聚合酶為包含所有所述替換突變的9°NDNA聚合酶。所述聚合酶還可以包含與9°NDNA聚合酶^&,列中Cys223功能等價的位置上的替換突變。在優選的實施方案中，所述聚合酶為包含所述替換突變的9。NDNA聚合酶。在一個實施方案中，所述聚合酶包含與9°NDNA聚合酶M酸序列中Cys223Ser功能等價的替換突變。在優選的實施方案中，所述聚合酶為包含所述替換突變的9°NDNA聚合酶。優選地，所述聚合酶為包含上述突變組合的9°NDNA聚合酶。本發明還涉及包含SEQIDNO:1、3、5或21任一項所示^^酸序列、基本由上述序列組成或由上述序列組成的9。N聚合酶分子。本發明還包括僅有在物質程度上不影響該聚合酶功能的胺基酸改變中不同於SEQIDNO:l、3、5和21所示M酸序列的聚合酶。在這種情況下，所述聚合酶的相關功能定義為DNA親和力的降低，從而該聚合酶能夠在每個反應循環中將核苷酸摻入多個分開的DNA模板(與對照聚合酶比較)和/或該聚合酶能夠在每個反應循環中形成數目增加的生產性聚合酶-DNA複合物(與對照聚合酶比較)。因此，對DNA親和力降低的聚合酶變體的這種活性不重要的殘基進行保守性替換包括在本發明的範圍內。可以容易地測試其他突變對所述酶功能的影響，例如使用眾所周知的核苷酸摻入測定(如描述於WO2005/024010實施例中以及下文實施例3和實施例4中的測定)。本發明的改變聚合酶也可以直接用其DNA親和力的降低來定義，這與基本不改變的對核苷酸的保真度和親和力一起產生了與本發明聚合酶相關的優勢。因此，改變的聚合酶與DNA的解離常數(Kd)至少比未改變的對照聚合酶約高2倍、高3倍、高4倍或高5倍，或在上述範圍之間。在一個實施方案中，改變的聚合酶在鹽溶液存在時從DNA上解離，所述鹽溶液優選NaCl溶液，濃度低於或等於約500mM,優選低於500mM。所述鹽溶液可以為適當的濃度，從而可以區分本發明親和力降低的聚合酶以及與DNA結合更為緊密的未改變聚合酶。適當的鹽溶液濃度(優選NaCl)在約150mM、200mM、250mM、300mM或350mM、優選200mM的範圍內。任何適當的雙鏈DNA分子均可用於檢測所述改變是否具有降低DNA親和力的理想效果。優選地，與所述聚合酶解離的DNA分子包含SEQIDNo.:18公開的序列。優選地，至少約40%、50%、60%、70。/。等的所述聚合酶將在洗滌溶液中相關的NaCl濃度下從DNA解離。可以通過任何已知的方法進行解離實驗，例如使用詳細描述於下文實驗章節的實施例5中的洗滌測定(還可參見圖6和7)。如上所述，(優選)實現DNA親和力的降低而不顯著或嚴重降低該聚合酶與核苷酸的親和力。令人驚訝的是，儘管DNA結合親和力已降低，但本發明的改變的聚合酶還可表現出與未修飾的聚合酶相當的活性，例如就Vmax而言。本發明聚合酶所表現出的這一令人驚訝的特性顯示在本發明某些酶的動力學分析中，尤其是在下文實驗章節的實施例6及作為參考的圖8中。本發明的改變的聚合酶也可以直接就其M達所述聚合酶的宿主細胞純化的能力上的改善來定義。因此，由於所述改變的聚合酶的DNA親和力降低(這與基本不改變的對核苷酸的親和力和保真度一起形成了與本發明聚合酶相關的優勢)，所以該聚合酶可以更容易地進行純化。在所述酶的純化中遺留的宿主細胞內源DNA較少。因此，由於純化方法之後仍與所述聚合酶結合的內源DNA較少，所以得到了更純的產物。該改變的聚合酶與DNA的親和力降低的另外一個優勢是，需要較不苛刻的純化方案以提供基本上純淨的聚合酶製備物。因此，受到純化方法本身不利影響的聚合酶較少，導致聚合酶製備物具有較高水平的總體活性。另外，更均一的純化應該成為可能，導致聚合酶各批次之間的差異降低。在純化方案中內源DNA遺留的改善的代表性數據示於下文實驗章節的實施例7中。優選地，在對所述聚合酶進^f亍純化後遺留的宿主DNA為低於約60ng/ml、50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml、10ng/ml，更優選低於約5ng/ml。可以使用標準純化方案，參閱如Colley等，所o/.C&附.264:17619-17622(1989);(7w/feto/V幽Viftmy贈Vm,inM^orfs￡rt^"w/o^v，vol.182(Deutscher編輯，19卯)。因此，本發明提供了改變的聚合酶，其與DNA的親和力使得(i)該聚合酶與DNA的解離常數高出未改變的/對照聚合酶至少約為或近似為2倍、3倍、4倍或5倍；和/或(ii)當對其應用濃度為約200nM至500nM之間、優選約200nM至300nM之間的氯化鈉溶液時，至少50%、60%、70%或80%的聚合酶從與其結合的DNA上解離；和/或(iii)在M達所述聚合酶的細胞中進行純化後，低於約60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、3、1或0.5ng/ml的內源DNA保持與聚合酶結合；所述改變不對核苷酸結合親和力或保真度產生顯著的不利影響，從而該聚合酶能夠(a)在一個反應循環中形成數目增加的生產性聚合酶-DNA複合物(提高了反應完成的水平)，和/或(b)催化總體水平改善(提高/升高)的核普酸摻入；尤其是在聚合酶濃度就DNA濃度而言是限制性的條件下。本發明還涉及編碼本發明的改變聚合酶的核酸分子。對於任何給定的改變聚合酶，其為胺基酸序列已知、優選編碼該聚合酶的野生型核苷酸序列已知的聚合酶的突變體形式，可以根據分子生物學的基本原理獲得編碼該突變體的核苷酸序列。例如，假設編碼9。N聚合酶的野生型核苷酸序列已知，則可以使用標準遺傳密碼推導出編碼具有一個或多個M酸替換的任何9°N突變體形式的核苷酸序列。類似地，可以容易地得出來自A家族和B家族聚合酶的其它聚合酶突變體形式的核苷酸序列，所述其它聚合酶為例如VentTM、Pfu、TspJDF-3、Taq等。之後，可以使用本領域已知的標準分子生物學技術構建具有所需核香酸序列的核酸分子。在一個具體的實施方案中，本發明涉及編碼9°N聚合酶突變體形式的核酸分子。因此，本發明提供編碼改變的9。N聚合酶的核酸分子，該核酸分子包含SEQIDNO:2、4、6、19或20中任何核苷酸序列，或者基本上由其組成或由其組成。根據本發明，確定的核酸不僅包括相同的核酸，也包括任何孩i小的鹼基變化，具體地，包括在保守性U酸替換中由於簡併密碼而產生同義密碼子(不同的密碼子代表相同的胺基酸殘基)的替換。關於鹼基變化，術語"核酸序列"也包括任何給定單鏈序列的互補序列。有利地，本文所述的核酸分子也可以包括在適當的表達載體中，以在適當的宿主中表達其編碼的聚合酶蛋白。因此，表達載體包含SEQIDNO:2、4、6、19或20中的4壬何核苷酸序列，或者基本上由其組成或由其組成。將克隆的DNA整合到適當的表達載體中隨後用於其後轉化所述細胞以及隨後選擇轉化細胞是本領域的技術人員公知的，如Sambrook等(1989)，Molecularcloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratory申所提供。這樣的表達載體包括與調節序列如啟動子有效連接的本發明核酸，所述調節序列能夠影響所述DNA片段的表達。術語"有效連接，，指使所述組分以其預期方式發揮作用的排列。這樣的載體可以轉化進適當的宿主細胞中，從而用於表達根據本發明的蛋白質。所述核酸分子可以編碼成熟的蛋白質或具有前體序列(prosequence)的蛋白質，包括編碼前蛋白上前導序列的蛋白質，所述前導序列其後#_宿主細胞切割以形成成熟蛋白。