雞骨骼肌表達序列標籤基因晶片的製備方法

2023-05-30 02:16:21

專利名稱：雞骨骼肌表達序列標籤基因晶片的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及利用雞的骨骼肌表達序列標籤構成的cDNA晶片的製備方法。
背景技術：
生物基因組中可轉錄表達的序列(即基因)僅佔總序列的3-5％，對這部分序列進行測定，將直接導致新基因的發現，並獲取基因組中與產業化關係最為密切的信息。早在人類基因組計劃的實施中，美國國立衛生研究院生物學家Venter JC於1991年提出了發現表達基因的新戰略，即用EST克隆和定位新基因，這一構想的具體過程是將mRNA在體外反轉錄成cDNA後克隆到Vector上構建cDNA文庫，再從cDNA文庫中大規模隨機挑取cDNA克隆，對其3』或5』進行一次測序獲得EST。這使基因克隆和定位新基因發生了革命性的變革。目前，通過資料庫查詢，cDNA文庫連接測序，mRNA差別顯示，代表性差示分析和抑制差減等方法獲得的EST數據有數百萬之多，並且以每月十萬的速度增長。
表達序列標籤就是一段cDNA，具體就是將mRNA在體外反轉錄成cDNA後克隆到載體上，構建cDNA文庫，再從cDNA文庫中大規模挑取cDNA克隆，對其3′端或5′端進行一步法測序(Single-run sequencing)獲得EST。簡單說EST是一段長約150-500bp的基因表達的外顯子序列片段。EST要求大於150bp，是因為如果小於這個值，那麼EST的5′端將可能不包含ORF的序列，這樣的序列毫無意義，但即使大於150bp，3′端也可能缺少蛋白質編碼序列。3′端是否包含編碼框並不重要，因為mRNA的5′端包含翻譯的起始信息，為蛋白質翻譯的必要信息；而3′端有終止密碼和polyA尾，我們很容易通過對序列的觀察和實驗確定3′端。EST一般小於500bp，是因為自動測序儀一次所能測的DNA的長度就是500bp。
基因晶片(Gene chip)，又稱DNA微陣列(DNA microarray)，是指採用原位合成或顯微列印手段，將大量的核酸探針固化在支持物表面，產生二維DNA探針陣列。它通過與標記的樣品進行雜交，並檢測雜交信號的強弱從而實現對生物樣品快速、高效檢測的目的。其技術要點主要包括4個主要步驟晶片製備、探針標記、分子雜交、數據獲取。
最初的基因晶片主要是用於DNA測序。而目前這一技術以擴展至組織、蛋白、細胞等非核酸領域，因此基因晶片已超出了原來的範圍。1995年PatrickBrown等提出了cDNA微陣列技術，M.Schena等首次製造了cDNA陣列，由於各類生物的基因組計劃帶來了大量EST(cDNA)的積累，這項技術的出現能更好的利用起這些EST資源，因此得到了飛速的發展。運用基因晶片技術，將獲得的晶片運用雜交技術和掃描技術對基因晶片進行晶片處理、有效數據提取、分析和報告，可獲得相應的基因表達譜(Gene expression profiling)。目前DNA晶片因具有強有力性、靈活性、敏感性和相對簡單等特點而被應用在許多領域，如DNA測序、基因多態性(SNP)檢測、新基因的發現、疫苗和藥物研究、植物的抗逆性研究、有機體的發育、調節細胞功能的基因的協調性研究、檢測不同發育時期不同組織中基因的波動性活動等。分析基因組規模化的基因表達數據，將最終導致對細胞分化的整體性觀察，涉及細胞增殖、細胞死亡、能量代謝、胞間和胞內信號轉導、細胞遷移的基因組分子圖譜等。
通過對表達序列標籤及其構成的基因晶片進行基因表達譜分析，有助於發現並克隆基因家族新成員、基因定位克隆、作為序列標籤位點(Sequence-Tagged Sites，簡稱STSs)染色體的基因定位和基因圖譜製作、導致遺傳病的突變位點的鑑定、分析基因在不同組織中的表達特異性和建立DNA物理圖譜、新藥的發明和對細胞和有機體的整體研究等。正因為表達序列標籤具有如此的優越性，因此表達序列標籤測序已經成為許多基因組研究機構的工作重點。
雞作為實驗動物，由於其胚胎發育的特殊性一直是胚胎生物學和發育生物學研究的重要模型。在免疫學研究方面，雞的淋巴細胞發育過程為鑑別T細胞和B細胞提供了線索，B細胞的命名就是基於禽類的法氏囊。在基因表達調控方面，早期的激素對基因表達的調節機制研究也是利用雞作為模型進行分析的。可見雞作為模式生物對生物學早期研究所起的重要作用。
雞作為模式生物，在開展基因組學研究方面也有著巨大優勢。首先，雞和人的保守同線性水平非常高，從雞和人比較圖譜發現進化過程中相當部分的染色體區段是非常保守的，物理定位的基因中也發現許多是保守的，定位在連鎖圖上的235個已知基因中有204個在人上已經被定位；其次，雞基因組大小只有人的三分之一，基因組中的重複序列少、內含子的長度小，基因組結構有其獨特性(微小染色體中的基因密度高於大染色體)。這些特點無疑決定了雞是除河豚、小鼠和大鼠外研究人類基因組和生物進化規律的又一個很好的模式生物。
特別在骨骼肌發育的研究中，雞有著其它的模式動物無可比擬、不可取代的優勢。雞在長期的自然及人工選育的過程中形成了在生長發育上具有較大差異的兩大品系，即蛋雞和肉雞。即使在相同的飼養條件下，肉雞在骨骼肌生長速度上遠遠超過蛋雞。由於這兩種不同的雞具有相同的起源，因此，它們在基因組水平上具有大體相同的遺傳背景和與其特定性狀(肌肉生長速度)相關的微小差異。通過對蛋雞和肉雞骨骼肌組織的差異表達基因尋找就可能為研究肌肉發育機理提供重要線索。
目前，尋找差異表達基因的方法有很多種。根據技術策略的不同，可分為以PCR擴增原理為基礎的RNA任意引物PCR指紋(RNA Fingerprinting byArbitrarily Primed PCR，RNA AP-PCR)和差異顯示反轉錄PCR(DifferentialDisplay RT-PCR，DDRT-PCR)；以雜交原理為基礎的差異雜交(DifferentialHybridization)、抑制性消減雜交(Supression Subtractive Hybridization，SSH)、cDNA代表差異分析(cDNA Representational Difference Analysis，cDNA RDA)和cDNA微點陣雜交(cDNA microarray Hybridization)；以限制性酶切為策略的RFLP偶聯的結構域定向差異顯示(RFLP-coupled Domain-DirectedDifferential Display，RC4D)、cDNA 3』端限制性酶切片斷分析(Analysis of cDNA3』-end Restriction Fragments)和基因表達系列分析(Serial Analysis of GeneExpression，SAGE)。
這些豐富的方法在發現基因的差異表達研究中，各有其優缺點。比如DDRT-PCR的假陽性率可以高達70％，而且涉及危險性的同位素等；SSH要求起始的原材料要多，且依賴序列中酶切位點的存在及接頭與片段的連接效率等；cDNA RDA的缺點在於可比的樣本數較少，所獲序列較短，且對於低豐度的mRNA不易檢出等；SAGE技術的高成本，低效率(測序大部分得到高豐度看家基因)也影響了其運用。
此外，cDNA晶片的製備方法，目前集中利用已經修飾的玻片為基片，然後將cDNA點至於玻璃片之上，這種方法的缺點是成本高，玻璃片修飾基團不穩定，因此不利於基因晶片的推廣。

發明內容
本發明的目的在於提供一種成本低、效率高的可在蛋雞和肉雞骨骼肌差異基因表達篩選中應用的雞骨骼肌表達序列標籤基因晶片的製備方法，它的製備過程如下(1)初步處理DNAa.將5～10μg已純化提取的DNA溶解於50μl的0.1～0.15M NaOH溶液中，並在60～70℃溫度下水浴30～60分鐘；b.加入5μl的溶於異丙醇的0.1～0.2M環氧丙氧基三甲氧基矽烷；c.在60～70℃水浴鍋中水浴3～5個小時；d.加50μl中和液，中和液為0.2M Tris.HCl和1M NaCl的混合液；e.加入200μl的乙醇進行純化回收，即完成了DNA的初步處理；(2)點樣前處理DNA將初步處理的DNA加入25μl 45～55mM NaOH溶液中進行變性，在所得液體中再加25μl 0.08-0.12M的Tris HCl即完成處理；(3)點樣將產物取體積10μl，然後通過8道加樣器，將樣品轉移至Axygen的384孔板，然後利用MicroGridII機器人進行cDNA晶片製備使用的點樣針為0.1mm的實心針，載體為玻璃片，利用4×4的針列進行點樣，控制晶片製備外部環境，溫度保持在21℃，相對溼度控制在50-55％之間，並使用軟接觸(softtouch)的功能，嚴格控制點樣針每次取樣之間的洗針程序；(4)點樣完成後，立刻將玻片放在80℃溫度下幹烤2～4小時；取出玻片，在體積濃度為80％的乙醇中浸泡，然後將玻片用保鮮膜包住使其密封，再在60-70℃的水浴鍋中水浴4～8小時；用濃度為80％的乙醇清洗至其表面雜質清除；用氣流吹乾或用550rpm離心機離心3min，即得本發明所述晶片。本發明的製備方法具有以下優點1.規模大可以同時對10 000個以上的基因進行檢測，隨著技術的改進，目前晶片已經可以達到400 000probes/1.6cm2的驚人密度。2.速度快晶片的雜交反應可以在幾個小時內完成，相對於其他方法更迅速快捷，另一方面也有利於進行平行實驗和重複性實驗；3.效率高晶片的高通量性結合生物信息學的數據挖掘使晶片在效率上大大的高於傳統的實驗方法；4.安全性高使用螢光物標記，避免了同位素等物質的汙染；5.靈敏度高可檢測豐度差幾個數量級的表達情況；6.相對成本低由於高通量，高效率的特點，縮短了研究的實驗周期，相對於對單個基因的研究成本下降；因此，cDNA晶片技術就規模、速度，還是效率、成本，都有其他方法不可比擬的優勢，能夠勝任蛋雞和肉雞的骨骼肌差異表達基因的大規模分析。本發明的應用如下1.用本發明的方法獲得的新的表達序列標籤製成表達序列標籤晶片具有許多商用價值和科研價值；a.應用該基因晶片可以快速、高效的進行蛋雞和肉雞的骨骼肌表達差異基因篩選，研究不同發育階段的雞的骨骼肌表達差異基因。並可以分析不同個體之間的基因表達差異，從而從整體上研究雞的骨骼肌發育相關調控基因。b.應用該表達序列標籤晶片可用於克隆動物的重要性狀的基因，如肌肉快速生長控制基因、肌肉萎縮控制基因及相關影響肌肉結構組成等基因。c.應用該基因晶片也可用於對動物的雜種優勢進行早期預測，篩選出最佳的優勢雜交種。d.應用該基因晶片也能用於對轉基因產品進行商品檢驗，以檢驗可食轉基因產品的安全性。e.應用該基因晶片還可用於查找藥物的毒性和副作用，進行毒理學研究，利於對新型動物藥物的篩選。f.該基因晶片可用於動物的育種和動物新品種的產生。g.該基因晶片還可用於從整體上研究整個信息利於核糖核酸(mRNA)的表達，這對生物體基因調節的整體性研究具有重要的科研和實踐指導價值。h.應用該基因晶片還可以運用突變體研究動物中胞間和胞內信號轉導，為發現動物中的基因功能和生理代謝途徑提供重要的理論依據。i.該基因晶片能夠作為一種商品，廣泛應用於臨床、醫藥行業以及實際生產中。2.可以利用這些新的表達序列標籤繪製基因圖譜。如果一個表達序列標籤在基因組中只出現一次，那麼它可以做為序列標籤位點(STS)。由表達序列標籤構建的物理圖譜叫表達圖或轉錄圖。利用表達序列標籤進行基因圖製作，可以加快序列標籤位點的製作和新基因的染色體定位。3.表達序列標籤序列可以作為基因特異性探針，對組織特異性基因表達的研究具有重要的作用。4.這些新的表達序列標籤豐富了表達序列標籤資料庫，並可以最大限度地利用公開的表達序列標籤資料庫信息，大大縮短克隆新的全長互補脫氧核糖核酸的周期並可減少克隆的成本，加快雞的生物信息積累較薄弱的基因克隆進度。5.表達序列標籤還可進行新基因的遺傳進化關係分析。表達序列標籤可以對所有動植物的基因作為一種標籤庫，通過不同的序列比較可以獲得保守序列片段，從而獲得基因的遺傳進化圖譜。
具體實施例方式本發明通過分別提取6周齡蛋雞骨骼肌和胚胎期18天肉雞骨骼肌組織高質量RNA，然後分別純化mRNA，構建6周齡蛋雞骨骼肌組織cDNA文庫和胚胎期18天肉雞骨骼肌組織cDNA文庫。從已構建的6周齡蛋雞骨骼肌cDNA文庫和胚胎期18天肉雞骨骼肌組織cDNA文庫中隨機挑取克隆以文庫質粒上的通用引物T7和T3進行PCR擴增(94℃ 5min預變性；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 2.5min共40個循環；72℃ 7min繼續延伸；4℃保存)。PCR擴增產物經過異丙醇純化後，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇有效擴增的10752個克隆，並對其中100克隆進行測序，通過NCBI進行分析後，使用MicroGridII機器人進行cDNA晶片製備。晶片製備過程中利用Amersham的內參標準控制試劑盒進行質量監控，包含有靈敏度檢測，重複性檢測，晶片布局均一性檢測。
本發明分離出世界上首次發現的雞的骨骼肌cDNA表達序列標籤的序列具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.20的序列。
所說的cDNA序列具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.20的序列中的一條或數條的組合。cDNA序列包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.20的序列中每條序列的互補序列或同源序列。cDNA序列包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.20的每條序列中的15-100個連續核昔酸為探針的序列或其互補序列。
上述序列標籤所組成的基因晶片是在載體上結合有SEQ ID No.1～SEQID No.20的序列、同源序列或其互補序列的核酸分子。載體為固相載體。固相載體為玻片、矽片、尼龍膜、硝酸纖維膜、凝膠。所說的核酸分子是脫氧核糖核酸、核糖核酸和多聚寡核苷酸。
本發明所述表達序列標籤的基因晶片是用於生物功能的研究和檢測。所說的生物包括雞及它的細胞、組織器官及其系統；所說的生物功能的研究包括蛋雞和肉雞的骨骼肌差異基因研究；對雞進行給藥處理後或不同飼料餵養，檢測前後基因表達變化，分析藥物和飼料的功能；對雞進行肌肉萎縮模擬後的分析研究；對動物生長和發育的機理的研究；所說的生物功能的檢測包括轉基因動物的安全性檢測、食物成分的功能性評估、病原體的檢測和診斷、生物物種的鑑定，包括動植物和微生物。
一.cDNA文庫的構建1.6周齡蛋雞骨骼肌和胚胎期18天肉雞骨骼肌組織mRNA的提取探針退火約350μg總RNA加入DEPC處理水至總體積500μl，65℃水浴10分鐘，加入3μl生物素標記寡聚dT引物與13μl 20×SSC。輕柔混勻，室溫冷卻。
洗滌磁珠輕輕拍打管底使磁珠徹底分散，用磁力架捕獲磁珠，小心去上清。以0.3ml 0.5×SSC洗滌磁珠3次，每次洗滌後均以磁力架捕獲磁珠，小心去上清。在最後一次洗滌後，儘可能多移去上清。
mRNA的捕獲與洗滌將加入探針退火的mRNA加入裝有經洗滌的磁珠的管中，室溫放置10分鐘，每1-2分鐘顛倒混勻一次。用磁力架捕獲磁珠，小心去上清。以0.1×SSC洗滌磁珠4次，最後一次洗滌之後，儘可能多移去上清。