所述載體可以是，例如質粒、病毒或噬菌體栽體，其具有複製起點和任選的用於表達所述核苷酸的啟動子以及任選的啟動子調節子。載體可以包含一個或多個選擇標記，例如抗生素抗性基因。表達所需的調節元件包括結合RNA聚合酶並且指導正確的轉錄起始水平的啟動子序列，還包括用於核糖體結合的翻譯起始序列。例如，細菌表達載體可以包括啟動子(如lac啟動子)和用於翻譯起始的Shine-Delgarno序列以;M^始密碼子AUG。類似地，真核表達載體可以包括用於RNA聚合酶II的異源或同源啟動子、下遊聚腺苷酸化信號、起始密碼子AUG以及用於核糖體分離的終止密碼子。這樣的載體可以從商業途徑獲得，或者通過本領域所7>知的方法由所述序列裝配而成。通過高等真核細胞轉錄編碼本發明聚合酶的DNA可以通過在載體中包括增強子序列進行優化。增強子是DNA順式作用元件，其作用於啟動子從而提高轉錄水平。除了選擇標記以外，栽體也通常包括複製起點。所述改變聚合酶的優選用途在另一方面中，本發明涉及根據本發明與DNA親和力降低的改變聚合酶在將核苷酸摻入多核苦酸中的用途。如上所述，所述核苷酸的性質無限制性，因為本發明的改變聚合除床持對相關核苷酸的親和力。如上所述，本發明基於如下的認識聚合酶與DNA模板的緊密結合不總是有利的特性。在每個反應循環中針對每個模板DNA分子只發生一次核苷酸摻入事件的測序反應中尤其是這樣。在許多這樣的測序反應中使用標記的核苦酸。因此，本發明提供聚合酶的用途，所述聚合酶已經改變，使其表現出降低的DNA親和力，以及為了將標記核苷酸摻入多核香酸而在每個反應循環中將標記核苷酸摻入多個分開的DNA模板中的能力，其中所述標記用於確定所添加核苷酸的性質。在一個實施方案中，所述核苷酸包含ddNTP。因此，本發明的聚合酶可以用於常規的Sanger測序反應，其詳細內容是本領域公知的。在優選的實施方案中，所述核香i^l:經修飾的核苷酸，其已在3，糖羥基處進行修飾，從而該取代物的大小比天然存在的3，羥基更大。本發明的所述聚合酶可以用於任何需要/期望能將核苷酸摻入多核苷酸鏈的任何
技術領域：
，所述核苷酸為例如在3，糖羥基位置具有比天然存在的羥基更大的取代基的修飾核苷酸。它們可以用於需要所述酶的任何期望的特性的任何
技術領域：
，所述特性為例如甚至在DNA過量存在條件下提高核普酸摻入率，以及在上述條件下提高反應的完成水平。這可以是實踐上、技術上或經濟上的優勢。雖然所述改變的聚合酶由於其與DNA親和力降低而表現出可以摻入具有大3，取代基的修飾核苷酸的期望特性，但是該酶的用途不僅限於摻入這樣的核苷酸類似物。與本領域已知的酶相比，所述改變的聚合酶由於其與DNA的親和力降低而具有的期望特性可以為摻入任何其它核苷酸提供優勢，包括未修飾的核苷酸。實際上，本發明的改變的聚合酶可用於摻入其有能力摻入的任何類型核苷酸。本發明所述的聚合酶可用於多種需要將核苷酸摻入多核苷酸的技術，所述技術包括測序反應、多核苷酸合成、核酸擴增、核酸雜交實驗、單核苷酸多態性研究以及其它這樣的技術。在測序反應中的用途代表了非常優選的實施方案。所有使用本發明的修飾聚合酶的這些用途和方法都包括在本發明的範圍內。本發明還涉及將核苷酸摻入DNA的方法，包括使以下組分相互作用(i)本發明的聚合酶；DNA模板；以及(iii)核苷酸溶液。如上所述，本發明所述的聚合酶在每個反應循環中僅需摻入單個或相對少量核普酸的反應中尤其有用。在這些反應中常常標記一個或多個核苷酸。因此，本發明提供將標記核苷酸摻入DNA的方法，包括使以下組分相互作用(i)聚合酶，經改變以使其表現出降低的DNA親和力以及在每個反應循環中將標記核苷酸摻入多個分開的DNA模板的能力；DNA模板；以及(m)核苷酸溶液。在一個具體的實施方案中，本發明提供將核苷酸摻入DNA的方法，所述核苷酸在3，糖羥基處進行修飾，從而該取代基的大小比天然存在的3，羥基更大，所述方法包括使以下組分相互作用(i)本發明的聚合酶(如上所述)；"i)DNA模板；以及(iii)含有核苷酸的核香酸溶液，所述核苷酸在3'糖羥基處進行修飾，從而該取代基的大小比天然存在的3，羥基更大。特別優選在聚簇陣列(clusteredarray)上進行的用途和方法。核酸分子的聚簇陣列可以使用本領域通常已知的技術生產。例如，WO98/44151和WO00/18957(均作為參考併入本文)都描述了核酸擴增的方法，該方法使擴增產物固定在固體支持物上，以形成了包含固定核酸分子的簇或"集落"的陣列。還參考WO2005/078130，包括其中的引用文獻，上述所有內容作為參考併入本文。在聚簇上摻入尤其是在聚蔟陣列上測序提供了特有的優勢，因為所述聚合酶能夠將核苷酸摻入位置十分接近的多個DNA模板中，因而提供高反應效率。使以上組分在允許核苷酸的5，磷睃基與DNA模板上3，游離羥基之間形成磷酸二酯鍵的條件下相互作用，由此將該核苷酸摻入多核苷酸中。優選的核苦酸包括修飾核苷酸在上文有詳細描述。所述摻入反應可以在游離溶液中進行，或者所述DNA模板可以固定在固體支持物上。突變體酶表現的核苷酸摻入率可以與未改變酶表現的核苷酸摻入率類似。由於所述^"飾酶的改進活性，由於其與DNA的親和力降低，同樣的摻入率與單個反應循環中將核苷酸摻入多個模板中能力的組合提高了總體完成率。然而，突變體酶的核苷酸摻入率不需與未改變酶的核苷酸摻入率完全相同就可以有實際用途。只要就反應完成而言總體反應效率提高，核苷酸摻入率可以低於、等於或高於未改變酶的核苷酸摻入率。在本發明的一個具體實施方案中，本發明的聚合酶可以在合成測序方案中用於將修飾核苷酸摻入多核苷酸鏈中。在所述方法的這一具體方面中，在3，糖羥基處進行修飾，從而該取代基的大小比天然存在的3，羥基更大。檢測這些核苦酸以確定DNA模板的序列。因此，另一方面中本發明提供一種DNA測序方法，該方法包括使以下組分相互作用-根據本發明的聚合酶(如上所述)；-DNA模板；以及-含有核苷酸的核苷酸溶液，所述核苷酸在3，糖羥基處進行修飾，從而該取化基的大小比天然存在的3，羥基更大，這樣其後檢測摻入的修飾核苷酸使得可以對DNA模板進行測序。用於測序反應的DNA模板一般包含具有3，游離羥基的雙鏈區域，其在測序反應中作為添加其他核苷酸的引物或起始點。待測序的DNA模板區懸掛在互補鏈的這種3，游離羥基上。具有3，游離羥基的引物可以作為與待測序模板區雜交的單獨組分加入(例如短的寡核苷酸)。或者，引物與待測模板鏈可各自形成能夠形成分子內雙鏈體的自身互補核酸鏈的一部分，例如髮夾環結構。核苷酸連續添加到3，游離羥基上，使多核苷酸鏈以5，至3，的方向合成。每添加一個核苷酸之後，所添加威基的性質即被確定，由此提供了DNA模板的序列信息。如果修飾核苷酸可以作為鏈終止子的話，就可以實現這樣的DNA測序。一旦該修飾核苷酸摻入與被測序模板區的正在延長的多核香酸鏈中，將沒有可用的游離3，-OH基團用於指導進一步的序列延伸，該聚合酶因此不能再添加核苷酸。一旦確定了摻入逐漸延長的鏈中的鹼基性質，可以去除3，阻斷從而使得可以添加下一個連續的核苷酸。通過使用這些修飾核苷酸對得到的產物進行排序，有可能推導出DNA模板的DNA序列。如果每種修飾核苷酸連接已知對應於特定威基的不同標記，以便於區分每個摻入步驟中添加的鹼基，則該反應可以在單個實驗中完成。或者，可以進行分別包含每種修飾核苷酸的分開的反應。在優選的實施方案中，修飾核苷酸帶有標記以便於其檢測。優選地，所述標記為螢光標記。每種核普酸類型可以帶有不同的螢光標記。然而，該檢測標記不需要為螢光標記。可以使用允許檢測核苷酸摻入DNA序列中的任何標記。適用於本發明的一種檢測螢光標記核苷酸的方法包括使用波長特異針對所述標記核苷酸的雷射，或使用其它適當的光源。在一個實施方案中，所述核苷酸上的標記螢光可以通過CCD相機進行檢測。如果將所述DNA模板固定在表面上，它們可以優選地固定於表面上以形成高密度陣列，優選地為如上所述的聚蔟或"集落，，陣列。在一個實施方案中，根據該申請人為本發明開發的技術，所述高密度陣列包含單分子陣列，其中在陣列上每個可檢測離散位點上有單個DNA分子。由通過光學手段可各個分辨的(individuallyresolvable)的核酸分子組成的單分子陣列以及這些陣列在測序中的用途描述於例如WO00/06770，其內容作為參考併入本文。由包括髮夾環結構的可各個分辨的核酸分子組成的單分子陣列描述於WO01/57248，其內容也作為參考併入本文中。本發明的聚合酶適於與根據WO00/06770或WO01/57248的公開內容製備的單分子陣列一起^f吏用。然而，應該理解，本發明的範圍並非意在限制於所述聚合酶與單分子陣列一起的用途。的修飾i苷酸以及改變的聚合酶來;現:互;核普酸與每個"苷酸片段的第一個鹼基配對，並隨後在所述改進的聚合酶所催化的反應中加入到引物上。去除剩餘的游離核苷酸。然後，波長特異性針對每種修飾核苷酸的雷射激發摻入的修飾核苷酸上適當的標記，引起該標記發出螢光。焚光可以通過合適的CCD相機進行檢測，該相機可以掃描整個陣列從而鑑定每個片段上摻入的修飾核苷酸。因此，有可能平行地檢測數以百萬計的位點。然後可以去除焚光。摻入的修飾核苷酸的身份表明了樣品序列中與其配對的鹼基的身份。然後可以將摻入、檢測和鑑定的循環重複約25次，從而確定附著在陣列上的每個可檢測寡核苷酸片段中的前25個威基。因此，通過對所述陣列上的所有可檢測分子同時進行測序，可以確定數以億計以單拷貝附著在所述陣列的寡核苷酸片段的前25個#。本發明顯然不僅限於測序25個^。取決於所需序列信息的詳細程度以及陣列的複雜性，可以對多得多的威基或更少的g進行測序。使用適當的生物信息學程序，可以將產生的序列與特定參照序列進行比對和比較。這允許確定任意數目的已知或未知遺傳變異，例如單核苷酸多態性(SNP)。本發明的改變聚合酶的功用不限制於使用單分子陣列進行的測序應用。該聚合酶可以與需要使用聚合酶將核普酸摻入多核苷酸鏈的任何類型基於陣列(特別是任何基於高密度陣列)的測序技術一起使用，特別是依賴摻入具有大3，取代基(比天然羥基更大)如3，阻斷基的修飾核苷酸的任何基於陣列的測序技術。本發明所述的聚合酶可以用於在基本上任何類型的陣列上進行核酸測序，所述陣列通過將核酸分子固定在固體支持物上而形成。除了單分子陣列以外，合適的陣列也包括例如多重多核苷酸(multi-polynucleotide)或聚蔟陣列，其中所述陣列上的不同區域包含一種多核苷酸分子的多個拷貝或者甚至是少量不同多核苷酸分子(例如兩條互補核酸鏈的多個拷貝)的多個拷貝。具體地，本發明聚合酶可以用於WO98/44152描述的核酸測序方法，其內容作為參考併入本文中。該國際申請描述了一種對位於固體支持物上不同位置的多個模板進行平行測序的方法。該方法依賴於將標記核苷酸摻入多核苷酸鏈。本發明的聚合酶可以用於國際申請WO00/18957描述的方法，其內容作為參考併入本文中。該申請描述了固相核酸擴增和測序的方法，其中將大量不同的核酸分子排成陣列並通過形成核酸集落以高密度同時擴增，隨後對核酸集落進^f亍測序。本發明的改變聚合酶可以用於該方法的測序步驟中。核酸分子的多重多核苷酸或聚簇陣列可以使用本領域中一般已知的技術進行合成。例如，WO98/44151和WO00/18957均描述了核酸擴增的方法，該方法4吏得擴增產物固定於固體支持物上，從而形成由固定核酸分子的簇或"集落"組成的陣列。涉及製備聚蔟陣列的以及使用該陣列作為核酸測序的模板的WO98/44151和WO00/18957內容作為參考併入本文中。根據所述方法製備的聚蔟陣列上的核酸分子為使用本發明聚合酶進行測序的合適模板。然而，本發明並非意在限於所述聚合酶在測序反應中的用途，該測序反應在根據這些特定方法製備的聚蔟陣列上進行。本發明的聚合酶還可以用於螢光原位測序方法中，如描述於Mitra等AnalyticalBiochemistry320,55-65,2003中的方法。本發明還考慮包含本發明聚合酶的試劑盒，所述聚合酶可能與適當的j吏用說明書包^fr—起。所述聚合酶將以適於使用的形式提供，例如在適當的緩衝液中提供或以能夠重建使用的形式(例如以凍幹的形式)提供。因此，提供了用於核苷酸摻入反應或測定的試劑盒，其包含本發明的聚合酶以及核苷酸溶液，所述核苷酸使得聚合酶能夠將其摻入正在延長的DNA鏈中。優選的核苷酸包括適當標記的核苷酸，例如可由此用於測序反應的核苷酸。標記可包括本領域中公知的螢光標記、放射性標記和/或質量標記。在一個優選的實施方案中，所述核苷酸溶液包舍者如ddNTP之類的合成(即非天然)的核苷酸，或基本由其組成或者由其組成。該試劑盒因此可以用於例如Sanger測序反應中。在另一個實施方案中，所述核苷酸溶液包含修飾核苷酸，或基本由其組成或者由其組成。優選的修飾核苷酸已在上文就本發明的聚合酶進行了定義，並且該描述在加以必要的^"正後也可應用於此處。在另一個實施方案中，該試劑盒也可以摻入使得核苷酸摻入反應得以進行的適當引物和/或DNA模板分子。在另一個方面中，本發明提供了用於合成本發明聚合酶的方法，包括(i)選擇聚合酶中用於誘變的殘基；(ii)根據(i)的選擇產生突變體聚合酶；(m)測定該突變體聚合酶與DNA的親和力；和(iv)如果與DNA的親和力有所降低，則測試該聚合酶在每個反應循環中形成更多生產性聚合酶-DNA複合物的能力。優選地，與核苷酸的親和力不受影響，但是如果其保持與未經4務飾聚合酶的親和力相同的數量級也可以認為是滿足條件。在一個實施方案中，該方法還包括在誘變後確保所述聚合S^持相同數量級的保真度。優選地，保真度不受影響，但是如果其保持與未經修飾聚合酶的保真度相同的數量級也可以認為是可接受的。反應循環在上文有所描述。在優選的實施方案中，聚合酶的測試包括使用合成核苷酸來確定是否形成數目增加的生產性聚合酶-DNA複合物。可以測試聚合酶的適當的核苷酸摻入測定是本領域已知的(參閱如WO2005/024010)，並且在下文實驗章節有更詳細的描述。在一個實施方案中，基於9。N的一級^J^酸序列選擇殘基。在一個實施方案中，通過預測哪些M酸會與DNA接觸來進行選擇。或者，可以選擇下述殘基預計其穩定聚合酶與DNA的相互作用，和/或可見於聚合酶的DNA結合結構域中，和/或其為鹼性的。如上文和實驗章節所述，預測可基於適當聚合酶的晶體結構(實施例1)。誘變尤其是定點誘變的方法在本領域有完善的表徵，並有市售試劑盒。因此，這些技術不再詳細討論。任何適當的技術均可以用於本發明的方法中。可以通過任何適當的方法測量與DNA親和力的降低。優選地，與原始的未改變聚合酶相比，親和力至少降低或約降低1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍等。親和力可以利用例如解離常數來衡量。在優選的實施方案中，所述聚合酶是B家族聚合酶，優選來自嗜熱古細菌，最優選為9。N聚合酶。參照以下的實驗章節和附圖可進一步理解本發明，其中圖1顯示本發明突變體酶的過表達。圖2顯示使用所述突變體酶的粗製備物進行NUNC管測定的結果。圖3顯示使用所述突變體酶進行單^摻入測定的結果。圖4進一步表現出所述突變體酶的活性。圖5顯示[DNA>[聚合酶(比例為5:1)時，對對照聚合酶(YAV)以及三種突變體酶(K705A、R713A和R743A)中的每一種進行單>5^摻入測定的時間過^E結果。