溶解mRNA將磁珠重新懸浮於0.1ml DEPC處理水中，以磁力架捕獲磁珠，取上清。再將磁珠懸浮於0.15ml DEPC處理水中，以磁力架捕獲磁珠，取上清。將兩次上清混合，共0.25ml。
2合成cDNA第一條鏈加樣之前，先設置42℃溫浴，把有關試劑解凍，並離心。
在0.5mlRNase free的離心管中加入下列試劑試劑 體積(μl)
10×first-strand buffer 5First-strand methyl nucleotide mixture 3Linker primer 2DEPC-treated H2O xRNase Block Ribonuclease Inhibitor 1Poly(A+)RNA(5μg) xTotal 48.51.混勻，室溫放置10分鐘，使引物與模板結合。在此期間，在另外一個離心管中加入0.5μl[α-32P]dATP作為對照。
2.在反應體系中加入1.5μl StrataScript RT，此時總反應體系為50μl。
3.從第一條鏈合成反應體系中吸出5μl，加到有0.5μl[α-32P]dNTP的管中，作為第一條鏈合成的對照反應。
4.把反應體系和對照反應在42℃反應1小時。
5.停止反應，將第一條鏈合成反應體系放置於冰上，將第一條鏈合成的對照反應管放置於-20℃下，待鹼變性瓊脂糖凝膠電泳檢測你轉錄效率。
3合成cDNA第二條鏈1.在反應結束的cDNA第一條鏈合成反應體系中加入下列試劑試劑 體積(μl)10*second-strand buffer 20second-strand dNTP mixture6dd H2O 114[α-32P]dNTP 2RNase H 2DNA polymerase11Total 1552.混勻並離心，16℃反應2.5小時。
3.結束反應，立即放置於冰上。
4補平cDNA末端1.在反應結束的cDNA第二條鏈合成體系中加入下列試劑.
23μl Blunting dNTP mix2μl Pfu DNA polymerase2. 72℃反應0.5小時.(不要超過30分鐘！)3.結束反應，加入200μl酚-氯仿，震蕩，室溫離心12000rpm，2分鐘。
4.轉移上清到新的1.5ml離心管中，加入200μl氯仿，震蕩，室溫離心12000rpm，2分鐘。轉移上清到新的1.5ml離心管中，加入20μl醋酸鈉和400μl100％乙醇，放置在-20℃過夜。
5. 4℃離心12000rpm 1小時。
6.倒掉上清，加入500μl70％乙醇，不要讓沉澱重懸，室溫離心12000rpm 2分鐘。
7.倒掉上清，真空乾燥。
8.加入9μl EcoR I adapters，重懸沉澱，放置在4℃至少30分鐘。
9.從中吸出1μl到新的0.5ml離心管中作為第二條鏈合成反應的對照反應。把第一條鏈合成的對照反應和第二條鏈合成反應的對照反應跑alkaline agarosegel。
5連接EcoR I Adapters1.在補平末端的cDNA和EcoR I adapters中加入下列試劑試劑 體積(μl)10*ligase buffer 1rATP 1T4 DNAligase 12. 8℃過夜，或4℃兩天。
3.第二天(或第三天)於70℃加熱30分鐘以終止反應，並使連接酶失活。
6磷酸化EcoR I末端1.將反應體系離心2秒鐘，室溫放置5分鐘。
2.加入下列成分試劑 體積(μl)10*ligase buffer 1rATP 2
dd H2O5T4 polynucleotide kinase 23. 37℃反應0.5小時。
4. 70℃，0.5小時以終止反應，並使激酶失活。
5.離心2秒鐘，室溫放置5分鐘。
7Xho I酶切1.反應體系中加入28μl Xho I buffer supplement和3μl Xho I。
2. 37℃反應1.5小時。
3.加入5μl 10*STE buffer和125μl 100％乙醇。
4.-20℃過夜。
5. 4℃離心12000rpm，1小時。
6.倒掉上清，乾燥，加入14μl 1*STE buffer重懸cDNA。
7.加入3.5μl column loading dye準備過柱進行分離純化。
8 cDNA分選分離柱的組裝1.將棉塞從移液管的末端挑出一部分，留3-4mm的長度在移液管中，將剩餘部分剪掉。
2.用連接管連結注射器和移液管。
3.用注射器的活塞將棉塞吹入移液管尖端。
4.將組裝好的裝置垂直固定於蝴蝶夾或三腳架上。
9分離柱的製作及樣品的分離1.將約2ml 1×STE buffer灌入移液管2.立刻加入Sepharose CL-2B filtration medium，等待Sepharose CL-2B filtrationmedium在重力作用下沉澱形成柱子，直至柱床離移液管頂端約0.25inch時，柱子便做成了。
3.在注射器內加入10ml 1×STE buffer，使其緩緩流下，以清洗柱子。這個過程要經歷至少2小時。
4.把cDNA樣品加入柱子，待樣品進入柱子後，加上1×STE buffer。
注整個過程都要避免氣泡的產生。
10收集分離好的樣品1.準備12個0.5ml離心管，編號，當染料前端到達移液管的-0.4ml刻度時，開始收集樣品，每三滴一管，直至染料末端到達0.3ml刻度，停止收集。
2.用counter測量每管的輻射強度，並做記錄。
3.從每管中取出8μl跑非變性聚丙烯醯胺膠。(見附錄)通過輻射強度的高低，可看出，從第一管到最後一管，輻射強度顯示出兩個峰值，前一個較弱，代表cDNA；後一個較強，代表未為用於合成cDNA鏈的單核苷酸。保留前一個峰值處的4個樣品作為下一步連接反應的樣品。
11純化分離出來的cDNA1.加入100μl酚-氯仿2.室溫離心12000rpm 2分鐘，將上清移入新的1.5ml管。
3.加入100μl氯仿。
4.室溫離心12000rpm 2分鐘，將上清移入新的1.5ml管。加入200μl 100％乙醇。
5.-20℃過夜。
8.第二天4℃離心12000rpm 1小時。
6.棄上清，加入200μl 80％乙醇，室溫離心2分鐘7.棄上清，真空乾燥，加5μlddH2O重懸沉澱。
8.取0.5μl樣品進行EB凝膠分析，從而估計cDNA的濃度。(見附錄3)12 cDNA與Lambda ZAP-CMV XR Vector連接1.在0.5ml離心管中加入下列成分試劑 體積resuspended cDNA X，～100ng10*ligase buffer 0.5rATP 0.5Lambda ZAP-CMV XR1.0VectorddH2O XT4 DNA ligase 0.5
Total 52. 12℃過夜或4℃反應兩天。
3.如果第二天包裝，從LB四環素平板挑取XL 1-Blue MRF』單菌落，液體培養。
4.連接結束後，用Gigapack III Gold packaging extract包裝1μl連接產物。
13準備宿主菌1.將XL 1-Blue MRF』和XLOLR兩種菌在四環素平板上進行劃線培養，37℃過夜。
2.挑取單菌落，10ml液體培養(LB with 0.2％MgSO4，10mM maltose)XL 1-BlueMRF』，30℃過夜。
3. 500g離心10分鐘，棄上清。
4.加相當於原培養基體積1/2體積的10mM MgSO4，重懸細胞。
5.用10mM MgSO4將菌液稀釋到OD600為0.5。
14包裝1.一管packaging extract從-80℃取出，放於乾冰上。
2.將裝有packaging extract的管夾於兩指之間，直至packaging extract開始融化。
3.立即加入連結後的DNA(1-4μl包含約0.1-1.0μgDNA連接產物)到packaging extract，用tip頭迅速攪動，直至packaging extract完全融化。稍微離心。
1.室溫(22℃)反應2小時。
2.加入500μl SM buffer和20μl氯仿，混勻，離心。
3.樣品保存於4℃。
15塗板和計數1.分別混合下列成分1μl包裝反應產物和200μl XL 1-Blue MRF』細胞1μl稀釋十倍後的包裝反應產物200μl XL 1-Blue MRF』細胞2. 37℃放置15分鐘。
3.加入2-3ml NZY top agar。
4.塗布到NZY agar平板，37℃放置6-8小時。
16 Lambda ZAP-CMV XR文庫的擴增1.用10mMMgSO4將宿主菌稀釋至OD600為0.5。
2.於15ml離心管中混合含有約50000pfu的噬菌體和600μl的宿主菌3. 37℃溫浴15分鐘。
4.製備50mlNZY top agar，融化後保溫於48℃。
5.混合6.5ml NZY top agar和侵染的宿主菌，塗布於NZY agar平板。
6.待NZY top agar凝固，將平板放置於37℃溫箱(6-8小時)，直至看噬菌斑。噬菌斑的直徑控制在1-2mm內。
7.將平板表面加入8-10ml SM buffer，保存於4℃過夜。(如果條件允許，可進行輕微的搖動)。
8.將噬菌體懸液倒入50ml離心管內，用2ml SM buffer衝洗平板表面，收集到同一個離心管中。加入氯仿至終濃度5％，混勻，室溫放置15分鐘。
9.離心500g 10min10.將上清移入另一乾淨的離心管中。加入氯仿至終濃度3％，保存於4℃，或加DMSO至終濃度7％，用1.5ml離心管分裝，保存於-80℃。
11.測濃度。
17 pCMV-ScriptEX phagemid的體內切離1.挑XL 1-Blue MRF』和XLOLR單菌落，分別於LB with 10mM MgSO4，0.2％maltose和NZY broth中搖床培養，30℃ O/N。
2.離心1000g 10min，用10mM MgSO4重懸細胞至OD600＝1.0。
3.在50ml離心管中，按一定比例混合lambda phage，XL 1-Blue MRF』細胞和helper phage。
摩爾比ExAssist helper phageXL 1-Blue MRF』細胞lambda phage＝100∶10∶15. 37℃溫浴15分鐘。
6.加20mlNZY broth，37℃搖床培養2.5-3小時。
7.將離心管於65-70℃加熱20min。
8.離心，1000g 10min，將上清移入乾淨的離心管中。
9.如果要測濃度切離下來的phagemid的濃度，取1μl的上清，與200μl的XLOLR細胞混合於1.5ml離心管中。
10. 37℃溫浴15分鐘。
11.加4μl的5*NZY broth，37℃溫浴45分鐘。
12.取100μl的細胞混合物，塗布於LB-卡那平板上，37℃倒置培養過夜。
二.cDNA(Taget DNA)的製備從已構建的6周齡蛋雞骨骼肌(胚胎期18天肉雞骨骼肌)cDNA文庫中隨機挑取克隆，以文庫質粒上的通用引物T7和T3進行PCR擴增(94℃ 5min預變性；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 2.5min共40個循環；72℃ 7min繼續延伸；4℃保存)。PCR擴增產物經過異丙醇純化後，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據DL2 000 DNA(0.3ug/μl)和λDNA(0.1ug/μl)分子量標準，篩選出濃度大於0.5ug/μl的PCR擴增產物10752個，捨棄擴增多個條帶及擴增效率低的克隆。
三.cDNA(Taget DNA)的測序隨機選取100個cDNA克隆進行測序，統計分析文庫的代表性。
(1)將樣品送聯合基因公司進行測序。
(2)獲得的序列剔除載體序列和冗餘序列。
(3)用非冗餘序列對公共表達序列標籤資料庫進行檢索，將其分類。
四.資料庫的構建雞cDNA質粒克隆由聯合基因科技(集團)有限公司測序，使用T3引物測序，去除序列中的載體序列並修正測出序列中的模糊鹼基後，將片段長度小於100bp的序列視為無效，所有的序列利用DNA TOOLs 5.1(1995-1999，S.W.Rasmussen)進行比對去除冗餘序列後得到100條ESTs，將這些ESTs與GenBank資料庫(截至2003年5月)用Blastn進行搜索，得到的Blast最高分值，概率以及同源序列長度和功能識別描述編輯成ESTs資料庫。
五.基因晶片的製備(一)PCR產物的純化1.異丙醇純化(1)按體積比1∶1用異丙醇沉澱PCR產物，然後放置15分鐘。
(2)3 200rpm、4℃離心40分鐘。
(3)70％乙醇洗沉澱。
(4)3 200rpm、4℃離心40分鐘。
(5)乾燥，加12μl ddH2O溶解沉澱。
(6)取1μl電泳檢測。
(二)cDNA晶片製備
(1)初步處理DNAa.將5～10μg已純化提取的DNA溶解於50μl的0.1～0.15M NaOH溶液中，並在60～70℃溫度下水浴30～60分鐘；b.加入5μl的溶於異丙醇的0.1～0.2M環氧丙氧基三甲氧基矽烷；c.在60～70℃水浴鍋中水浴3～5個小時；d.加50μl中和液，中和液為0.2M Tris.HCl和1M NaCl的混合液；e.加入200μl的乙醇進行純化回收，即完成了DNA的初步處理；(2)點樣前處理DNA將初步處理的DNA加入25μl 45～55mM NaOH溶液中進行變性，在所得液體中再加25μl 0.08-0.12M的Tris HCl即完成處理；(3)點樣將產物取體積10μl，然後通過8道加樣器，將樣品轉移至Axygen的384孔板，然後利用MicroGridII機器人進行cDNA晶片製備使用的點樣針為0.1mm的實心針，載體為玻璃片，利用4×4的針列進行點樣，控制晶片製備外部環境，溫度保持在21℃，相對溼度控制在50-55％之間，並使用軟接觸(softtouch)的功能，嚴格控制點樣針每次取樣之間的洗針程序；(4)點樣完成後，立刻將玻片放在80℃溫度下幹烤2～4小時；取出玻片，在濃度為80％的乙醇中浸泡，然後將玻片用保鮮膜包住使其密封，再在60-70℃的水浴鍋中水浴4～8小時；用體積濃度為80％的乙醇清洗至其表面雜質清除；用氣流吹乾或用550rpm離心機離心3min，即得本發明所述晶片。晶片製備過程中利用Amersham的內參標準控制試劑盒進行質量監控，包含有靈敏度檢測控制點，重複性檢測控制點，晶片布局均一性檢測控制點，carryover現象的檢測控制點。
六.本發明所述晶片在快速篩選蛋雞和肉雞骨骼肌差異表達基因研究中的應用分別選取相同飼養條件下7周齡雄性蛋雞和肉雞的骨骼肌組織，利用RNeasy RNA試劑盒提取骨骼肌組織總RNA，通過紫外分光度計檢測RNA的Ratio值。進一步利用Oligotex mRNA Midi試劑盒純化分離mRNA，選取Cy3和Cy5為螢光物，進行後標記，利用紫外分光光度計檢測標記效率。
探針與雜交液(含50％甲醯胺)均勻混合，平鋪於晶片表面，蓋上Takara的晶片專用蓋玻片，置於42℃避光水浴20小時進行雜交。
取出雜交後的晶片，利用嚴謹型洗片方法進行後處理，自動化的洗片機保證晶片之間的差異程度降到最低，具體過程如下先在250ml預熱至55℃的1×SSC/0.2％SDS中洗10分鐘；然後在預熱至55℃的0.1×SSC/0.2％SDS中洗兩次，每次洗10分鐘；在0.1×SSC中室溫洗兩次，每次1分鐘；最後在ddH2O中浸一下(小於10s)；500g短暫離心乾燥。
經過洗滌後的晶片立刻用Axon4000A型掃描儀進行掃描，根據內標控制點的信號調整激發光能量，採集數據。