圖6用所示NUNC孔的螢光影〗象顯示洗滌測定的結果。圖7也展示洗滌測定的結果，顯示各種聚合酶與DNA模板的親和力(為清^見省略了K705A的數據)。圖8展示了顯示聚合酶的動力學特徵的Michaelis曲線，其為重疊顯示。圖9展示由已修飾密碼子的克隆9基因編碼的核苷酸和^^酸序列。圖IO展示SDS-PAGE實驗的結果，將未誘導的(凝膠I)和經誘導的(凝膠I、II)培養粗裂解物中Po152(在pETll-a表達載體中表達時已修飾密碼子的克隆9基因)的3個克隆(1、2和4)與Po119(在pNEB917表達載體中表達的克隆9基因)和Po143(從pETll-a表達載體中表達的克隆9基因)的表達進行比較。縮寫MW-分子量；PM-蛋白標記；cl9-克隆9。發明詳述實驗章節實施例1-製備改變的聚合酶原理在9°N-7YAVC223S聚合酶的C端區域中引入定點突變，從而降低該酶與DNA的親和力(野生型9°N-7聚合酶具有非常高的DNA親和力，Kd=50pM;Southworth等1996.PNAS.93，5281)。使用9°N-7DNA聚合酶開放形式的晶體結構(PDB=lqht)、密切相關的DNA聚合酶RB69開放結構(PDB=lih7)以及RB69封閉形式(PDB=lig9)的能量最小化重疊比對(通過Cresset進行)作為鑑定參與DNA結合的關鍵殘基的結構模型。RB69聚合酶封閉形式的晶體結構(Franklin等2001.Cell105,657)鑑定了許多與複合的DNA形成氬鍵或靜電相互作用的殘基，直接與核苷酸鹼基或者與磷酸骨架起作用。這些殘基中很大一部分是鹼性的(Lys790、800、844、874、878和Arg806)，這與它們可能與酸性磷^J^目互作用一致。對封閉RB69結構的觀察顯示這些殘基中大多數採取朝向結合雙鏈體的取向。不存在與9。N-7聚合酶封閉形式類似的結構，所以我們使用我們的結構比對來鑑定9。N-7聚合酶開放形式中採取與RB69開放結構中鹼性殘基(上述的殘基)類似的構象的鹼性殘基。在來自RB69的6個鹼性殘基中，發現其中3個在9°N-7中具有相應鹼性殘基，它們是Arg743(RB69Lys878)、Arg713(Lys800)和Lys705(Lys844)。決定改造4個突變體酶所示殘基的丙氨酸變體(R743A、R713A和K705A)以及71位胺基酸的缺失(A71)，所述缺失去除了拇指亞結構域的a-螺旋(在9。N-7聚合酶結構中發生異常的殘基)，上述三個殘基就位於其中。i秀變和克隆使用StratageneQuikchangeXL試劑盒及其操作方案，通過PCR方法將突變引入pSV19(編碼9°N-7YAVC223Sexo-聚合酶的載體)(還參閱WO2005/024010)。使用的誘變引物R743A(SEQIDNO:9)(SEQ工DNO:10)(SEQ工DN〇11)(SEQIDNO:12)(SEQ工DNO:13)(SEQIDNO:14)(SEQIDNO:15)(SEQ工DNO:16)選擇潛在的克隆並對基因的PCR片段進行測序從而證實突變的存在。產生所有突變體的陽性克隆。過表達和培養轉化進表達菌林NovagenRosettaBlueDE3pLysS如WO2005/024010的實驗章節所述進行培養和誘導。如WO2005/024010的實驗章節所述進行收穫和裂解。如WO2005/024010的實驗章節所述進行純化。正向反向正向反向正向反向正向反向5'-CCCGGCGGTGGAGGCGiVTTCTAAAAGCC-3'3'-GGGCCGCCACCTCCGCTAAGATTTTCGG-5'R713A5'-GAAGGATAGGCGACGCGGCGATTCCAGCTG-3'3'-CTTCCTATCCGCTGCGCCGCTAAGGTCGAC-5K705A5'-GCTACATCGTCCTAGCGGGCTCTGGAAGG-3'3'-CGATGTAGCAGGATCGCCCGAGACCTTCC-5'A71(C端704)5'-GCTACATCGTCCTATGAGGCTCTGGAAGG-3'3'-CGATGTAGCAGGATACTCCGAGACCTTCC-5'結果實現了突變體酶成功的過表達。過表達了所有突變體酶。對SDS-PAGE凝膠進行電泳以檢查所述構建體的過表達(--未謙導的；+-IPTG誘導的)。得到的^示於圖1。實施例2-使用粗蛋白製備物進行NUNC管測定。如WO2005/024010中所述，對突變體酶的5ml小培養物(同時使用YAVC223Sexo-培養物用作直接比較)進行快速純化直至熱處理步驟。此時，認為該樣品足夠純淨可以測試其活性。使用S300凝膠過濾離心柱將每種粗製備物的緩衝液更換為酶學緩沖液(50mMTrispH8.0、6mMMgS04、1mMEDTA、0.05%Tween20)。該樣品M濃度進行歸一化。所使用的測試為簡單地將ffTTP摻入表面偶聯A模板髮夾。根據產品說明書，將2皮摩的5，-氨基寡聚物815(L"■CGA'rCACGATCACGA:'CACG'A'丄'CACGATCACGU,CACGCTGA丁'GTGCA7GCG'rGTTTTTTTAG，HCATGCACATCAGCG、'V)工i;NO:/"與NUNC-nucleolink膠條偶聯。洗滌後，將每個孔與20^等分試樣的粗酶製備物(以下列出酶的性質)以及5ffT-N3-647—起孵育。接著將膠條在45。C醉育30分鐘。該實驗以一式兩份進行。孵育30分鐘完成後，用3x100pl高鹽洗滌緩衝液(10mMTrispH8.0,、1MNaCl、10mMEDTA)以及其後3x100pl的MiiliQ水洗滌小孔。在typhoon焚光成像儀(CY5濾光器，PMT=450V)上對膠條進行掃描。該結果示於圖2，其中孔如下所示1=僅為20nl酶學緩沖液+1nl100|LiMf汀-N3-6472=20pl粗YAVC223Sexo-+1pl100ffT-N3-6473=20nl粗YAVC223SR743Aexo國(克隆12)+1pl100ffT-N3誦6474=20jil粗YAVC223SK705Aexo-(克隆15)+1pl100pMf汀-N3-6475=20nl粗YAVC223SR743Aexo-(克隆16)+1pl100pMffT-N3誦6476=20pi粗YAVC223SR713Aexo-(克隆24)+1pl100ffT-N3-6477=20nl粗YAVC223SA71exo-(克隆38)+1nl100pMffT-N3-6478=20nl粗YAVC223SR713Aexo-(克隆39)+1pl100,ffT-N3-647結果除了背景孔(只有MilliQ)和孔1(不含酶的對照)以外，在所有的孔中均觀察到酶學反應。螢光強度與摻入f汀TP的量成正比——孔越暗，摻入水平越高。相對於YAV(克隆9)(YAVC223Sexo-)描述突變體酶的作用。缺失拇指亞結構域的尖部(A71突變體)得到催化作用嚴重受損的酶，並且僅摻入克隆935%的水平。突變體K705A與克隆9等價。兩種精氨酸突變體R743A和R713A顯示摻入水平的提高，表現出對克隆9約45%的提高。結論突變體酶K705A、R713A和R743A表現出摻入水平的提高以及酶與DNA親和力的降低。去除所有這三個鹼性殘基與缺失其他殘基的組合破壞其活性U71突變體)。可能在不存在其他突變/缺失時，全部替換這三個殘基不會導致活性的降低。實施例3-單g摻入測定使用描述於WO2005/024010的單4^&摻入測定對粗酶製備物(歸一化的濃度)的活性進行測量。