通過分析每一個點陣裡的內標控制點來決定晶片的質量，再利用差異表達基因篩選SMA方法分析數據，顯著性水平為0.0001。
選取從晶片得到的基因進行Northern Blot的驗證，將EST進行同位素標記，雜交蛋雞和肉雞的RNA。
序列表(1)SEQ ID No.1的信息(a)序列特徵長度211個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.1GGCACGAGGAATTCTTTAGCAAAGGAAGTTTGAAATCAGTTACCCAAGAGCTGTTATCCCCGATCTCCGCATCTGGGATGGAAAATGCAGGATGCAGTCGGGTGAAATGCAGTGCTTTCACGTCACTGTGCCATACTTCCCATCAGCAGAGGCCCGAAAGTGGTTACAATGTGTGAAATACAAGTTAAGATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(2)SEQ ID No.2的信息(a)序列特徵長度678個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.2GGCACGAGGTGAAAAGATGACCCAAATCATGTTTGAGACCTTTAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTGGCCGTACCACCGGTATTGTGCTGGACTCCGGCGATGGTGTGACACACAAC
GTCCCCATCTATGAAGGGTATGCCCTGCCCCATGCCATCATGCGCTTGGATCTGGCTGGCCGCGACCTCACTGACTACCTGATGAAGATCCTGACTGAGCGTGGCTATTCCTTTGTCACCACAGCTGAACGTGAGATTGTCCGTGACATCAAGGAGAAGCTGTGCTATGTGGCTCTGGACTTTGAGAACGAGATGGCCACCGCTGCCTCCTCCTCCTCCCTGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCTGATGGGCAGGTCATCACCATCGGCAATGAGCGTTTCCGCTGCCCAGAAACCCTCTTCCAGCCTTCCTTCATTGGTATGGAGTCCGCTGGGATCCATGAGACAACTTACAACAGCATCATGAAATGCGACATTGACATCAGGAAGGACCTGTATGCCAACAACGTCATGTCTGGGGGTACCACCATGTACCCANGTATTGCTGACCGCATGCAAAANGAGATCACAGCCCTGGCCCCCANCACAATGAAGATCAAGATCATGGCCCCACCTGAGCGCAAGTACTCTGT(3)SEQ ID No.3的信息(a)序列特徵長度382個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.3GGCACGAGGCTCCCCACTTGTCATACGTACCCCAGTGGCAGCATCCCTGGTGCAGGATCGAGGCCGGTTCTGTAGTCAGCAATGGACGGGCAGTGGTGCTCACACTGCGAAGTAAAGCTCCCTGCACTGGGTCTAGCCTCTTTTGTCTTGCCGCAGAGCACGGGTAACACCGTTGCCACTCTAAACGTGGCAGTGGTGGAATCTGAAACTGTCTCGCTGCAGTCTGGCAAAGGAGGGAAGGGAGCGTGGTGTGCTCTGGGGCCCTGGTGCTTTGTTGTTGGGCCGTTGTAAAATAATGGGGTACACATGTGTCCACCTTGGCAACTGGGGGTGCTCAAGTGCAATAAAGCAAGAAGGACTGGCCTAAAAAAAAAAAAAAAAA(4)SEQ ID No.4的信息(a)序列特徵長度641個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.4GGCACGAGGCCCGGCTCCCGTGGTCTACTTCGTGGATTACGCGTCCAACTGCATTTATCTGGAAGATATCGTTGGCGCGATCGCTGTTCAGGATCACATCTACTCCGTGCAGCGGAGCGGCAGCGATGCCAGCAGCCTCCTCGGCTTGGCGGAGAAGATGGGCCAGCTGCTGGCCAGGATGCACGACGAGGACCTCATCCACGGGGACCTCACGACGTCCAACGTGCTGCTGCGGCCGCCCGCGGAGCGGCTGGACTTGGTGCTGATTGACTTTGGGCTCAGCTTTATTTCGGGTCTTCCCGAGGATAAAGGAGTCGATCTGTACGTGCTGGAAAAAGCCTTCCTTAGTACCCATCCCGATACGGAAACTGTGTTTCAGGCTCTGCTGCAGAGCTACGCGGCCGCCTCTAAGAAATCCGGCCCGGTGATCAAACGTCTGGATGAGGTGCGGCTCAGGGGGAGGAAGAGGTCCATGATTGGGTAACAGCAGGCGGTGACGGAGAAATCTGATGGAGAAATTGGTTCTGCCAAAGGGGGTTATTTATACTGCCGGTTACTTTGGTTGCACAGATGGCTCTTTTGATAGCAGTGCCTCGTATGAAATAATCGGGATTTCTAACCGTTAAAAAAAAAAAAAAAAA(5)SEQ ID No.5的信息(a)序列特徵長度430個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.5GGCACGAGGGCAGGGCAGGACAGAGGCAGTTCTGGACGTGAACAGAACTGAATGGCAGAGCAACAATAAGGAAACAATTGTCATCGGGTTTGACTTGACAGAAACACTAAACTTAGGAAGTTATCAATCACAACTCTTGTTTTCTAAGGAATATCAAGGCAAAAATTACATTGCTGCTTTAAATTCACTGTAATACGATGAGGCCGTTGTCACATTTAAAAAATTACCTGTTTGATTTTTCTGTTGAATTACGTGTTTCCTTCTGCTCAAGTAAAATAAGTGTTTCATGTGAATGCAA
CCTTCTGCACTGTGGTCATCATTTCTTACAGGAATGTAGAACTGTGAACCATCTGTACCCTTTTATTACTTTACCAAGGTCAAATAAACTGGTGTGACTTTTGTAAGCGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(6)SEQ ID No.6的信息(a)序列特徵長度573個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.6GGCACGAGGGTTTCTCCAGGTACTGTGTAGGACATTGTGTCTGTGATTGGTACCATTTCACCGAGTCAAATGGGAGAGGGGGAAAAGTAACTTGAAGCCATGTTCAAGCCATTAGCTTGAACATAACTTATGGCAACTTGCTGATGCTCAGAAGGTAACTAAAAAAGGACTTCAGAGCATGCAAGGAGATGGGGAAGACTAACAGACATGGAGCAATGTGCTACTCCGGTCTCAGTTGGCAGAACAAAGAGATTCCACTCTTGTTCCGCTTCTTTATGTTTTTTCTAGTCTTCTCCAGCCATCAGTGGAGGTAGAAGGAGGTTCTGAAGGCATTAAGCTGATGTTTCTCCAGACAAAAGGGTGTCTGATATGTTTCCTCACCTAAGGGAGCTGCAGGTATGGTGCTACAAAGCACTTCAGAGGGAAAAGGGAGGTGGTGCAGGTCAGACCTGGGGGGCTCTGAGGAGTTCCCACGTGGTGAAGGTCATAGGGATGAGACAGTTAAAAGAAAAAAGGCATGTGAGCACAGCTGGCAGAAATTCCTCCAACACTGCAATGAACAGGAAAAAAAAA(7)SEQ ID No.7的信息(a)序列特徵長度666個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞
(d)序列描述SEQ ID No7GGCACGAGGAAGTGTTTGGGTTGGGTAGATGGGTGTGGGGATATGAATTCTTAGGATTTGCTGTTGTTGTAGGCTTCCACAAATCAGTGTGTTTTGCAGACAGTTTTCCTTCAGGTTTAAAAGTACAAGTCTGATGTCTGAACTTGGAGTAACCTTTGTTTCCGTCTCTCTTTGCTTTGGGCTGCCATCATTCTATGAATGTATCCCTGAAAACAATTCTTAGAGCTCCTATTCCACAGCAAACCTGCCTCATTGTAACTTCTGATTAAATGTGTTGTAAGAGGTGGAAGTGAGAGTGACCACACGTGTAAGACTCCTTTTTCTAGGCTATTAATCCTGGAAAACGGTTGTTGAATACAAGGTTTAATCTCGGTCTCTTAGAAAGCTGTGTTCCCTGTACATGGATGAGGGAGAGTGCAGGTCAGTAGTTCTGAACAATAAAGAGTTGTATTAGTCTATTGGCCGAGCTGGCCGTAGTAAGAGAATGCTGCGTCTTAGTACTGTTATCCGGAGTCACTGAAACTCTGAAGTATGAGCTTACTGCAGAGAACTTCAGTTACTTCATATTTTGCTGCAGCAGGACCTCTTTTTAGCTTGAAAATAACTGCTTATGAACAAGTAAACTTTTTTTGAAGTTGGGTGGGAGTTTCAATGGAGAAAAAAAAA(8)SEQ ID No.8的信息(a)序列特徵長度511個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.8GGCACGAGGGGATAATAGCTTGCGTGCTTTCTGTTACCACAGAAGTCTTAGAAGGATTTTGGTGAAAATACGTATTCAGTCCTTGTGGATGCAGGTCATTCTCGAGGGGATTTTTTTCATTCTGGTTGTTAAGTGTGCTTTAATGATGCTTTTCAAGGATACCTGATTTTAGTCAGAGTAGCACTTTGACATATAAGGAATATTTAAATATATTTTGAAAGACATTTTGCAACTTTCCTAACATCAGAATTGTAAGTTGAACTACGCTTTCTCCTGTCACCTCTTGTTTTCTACATTGAGCTAACAGGAAAGAGGGCAGTTCTCTGTGTTTTCATCATTCCATTCAAGCATGACTGAGATGAATTAAAAAGCTTTAATTTTGCTAAACTATTTCAGATCACTTTT
GTTTTGCAATTCAGATAGCCCAGATTATTTGTTTAAACCTTTTTTTTTTCTTTTACATTAAATGATCTGACAGAGAGCAACGGGCTTCTTCAGTTTAAAAAAAAAA(9)SEQ ID No.9的信息(a)序列特徵長度525個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.9GGCACGAGGGTTTTTAGTTTGATATTTTACCATGCTAAAATGGGAGGTCTGCCCAACCGTGTACTGGATTCTTGTTTCCTTTAAAAGATTGTTTAGTACAGCACTCACTGCATTGTGTACTAGTGCTAAAACTAACACTGTATCTTATGAAATTCTTCAGCTTTAAAAAAAAATTAACCTGATTACTATTACATTTGTTTAGCTGTGCCCGCTGACCTTGTCAGATTCAGTTGGCTATTTGTACAATTTCATTTTCTGTAACTGTTAAGAAACTTGTACAGCTAAAACAAAAACAGAACCTATGGACAACAGCCTCGGAGGTACCAGTTCTGCTTCAGCAATCAAGACGACAGCTAGCTCACCAAGCGACTACATTGCTAAAGAGACTGTAAAACCTCTGTTGTGGATTGTCCATAAAATGGCATTCCGACATGTGCCTTATTTGCTGGATAGTATGCAGCTTTCCTCTAGTATTCTAGCATTTTAATGCTGTATTAAAATAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(10)SEQ ID No.10的信息(a)序列特徵長度380個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.10
GGCACGAGGGAGCGGCGGCGGCAGCTACGGCGGAGGGAGGAGGTTCTGACGCCCGCAGGAAACAAAGCTTAGCAGGAGAGGAGAGCCAGAGAGAAGGGACAGGGCAAAGCTGCAGGTTACCCGAGCTGTGAACTCAGCCAGCTGACAGCTGTGGCGGGGGGGGTGGCTGCGACGTCAAGACGTGCATTAGCCAGAAGTCTCCTTTGCGAACAGGACTGTAATTGTGACTCATTGTATAACAGGTTCTTTTAGTTTTCTGTGCCGTGGAAGCATTCCTTCAAACGAGGGCTCCCGGGAGCCTCGGTTTTATTTGCGCGCCCGTGCTGTCGATCGATCGCTGACTGTAACAGGAAATGACGCTGAATAAATGTGTCCTTTGG(11)SEQ ID No.11的信息(a)序列特徵長度707個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.11GGCACGAGGCTGGAATGGAGTGGCCCTGCCCCGGAGTGCAGGGCGGTTCACTGCCCCAAGCCCGTGGTTGAGAATGGAGAGATGGTTACGCTGAGGCACACGTTCCCCTATGGGACATCTGTGAGCTTCTACTGCAAGGAGGGCTTCATGCTGCGCGGCAGTGCTGAGAGCCGCTGCGTGGCTGATGGCACCTGGCAGCCAGCCCTGCCCAAATGCCAGCCAGTTAAGTGTTCTGCACCAAGGAGCAAGGAGAACCTACAATTTTTCCCTGTGAAGGGGGAGTACGAGTTTAAGGAATCTCTGTACTTCTCCTGCAAGCTTAACAACAATGCAGCAGACAGGGCATTAACCACCTGCTCTACTGGCGGCTCTTGGATGCCACCACCCAACTGTAAAACATTTTACGTACGCAAGAAGATTGATCAAATAAAGGAAACTTTTGATTGCGGATTGCCTCTGGCAGAACTGAGAACTCTGCTGGAAGTACAGAAGCTCTACCTGGAGATCCAGAAGCTGGAGAAGGAGCTGGGAGCCAAAGGAAGCCGCTGGTGGCCGTGACTGGTNTTGTGGTGGGCATAGCANTCANTGAAGGAACAGATTTGGATCATAGGAGGAATCGGAGTCCTTTGGCTCATTCNGGCANAGCTCNCTGCGTTAGGNTNGNGCATCACTTTNTGCCTTTTAAGCTTTACATTTNNGGCTGNTTC