在2nMf汀-N3-cy3和20nM10A髮夾DNA("P-標記的)存在下，用30或3pg/ml粗酶製備物孵育10分鐘，在0、30、60、180和600秒取出反應混合物的等分試樣並在12%丙烯醯胺皿上電泳。結果凝膠圖象顯示於圖3。使用Imagequant對條帶強度進行定量，螢光強度對孵育時間作圖產生示於圖4的時間過程。這些數據給出了對突變體酶相對於YAV的ffTTP第一個g摻入性能的估計。由於濃度的歸一化，所述活性可直接比較。A71突變體基本無活性(kobs為YAV所觀察到的21%)，R743A和K705A具有與YAV相當的活性，但R713A顯示出kobs(2倍於YAV所觀察到的)和循環完成水平的顯著提高。實施例4-在DNAl高於f聚合酶l的條件下用於純化的聚合酶的單鹼基摻入測定。使用描述於WO2005/024010的單>5^摻入測定對克隆9聚合酶(YAVC223Sexo-)以及拇指亞結構域突變體K705A、R713A和R743A的純化酶製備物的活性進行測量。該實驗在DNA和聚合酶各自的濃度比約為5:1時進行。因此，研究了所述酶在單個反應循環中將核苦酸摻入多個DNA模板分子的能力。在20nM10A髮夾DNA("P-標記的)和2nMf汀-N3-cy3存在下用4nM純化的酶孵育30分鐘，在0、15、30、60、180、480、卯0和1800秒間隔時取出該反應混合物的等分試樣並在12%丙烯醯胺凝膠上電泳。結杲使用Imagequant對條帶強度進行定量，轉換為完成百分比(基於凝膠上起始材料和終產物條帶的相對強度)的螢光強度對孵育時間作圖得到的時間過程示於圖5。克隆9和K705A的時間過程曲線的性質是二相性的，顯示為最初的指數"激增"期(黑線)和之後產物隨時間轉換的線性依賴性(灰線)。K705A激增期的幅度比克隆9更高(分別為~28%和19%)，並且K705A的線性期的梯度比克隆9的更陡(因此更快)。這一觀察的重要性將在下文討論。與此相反，R713A和R743A突變體酶並不顯示這種二相性性質，取而代之地，只觀察到快速指數期。在這兩種情況中指數期的幅度均為90%，表明指數期中的產物轉換程度比克隆9或K705A更高。激增期等同於反應起始前聚合酶相關DNA分子群的f汀TP摻入率，即聚合酶:DNA:ffTTP三元複合物可以轉換的最高速率。任何隨後的時期都歸因於較慢的解離/再結合過程，該過程是所述聚合酶分離新底物分子(DNA和ffTTP)所需要的。所》見察到的克隆9和K705A的二相性性質提示，較慢的激增後期是由酶與DNA解離和再結合的困難程度造成的，很可能是由於其較低的Kd(DNA)。突變在與聚合酶結合時可以接觸雙鏈體DNA的鹼性殘基(即R713和R743)以消除該功能性產生僅顯示突發動力學的突變體酶(R713A和R743A)。我們用兩種方法中的一種來解釋這一點i)通過降低與DNA的親和力(提高Kd(DNA))來提高酶與DNA解離和再結合的能力，和/或ii)在這些突變體中DNA親和力的降低導致聚合酶製備物中出現大的"活性酶"級分。已顯示不純的DNA聚合酶(由裂解中保留的大腸桿菌基因組DNA汙染)通過減少製備物中的活性酶級分而抑制酶。所述時間過程的粗擬合提示，所觀察到的克隆9和K705A的激增期的速率常數相當(kobs0.06s-l)，而R713A(kobs~0.01s-l)和R743A(kobs~0.004s-l)的速率常數較小。在這些實驗條件下，克隆9和K705A的激增比R713A或R743A的激增更快，但是由於缺乏克隆9和K705A固有的較慢並且線性的解離/再結合期，所以後兩種酶在較短的時間內完成反應。實施例5-洗滌測定使用洗滌測定定性評估純化的酶製備物與DNA的親和力。根據生產商的方案，用2皮摩的5，-氨基A-模板髮夾寡聚物815(5'H2Nf-TTTACAACAGCATGCACATCAGCG-3')(SEQIDNO:18)對<4(1x8)個NUNCnucleolink膠條進行功能化。洗滌後，將每個孔與20nl等分試樣的500nM酶(克隆9、K705A、R713A或R743A突變體)在45。C孵育30分鐘。孵育後，用包括不同濃度NaCl(O、0.05、0.1、0.3、0.4、0.75、1.0、2.0M)的3x100ml10mMTrispH8.0，10mMEDTA對每個孔進行洗滌，然後用3x100mlMilliQ水進行洗滌。隨後，用酶學緩衝液將孔預平衡，之後再次與20jil的2nMf汀-N3-647在45。C孵育30分鐘。用3x100ml的高鹽洗滌緩鬥液(10mMTrispH8.0，1MNaCl,10mMEDTA)對孔進行洗滌，然後用3x100mlMilliQ水進行洗滌。在Typhoon螢光成像儀上掃描膠條(y5濾光器，PMT=500V)。結果NUNC孔的螢光圖像顯示於圖6。孔中的任何螢光都是由於洗滌後與表面偶聯DNA結合的殘餘酶。提高孵育之間洗滌緩衝液的離子強度會通過遮蔽靜電相互作用而使聚合酶和DNA之間的相互作用不穩定。在更高的離子強度下，酶會更加高效地從DNA上洗脫。當在孵育之間使用低離子強度洗滌時，所有測試酶都顯示出高水平的摻入，因此酶從DNA解離的效率較低。隨著洗滌緩沖液中NaCl濃度的提高，酶的表現相對於彼此來說有所變化。[NaCl<200mM時，突變體酶R713A和R743A更有效地從DNA上移除，而K705A和克隆9表現出彼此相似的反應，需要較高的[NaCl]使它們從DNA上移除。即使在用2MNaCl洗滌後，克隆9仍觀察到相對於0MNaCl洗滌來說顯著水平(約75%)的摻入。這在圖7所示曲線中有清楚的展示(為了清M見，K705A的數據已被省略)。有趣的是，測試酶在經歷了2MNaCl洗滌後似乎無一從DNA上完全移除。從該實驗很明顯看出，對殘基R713和R743進行突變得到顯示低於克隆9的DNA親和力的酶，證據為它們被較低離子強度的洗滌從DNA洗脫的能力。實施例6-克隆9、R713A和R743A的f汀-N3-cv3摻入動力學使用NUNC管測定對所述酶進行動力學表徵，包括在各種[ffNTP下測量[DNA<<[聚合酶l或[ffNTP時f汀N3cy3的一階(firstorder)摻入率常數。以下描述測試這三種聚合酶所使用的方法。根據生產商的方案，用2皮摩的5，-氨基A模板髮夾寡聚物815formulaseeoriginaldocumentpage38個(1x8)NUNCnucleolink膠條進行功能化。在特定的[f汀-N3-cy3下，使用每個膠條進行時間過程實驗。在45。C下在每個NUNC孑L中將20jil的酶學緩沖液(50mMTrispH8.0,6mMMgS04，1mMEDTA,0.05%Tween20)孵育2分鐘。使用8-通道多道移液器通過加入在45。C預平衡2分鐘的20jil等分試樣2x酶學混合物(XnMf汀-N3-cy3,酶學緩沖液中1.1jiM聚合酶)來起始時間過程，從而各個孔在相同的時間點開始反應。向孔中的緩沖液加入2x酶學混合物足以產生適當的混合。通it^p入125jil250mMEDTA4吏反應終止在所需的時間點。在所有8個孔中的反應均終止後，用3xl00ml高鹽洗滌液(10mMTrispH8.0，1MNaCl,10mMEDTA)對膠條進行洗滌，之後用3xl00mlMilliQ水進行洗滌，然後在Typhoon螢光成4象儀(Cy3濾光器，PMT=500V)上進行掃描。使用Imagequant對每個孔中的焚光強度進行定量。將Cy3螢光強度的變化對時間作圖得到時間過程圖。在我們的實驗條件下，這些時間過程圖將孔評價為單指數式衰減過程(擬合於方程y=yo+Aexp(x/t))，由此可以確定反應的半衰期t，其倒數稱為，見察速率常數knobs(kobs=1/t)。