(12)SEQ ID No.12的信息(a)序列特徵長度714個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.12GGCAGAGCGGGGCTGAGCCCAGCGGGGACACAGAGCAGCCGAGGGGGGAAAGGGGCCCTCTGTGCAAAGCCCCACACGCTGTGGGGTTCTCCTCCTCCTCTTCCTCCCCACACTGCACGGCTCCACCATGGAGTACATCATAGGGATCGGAGGCGTCACCAACGGAGGCAAAACCACGCTGACCAACAGGATCGTCAAGGCGCTGCCCAACTGCTGCGTCATCCACCAGGACGACTTCTTCAAGCCTCAAGATCAAATAGAAGTCGGGGAGGACGGCTTTAAGCAATGGGACGTCCGTTAACCTTTTGAACCCGTGCGGGTGGCGGCGTTTGATGGGGACCCTCTCTCCCACCCACCCCTCAGTGTTGGACTCGCTGGATATGGAGGCCATGGTGAGCACGGTGCGTGCCTGGATGGAGAACCCAGTCAAGTTCGCCCGTTCCCATGGGGTGAACGTCACGCCCGACCCTACAGAGCCTCCCTCCAAAGAGCCCCACATTCTGCTCATCGAAGGCTTCCTGCTTTACAACTACAGACCCCTCATGGAGCTCTTCGACCTCCGCTACTTCCTGGCAGTGCCGTACGATGAGTGCAAACGGAGGANGAGTACACGCAGCTACACCGTCCCCGACCCCCCCGGCCTNTTCNATGGCCACGTGTGGCCCATGTACCTGAAGCACCGGAAGGAGATGGAGGACANCGGGGTCNATGTCT(13)SEQ ID No.13的信息(a)序列特徵長度519個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.13
GGCACGAGGACAAATACTAAAACAGTATTTGCTCATCTGGAATAGTCAAGCAAATGACTTTTTAAAAAAAGCACCCTTTAATTTTATTTTATTTTTAAAATACAGATTTTATTACAGCTACTTATGTGTCTACTTTGTATTAAGAACTGCAAACGATTTTAGCAGTATAAACTATTGTTCAGGAAACAGTCATTTTATGGTAGCTATAACTTTGCAGAAGATTTCAGTCTTATTGCGTATCTTCAGTGTGCTCTGAAACATAACTGTATATGTATGCTACACAAACTGACATACTTAATGTTTCCAGCAGTGTGGTAATTGACATTTGTATTGGGCTGTGGCCACAAAGGCAAACAATAGTTTTATTTCCATTCGAACTGCTGAAGACAACAACATCAGATACTTTGGAATGACTAGATATACGTGTCTAACGAGCAGAAGCCATATGTTTGGCTTCTGAATGTTGTAACTTATTAATAAATCTGATATTGATTTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(14)SEQ ID No.14的信息(a)序列特徵長度207個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.14GGCACGAGGTGGGCACTTGGGGGGCAGCCCAACAGCACGGAAAGGCCTCAGCCCCTGTGACCCACAGAGCGGGGGGGGGAGGGCGCACGTGGCGCGCGCTGTCGCTGCTGGGGGCGCTGCCTGGCCGTGGCNCTCTGCATGGCCAANGTGATGCTNCNTTCTTCGCNNCCANCNNCCNGCTCGCCTCNCATTCGTGCCNTNCCNCCC(15)SEQ ID No.15的信息(a)序列特徵長度648個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞
(d)序列描述SEQ ID No.15GGCACGAGGCCGCCGAGAAGGGCGGAAGTGGGGGCGCGGGGCCCGGCGGCATGGAGGGGACCCTGGAGCAGCACCTGGAGGACACCATGAAGAGCCCGGCCGTGGTGGGCGTCCTCTGCACCGACTCGCAGGGCCTCAACCTGGGATGCCGAGGAACGCTCTCAGATGAACATGCTGGAGTCATCTCTGTGCTCGCCCAGCAGGCAGCCAAGCTCACCTCCGACCCAACCGACACGCCCGTGGTGTGCCTGGAGTCGGACAGCGGGAACATCATGATCCAGAAGCATGACAGCATCACCGTAGCAGTGCACAAGCTGGCATCCTGACCCTGGCATCCTGATACTCCACTCCCTGCTCCAGACCAGCTCCTCCTCCCTGAACAACTGCTCTCCTCAGCTGTTCCAATGCAGAACATGCTTCTAGTACCAAATCTGGGCTGAAGGCTCTCCCTCTCTACTTACCAGCTCCTACGCATCTATCAGGGTTTCCAGCTCACATTTTAGCAGTCATGCTGTTAAAGATGAAATGTGAGTCACTCACCAAGCTCGTGTCATGATAGATACTACAAGGTGTGTGTGTGTGTGNGCCCCTTGTGGCCTTATTTGTTGGAGAAATCAATAAATANCCTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAA(16)SEQ ID No.16的信息(a)序列特徵長度723個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.16GGCACGAGGGTCTACTATGAATAGCAAATGTTTTTTTAATAGCAATAAGAAAAAACTAGATCTACCTTTTTTGTTCTAAAGGCTTTTTTGGGGGGTAGATTTCTCAATGGAAAATAAAGTCCTACTCTGTTTATTTATTTCAAATAGGAAGTTCAGAAGTAATGATGATAATTACTGAGCATATTGACTTAAATACTGCATTGAGGCAACTCTTACCCCATTGAATAAGCTGCAATCACCAAAGGTCACCAGTTCAGGAGTATTTTCACTCACTCAGTGAATGAAATGGATAACAAAACTGAAATATCTTTGTCTAGAAAATACAGGTGTGAAAAATCTGCTTTCACTGCCATAATATACTTGAATACTTTGACCTTGTATTGAATATAAGGTCACAAAAATATGCCTAGATAGTTATTAAGTAAACACAATACCTCTTTGTCTGCACTCAGTA