觀察速率常數的大小取決於f汀-N3-cy3的濃度，因此通過在不同f汀-N3-cy3濃度下重複該實驗可以確定特定酶的knobs值範圍。根據標準酶學分4斤，knobs隨f汀-N3-cy3濃度的變化為雙曲線形，並與Michealis-Menten方程Vmax=(kpolx[Sl)/(Kd+[Sl)擬合良好，這裡S=f汀N3-cy3。從Michaelis曲線可以獲得特定酶催化特定反應的特徵性關鍵值，即kpol(定義為底物濃度無限大時該過程的速率常數)和Kd(定義為底物濃度為kpo1/2時的解離常數)。對克隆9、R713A和R743A突變體重複該過程。所有酶的Michaelis曲線在圖8中重疊顯示。結果tableseeoriginaldocumentpage39從該結果看來，似乎聚合酶DNA結合區的突變不會對酶的活性(在高底物濃度時，kpol接近Vmax)或酶對完整功能核苷酸(在該情況中為f汀-N3-cy3,但是認為趨勢是適用於所有威基)的親和力產生不利影響。這是理想的情形，因為該突變具有〗務飾酶的DNA結合親和力而不影響其它關鍵催化特性的理想效果。實施例7-純化聚合酶和測量遺留DNA的水平。DNA汙染Pico綠測定(MolecularProbes試劑盒，目錄號P11496)所需溶液TE緩衝液lOmMTris.HClpH7.5lmMEDTA需要40mL，將2mL20xTE緩衝液加入38mLH20中入DNA溶液1(2ng/mLXDNA)用735pL的1xTE緩衝液稀釋15jiLXDNA。tableseeoriginaldocumentpage40將2x500nL每個樣品放入2個eppendorf管中。製備picogreen溶液；將85的picogreen原^p入17mL1xTE緩衝液中。將500nL該溶液加入每個標準曲線和酶樣品中，並使用移液器充分混合，然後將所有的樣品轉移到1.5mL焚光計比色杯中。使用螢光計使用CaryEclipse文件的高級讀取程序。將Xfci光設置為480nm，並且X發射光設置為520nm，並使用1000伏特。分析將標準曲線的數據輸入GraphpadPrism，與方程式y=ax+c的標準曲線擬合。之後測定濃度值x。tableseeoriginaldocumentpage41從該實驗可見，很明顯所述聚合酶中的改變增強了酶的純化，因為在純化中遺留了較少的內源DNA。如上所述，內源DNA的遺留可對酶的活性產生負影像，因此該突變很明顯是有利的。實施例8—製備編碼克隆9聚合酶的經修飾優化了密碼子使用的核酸序列。使用每個密碼子上編碼所需的/理想的胺基酸的最佳核酸序列將SEQIDNO1中顯示的^J^,列翻譯成核,列。推導出的核*列示於SEQIDN0.19。在類似的情況中，基於SEQIDNO:21所示的聚合酶序列推導出SEQIDNO:20所示的核酸序列。具有SEQIDNO:21所示^J^酸序列的聚合酶包含R743A突變，並且還帶有141位和143位殘基均替換為絲氨酸的突變。包含各個核苷酸和M酸序列的核酸分子和蛋白質組成了本發明的一部分。利用Ndel-NheI位點(以保留內部的BamHI位點)將克隆9的已修飾密碼子基因克隆進表達載體PETll-a合成克隆9的密碼子優化基因由GENEART合成SEQIDNO19的核酸序列並以pPCR—Script提供。確認DNA和蛋白質的序列(結果未顯示)。將pSV57(pPCRScript載體中克隆9的已修飾密碼子基因)克隆進pETll-a(下文稱為pSV52)製備pETll-a載體用NdeI和NheI消化pETll-a載體(Novagen目錄號69436-3),去磷酸化，並使用標準技術連接任何未消化的載體。使用Qiagen⑧的MinElute⑧凝膠提取試劑盒在0.8y。瓊脂糖凝膠上純化經消化的載體。使用聚丙烯醯胺TB4-20%凝膠對經消化和純化的pETll-a載體進行定量。製備插入片段(克隆9的已修飾密碼子基因)用NdeI和Nhe消化pPCRSCript載體中GENEART合成的克隆9的已修飾密碼子基因(下文稱為pSV57)。使用來自Qiagen的MinElute⑧凝膠提取試劑盒在0.8%瓊脂糖凝膠上純化經消化的插入片段。使用聚丙烯醯胺TB4-20%凝膠對經消化和純化的插入片段進行定量。連接使用Quick連接試劑盒(NEB,M2200S)在NdeI和NheI限制性位點處將pETll-a載體和插入片段進行連接(比例1:3)。轉化使用2nl連接混合物轉化XL10-gold超級感受態細胞(Stratagene目錄號200315)。PCR篩選含有所述插入片段的克隆。挑取轉化林，並製備3個用連接產物轉化的XL10-gold陽性克隆的DNA微量製備物。在克隆位點處對這三種經純化的質粒(下文稱為pSV52，克隆l、2和4)進行測序，並發現所有這三個克隆在克隆位點處都具有正確的序列。所述微量製備物還用於轉化如下所述的表達大腸桿菌宿主BL21畫CodonPlus(DE3)-RIL(Stratagene目錄號230245)。Southern印跡對pVent(pNEB917來源的載體)、pSV43(pETlla中的克隆9)、pSV54(pETll-a中的密碼子優化克隆)和pSV57(GENEART提供的pPCR-Script中的已修飾密碼子基因)進行限制性酶切和Southern印跡以檢查基因間的交叉雜交(結果未顯示)。Pol52的表達研究將pSV52(克隆1、2和4)轉化進表達宿主大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)RIL(Stratagene目錄號230245)中。按照生產商的說明書，使用21-25ng純化的pSV52質粒DNA(克隆1、2和4)轉化表達宿主大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)ML(下文稱為RIL)的感受態細胞。將50nl每種轉化產物鋪在含有100fig/ml羧千青黴素和34ng/ml氯黴素的新鮮Luria-Bertani(LB)瓊脂培^基(LBCC瓊脂培養基)上，並在37。C下孵育過夜。將以下的甘油儲液也鋪在LBCC瓊脂板上用作表達研究的對照，並於37r:孵育過夜。SOL10204:RIL-pSV19(pNEB917載體中的克隆9)SOL10354:RIL-pSV43(pETll-a載體中的克隆9)。生產表達Po152和克隆9陽性對照的細胞沉澱使用單個轉化大腸桿菌克隆接種培養管中的3mlLBCC起始培養基，並在37°C下搖動(225rpm)孵育過夜。將起始培養物1/100稀釋到無菌開口錐形瓶中的50mlLBCC培養基中，並在37。C下劇烈搖動(300rpm)孵育約4小時，直至OD,肌約為1.0。取出10ml未誘導的培養物並收集細胞(如下所述)。加入IPTG至終濃度為lmM，並於37。C劇烈搖動(300rpm)誘導培養物2小時取出10ml經誘導的培養物並如下收集細胞通過在4。C下以5000xg離心30分鐘來收集經i秀導的和未^秀導的細胞。洗滌細胞沉澱並重懸於1/10培養物體積的1x砩酸緩沖鹽水(PBS)中，並按上文進行離心。輕輕倒出上清液，並將沉澱保存在-20。C直至其需要用於細胞裂解以及純化步驟。Pol52和克隆9的細胞裂解和粗純化將所述沉澱解凍並重懸於1/50培養物體積的lx洗滌緩沖液(50mMTris-HClpH7.9，50mM葡萄糖，lmMEDTA)中並在室溫下孵育15分鐘，所示洗滌緩衝液含有新加入1x緩沖液中的4mg/ml溶菌酶。在細胞中加入含有0.5%(重量/體積)TergitolNP-40和1x"完全不含EDTA的，，蛋白酶抑制劑混合物(二者均新加進1x裂解緩衝液中)的等體積1x裂解緩沖液(10mMTris-HClpH7.9，50mMKC1，lmMEDTA，0.5%(w/v)Tween20),輕柔混合細胞並在室溫下孵育30分鐘。將細胞在水浴中以80。C加熱1小時，然後在4'C下以38,800xg離心30分鐘以去除細胞碎片和變性蛋白質。製備本積歸一化的樣品和SDS-PAGE分析通過在考馬斯藍染色後分析SDS-PAGE上未誘導和"i秀導對照樣品的粗裂解物來評估Pol52和克隆9DNA聚合酶的表達。^f子細地移出上清液，通過加入50:50(體積/體積)的1x洗滌緩衝液和1x裂解緩沖液來對樣品體積進行歸一化，終體積為370nl。製備用於凝膠I的樣品將10^歸一化粗裂解物(來自未誘導和誘導的樣品)與10jil含有143mMDTT的加樣緩沖液混合。製備用於凝膠II的樣品來自經誘導樣品的歸一化粗裂解物僅用蒸餾7K稀釋1/10至終體積為10pl，並將其與10nl含有143mMDTT的加樣緩衝液混合。將所有的樣品在70。C加熱10分鐘。SDS-PAGE根據生產商的說明製備NuPage4-12%Bis-Tris凝膠(Invitrogen目錄號NP0321BOX)。將10jilSeeBluePlus2預染蛋白標準品(Invitrogen目錄號LC5925)和jil每種樣品進行加樣，凝膠以恆定的200V電泳50分鐘。用考馬斯藍(SimplyBlueTMSafestain,Invitrogen,目錄號LC6060)將皿染色。結果SDS-PAGE的結果顯示於圖10。該實驗中估計的表達水平為20mg/L培養物。與相同細胞中使用pNEB917(Po119)或pETll(Pol43)表達載體的克隆9未修飾基因相比，使用表達載體pETll-a獲得了大腸桿菌宿主BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(Po152)中克隆9已修飾密碼子的基因相似的表達水平。Po152的3個不同克隆的表達7JC平^^見察到顯著差異。參考文獻CrystalstructureofabacteriophageT7DNAreplicationcomplexat2.2Aresolution,Doublie等1998.Nature391，251.FunctionoftheC-terminusofPhi29DNApolymeraseinDNAandterminalproteinbinding.Truniger等2004.NucleicAcidsResearch32,371.A姆指subdomainmutantofthelargefragmentofEscherichiacoliDNApolymeraseIwithreducedDNAbindingaffinity,processivityandframeshiftfidelity.Minnick等1996.J.Biol.Chem.,271.24954.IdentificationofresiduescriticalforthepolymeraseactivityoftheKlenowfragmentofDNApolymeraseIfromEscherichiacoli.Polesky等1990.J.Biol.Chem.,265,14579.CloningofthermostableDNApolymerasesfromhyperthermophilicmarinearchaeawithemphasisonThermococcussp.9°N-7andmutationsaffecting3，-5'exonucleaseactivity.Southworth等1996.PNAS.93，5281StructureofthereplicatingcomplexofapolalphafamilyDNApolymerase.Franklin等2001.Cell105，657.CrystalstructureofapolalphafamilyDNApolymerasefromthehyperthermophilicarchaeonThermococcussp.9QN-7.Rodriguez等2000.J.Mol.Biol"299,471.權利要求1.改變的聚合酶，其與DNA的親和力降低，從而使所述聚合酶與對照聚合酶相比能夠在每個反應循環中將核苷酸摻入多個分開的DNA模板中。2.改變的聚合酶，其與DNA的親和力降低，從而使所述聚合酶與對照聚合酶相比能夠在每個反應循環中形成數目增加的生產性聚合酶-DNA複合物。3.權利要求1或權利要求2的聚合酶，其中對照聚合酶與所述聚合酶的類型相同。4.權利要求l至3中任一項的聚合酶，其中所述對照聚合酶包含功能等價於9°NDNA聚合酶^^酸序列中Leu408Tyr、Tyr409Ala和Pro410Val的替換突變。5.權利要求4的聚合酶，其中所述對照聚合酶還包含功能等價於9。NDNA聚合酶M酸序列中Cys223Ser的替換突變。6.權利要求4或5的聚合酶，其中所^f照聚合酶為9。NDNA聚合酵。7.前述任一權利要求的聚合酶，其中所述改變包含所述聚合酶中殘基的至少一個突變，所述殘J^I定該聚合酶與DNA的相互作用。8.前述任一權利要求的聚合酶，其中所述改變包含所述聚合酶中殘基的至少一個突變，所述殘基與DNA結合。9.前述任一權利要求的聚合酶，其中所述改變包含所述聚合酶DNA結合結構域中殘基的至少一個突變。10.前述任一權利要求的聚合酶，其中所述改變包含所述聚合酶中鹼性胺基酸殘基的至少一個突變。11.前述任一權利要求的聚合酶，其中所述改變包含至少一個替換突變。12.權利要求ll的聚合酶，其包含兩個替換突變。13.前述任一權利要求的聚合酶，其中所述聚合酶為DNA聚合酶。14.根據權利要求13的聚合酶，其中所述DNA聚合酶為B家族類型DNA聚合酶。15.根據權利要求14的聚合酶，所述聚合酶選自任何B家族古細菌DNA聚合酶、人DNA聚合酶a或T4、RB69和(j)29噬菌體DNA聚合酶。16.根據權利要求15的B家族古細菌DNA聚合酶，其選自Vent、DeepVent、9°N和Pfu聚合酶。17.根據權利要求16的聚合酶，其中所述B家族古細菌DNA聚合酶為9°N聚合酶。18.根據前述任一權利要求的聚合酶，其中所述聚合酶與核苦酸的親和力和/或該聚合酶的保真復基本不受所述改變的影響。19.根據前述任一權利要求的聚合酶，其在功能等價於9。NDNA聚合酶^J^酸序列中Lys705、Arg713和/或Arg743的位置上包含一個、兩個或三個替換為不同胺基酸的M酸替換突變。20.改變的聚合酶，其在功能等價於9。NDNA聚合酶M紗列中Lys705、Arg713和/或Arg743的位置上包含一個、兩個或三個替換為不同胺基酸的M酸替換突變。21.根據權利要求20的聚合酶，其在功能等價於9。NDNA聚合酶胺基酸序列中Arg713或Arg743的位置上包含至少一個替換為不同胺基酸的胺基酸替換突變。22.前述任一權利要求的改變聚合酶，其在功能等價於9。NDNA聚合酶^JJ^f列中Arg606和/或His679的位置上包含一個或兩個替換為不同氣基酸的氛基酸替換突變。23.改變的聚合酶，其在功能等價於9。NDNA聚合酶M酸序列中Arg606和/或His679的位置上包含一個或兩個替換為不同胺基酸的胺基酸替換突變。24.改變的聚合酶，其在功能等價於RB69DNA聚合酶^酸序列中Lys790、Lys800、Arg806、Lys844、Lys874和/或Lys878的位置上包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個替換為不同胺基酸的^酸替換突變。25.根據權利要求19至24中任一項的聚合酶，其中所述替換突變將被替換的胺基酸轉換為非鹼性胺基酸。26.根據權利要求25的聚合酶，其中所述替換突變將被替換胺基酸轉換為選自以下的胺基酸W酸性胺基酸，(ii)芳族胺基酸，尤其是酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F);和(iii)非極性胺基酸，尤其是丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或曱石危氨酸(M)。27.根據權利要求26的聚合酶，其中所述替換突變將被替換胺基酸轉換為丙氨酸。28.改變的聚合酶，其包含功能等價於9。NDNA聚合酶M酸序列中Lys705Ala和/或Arg713Ala和/或Arg743Ala的替換突變。29.權利要求28所述改變的聚合酶，其包含功能等價於Arg713Ala的絲酸替換。30.權利要求28或29所述改變的聚合酶，其包含功能等價於Arg743Ala的^J^酸替換。31.前述任一權利要求所述改變的聚合酶，還在功能等價於9。NDNA聚合酶^J^酸序列中Leu408和/或Tyr409和/或Pro410的位置上包含一個或多個氛基酸替換突變。32.權利要求31所述改變的聚合酶，其包含功能等價於9。NDNA聚合酶^J^酸序列中Leu408Tyr、Tyr409Ala和Pro410Val的替換突變。33.先前任一權利要求所述改變的聚合酶，還在功能等價於9。NDNA聚合酶Jl&^列中Cys223的位置上包含替換為不同M酸的替換突變。34.權利要求33所述改變的聚合酶，其中所述聚合酶包含功能等價於9°N聚合酶M酸序列中Cys223Ser的替換突變。35.改變的9。N聚合酶，其包含SEQIDNO:1、3、5或21中任一胺基酸序列。36.核酸分子，其編碼前a利要求中任一項所述改變的聚合酶。37.根據權利要求36的核酸分子，其編碼改變的9。N聚合酶，所述核酸分子包含SEQIDNO:2、4或6的核苷酸序列。38.包含SEQIDNO.19或20的核苦酸序列的核酸分子。39.表達栽體，其包含權利要求36至38中任一項的核酸分子。40.包含權利要求39所述栽體的宿主細胞。41.聚合酶用於將標記核苷酸摻入多核苷酸的用途，所述聚合酶已被改變以顯示降低的DNA親和力，從而使該聚合酶能夠在每個反應循環中將標記核苷酸摻入多個分開的DNA模板中，所述標記用於確定加入的核苷酸的性質。42.權利要求1至35中任一項的聚合酶用於將核苷酸摻入多核苦酸的用途。43.根據權利要求41或42的用途，其中所述摻入發生在聚蔟陣列上。44.將標記核苷酸摻入DNA的方法，包括使以下組分相互作用(i)聚合酶，其已被改變以顯示降低的DNA親和力，從而使該聚合酶能夠在每個反應循環中將標記核苷酸摻入多個分開的DNA模板中；(ii)DNA模板；和(m)核苷酸溶液。45.將核苷酸摻入DNA的方法，包括使以下組分相互作用(i)根據權利要求1至35中任一項的聚合酶；(ii)DNA模板；和(iii)核苷酸溶液。46.根據權利要求44或45的方法，其中所述DNA模板包含聚蔟陣列。47.用於進行核苷酸摻入反應的試劑盒，其包含權利要求1至36任一項中所述聚合酶和核苷酸溶液。48.權利要求47的試劑盒，其中所述核苷酸溶液包含標記核苷酸。49.權利要求47或48的試劑盒，其中所述核苷酸包含合成核苷酸。50.權利要求47至49中任一項的試劑盒，其中所述核苷酸包含修飾的核苷酸。51.權利要求50所述的試劑盒，其中所述核苷酸已在3，糖羥基處進行了修飾，以使取代基在大小上大於天然存在的3，羥基。52.根據權利要求51的試劑盒，其中所述已在3'糖羥基處進行修飾以使取4^在大小上大於天然存在3，羥基的核苷酸包^^飾的核苷酸或核苷分子，所述修飾的核苷酸或核苷分子包含嘌呤或嘧咬威基以及具有與其共價連接的可去除3'-OH阻斷基的核糖或脫氧核糖糖部分，從而使3，碳原子與以下結構的基團連接formulaseeoriginaldocumentpage6其中Z代表C(R，)2誦OR"、-C(R，)2-N(R，，)2、-C(R，)2-N(H)R"、-C(R，)2-S-R"和-C(R，)2-F中的任何一種，其中每個R"為可去除保護基團或其一部分；每個R，獨立地為氫原子、烷基、取代烷基、芳基垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、醯基、氰基、烷氣基、芳氧基、雜芳氡基或M，或者通過連接基團連接的檢測標記；或者(R，)2代表式為^C(R，，，)2的亞烷基，其中每個R"，可以是相同或不同的，並選自氫、滷素原子和烷基；以及其中所述分子可以反應生成中間體，其中每個R"交換為H,或者當Z為-C(R，)2-F時F交換為OH、SH或NH2，優選OH，所述中間體在水性M下發生解離，從而提供帶有游離3，OH的分子；其條件為當Z為-C(R，)2-S-R"時，兩個R，基團不全是H。53.根據權利要求52的試劑盒，其中所述修飾的核普酸或核苦的R，為烷基或取代烷基。54.根據權利要求53的試劑盒，其中所述修飾的核苷酸或核苷的-Z為式-C(R，)2-N3。55.根據權利要求54的試劑盒，其中Z為疊氮曱基。56.根據權利要求51的試劑盒，其中所述已在3，糖羥基處進行修飾以使取代基在大小上大於天然存在3，羥基的核香酸已被標記，以允許進行檢測。57.根據權利要求51的試劑盒，其中所述已在3，糖羥基處進行修飾以使取代基在大小上大於天然存在3，羥基的核苷酸包含^通過可切割連接子與檢測標記連接的核苦酸或核苷，其特徵在於所述可切割連接子含有選自以下的部分(其中X選自包括以下的集合O、S、NH和NQ，其中Q為Cw。的取代或未取代烷基，Y選自O、S、NH和N(烯丙基)，T為氫或d.1{)的取代或未取代烷基，*表示所述部分與核苷酸或核苷的其它部分相連的位置)。58.根據權利要求57的試劑盒，其中所述檢測標記包括螢光標記。59.才艮據權利要求47至58中任一項的試劑盒，其還包含一種或多種DNA模板分子和/或引物。60.權利要求1至35中任一項所述聚合酶的生產方法，包括(i)選擇聚合酶中用於誘變的適當殘基；(ii)根據(i)的選擇產生突變體聚合酶；(iii)檢測所述突變體聚合酶與DNA的親和力；和(iv)如果與DNA的親和力降低，則檢測所述聚合酶在每個反應循環中形成數目增加的生產性聚合酶-DNA複合物的能力。61.上文參考附圖描述的改變的聚合酶。62.上文參考附圖描述的用途。63.上文參考附圖描述的摻入核苷酸的方法。64.上文參考附圖描述的試劑盒。65.上文參考附圖描述的聚合酶的生產方法。全文摘要經修飾的DNA聚合酶對DNA具有親和力，使得所述聚合酶能夠在每個反應循環中將一個或多個核苷酸摻入多個分開的DNA模板中。所述聚合酶能夠在每個反應循環中形成數目增加的生產性聚合酶-DNA複合物。所述經修飾的聚合酶可以用於許多DNA測序應用中，尤其是在聚簇陣列中。文檔編號C12N9/12GK101180390SQ200680016045公開日2008年5月14日申請日期2006年5月10日優先權日2005年5月10日發明者尚卡爾·巴拉蘇布拉馬尼亞姆,託拜厄斯·威廉·巴爾·奧斯特,拉克爾·馬裡亞·桑切斯,傑弗裡·保羅·史密斯,羅伯託·裡加蒂申請人:索萊克薩有限公司