ATGCTTGAATGTGATTTACAATCTTCTGATAGACTGTAGATCTGTAACACAGCTTCAGCTACTGCAGGTTGAAGCTGTAATGTCTATTTTAAAAGCATCTGAAGCATGTGGGCGCTGTAAATGAATGTCTGTAATAGTGCTTGCAAATAGCAGCTTTCTGGATAAGTATAATCTCGAAGTTGTATATGCAGAACATACAATGAANACCGTGTGTAGCACTTAANGAAACCTTATGGAGTCTCCTTTAGTATTAAAAACTTGTTAANGGC(17)SEQ ID No.17的信息(a)序列特徵長度350個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.17CAGGTAATAAAACCTTCTGGCAAGCCTAACATAGGAAGGTAAGAACTAGCATCTCCCTCCTGTGCCAGGCATCAGGCAGCTTGATCATTTCTAGCCAGACTGAACATACAGAAGCAGGAACAGTAGCAAGAAATCTGAACCTTCATCTCATCTGGGCATGCAGCCACCCTCATAACTGGGTTAGAGTCTGTGAGCTGACACCCACTCCTGAATTTCTATACTACAGGTGCTGAAATGCAGCAGAAAGTAGATTTCCAGAATAAGCTCTTTGTACAGAATATGACAATCTCATCATTCAACTGTCAGACACATTTGTTCACAAGCATAAATTAATTAATAAATCTTTGTCA(18)SEQ ID No.18的信息(a)序列特徵長度248個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.18CGTATAGTACTGTATAAACCAGTTTGCTGTCTTGTTGTTATTATTATTGTTTTTTAAAGGAAGCGTCCTCCTTGAAGAATTGCCTTTTAGTAACGCAGACTG
TATTATAGTCCCTCTGTCACCACATCCATCGCTTGTCTTTTTTGATTTCCAAACGCCTCCGATGTTACCGACCAGGAAGGAAGGTGCCCACCCAGGGGATGCTGTTGGGAGGGGGCGCAGGGATTAATAAAGCCAGCTTTCCTTCC(19)SEQ ID No.19的信息(a)序列特徵長度449個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.19GCATTGAAGGATATCCCACCTGTAAAGAGAAAGTGAAGAGGAGGCCGGGTGGTCGCTCAGAAGTGATCTACAACTACGTTCAGCGGCCGTTCATCCAGATGTCCTGGCAAAAGGAGGAGGGGAAAAGCCGTCACGTTGACTTCCAGTGTGTCCGGAGCAAATCTCTAACAAACCTGGTCACTGTGGGTGATGACGTTTCAGAGGACCATGAGGTTATAATGCATCACCCCCCACAGGTAGATGAACTGGATAGGCTAAATGCACCATTCTCCCAGATGGCCGTTAATGATCTACCTGATTAGTCATGGCTCCAGCTTGATGTGGGAACATCTCGGCATAGTTTCATCCTAGTAATGGAACACAGACTCCTTGCAAGGTGCTTTATCCTCATTCATCCTCTTACTATGTTGTCATATTTCAAGCATGTTAATAAAGAGCCACACTCCTTA(20)SEQ ID No.20的信息(a)序列特徵長度94個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.20CTGTGTCCAACAATCGTTTATTTACCAAACCATTGTAGCAAACACCATTCGACGCGTAGAAAGAAGGCCCGTGATAAAAACTAAAATGGAAGTT。
權利要求
1.一種雞骨骼肌表達序列標籤基因晶片的製備方法，其特徵在於它的製備過程如下(1)初步處理DNAa.將5～10μg已純化提取的DNA溶解於50μl的0.1～0.15M NaOH溶液中，並在60～70℃溫度下水浴30～60分鐘；b.加入5μl的溶於異丙醇的0.1～0.2M環氧丙氧基三甲氧基矽烷；c.在60～70℃水浴鍋中水浴3～5個小時；d.加50μl中和液，中和液為0.2M Tris.HCl和1M NaCl的混合液；e.加入200μl的乙醇進行純化回收，即完成了DNA的初步處理；(2)點樣前處理DNA將初步處理的DNA加入25μl 45～55mM NaOH溶液中進行變性，在所得液體中再加25μl 0.08-0.12M的Tris HCl即完成處理；(3)點樣將產物取體積10μl，然後通過8道加樣器，將樣品轉移至Axygen的384孔板，然後利用MicroGridII機器人進行cDNA晶片製備使用的點樣針為0.1mm的實心針，載體為玻璃片，利用4×4的針列進行點樣，控制晶片製備外部環境，溫度保持在21℃，相對溼度控制在50-55％之間，並使用軟接觸(softtouch)的功能，嚴格控制點樣針每次取樣之間的洗針程序；(4)點樣完成後，立刻將玻片放在80℃溫度下幹烤2～4小時；取出玻片，在濃度為80％的乙醇中浸泡，然後將玻片用保鮮膜包住使其密封，再在60-70℃的水浴鍋中水浴4～8小時；用體積濃度為80％的乙醇清洗至其表面雜質清除；用氣流吹乾或用550rpm離心機離心3min，即得本發明所述晶片。
2.根據權利要求1所述雞骨骼肌表達序列標籤基因晶片的製備方法，其特徵在於複合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGAATTCTTTAGCAAAGGAAGTTTGAAATCAGTTACCCAAGAGCTGTTATCCCCGATCTCCGCATCTGGGATGGAAAATGCAGGATGCAGTCGGGTGAAATGCAGTGCTTTCACGTCACTGTGCCATACTTCCCATCAGCAGAGGGCCGAAAGTGGTTACAATGTGTGAAATACAAGTTAAGATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
3.根據權利要求1所述雞骨骼肌表達序列標籤基因晶片的製備方法，其特徵在於複合在玻片上的DNA序列如下GGGACGAGGTGAAAAGATGACCCAAATCATGTTTGAGACCTTTAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTGGCCGTACCACCGGTATTGTGCTGGACTCCGGCGATGGTGTGACACACAACGTCCCCATCTATGAAGGGTATGCCCTGCCCCATGCCATCATGCGCTTGGATCTGGCTGGCCGCGACCTCACTGACTACCTGATGAAGATCCTGACTGAGCGTGGCTATTCCTTTGTCACCACAGCTGAACGTGAGATTGTCCGTGACATCAAGGAGAAGCTGTGCTATGTGGCTCTGGACTTTGAGAACGAGATGGCCACCGCTGCCTCCTCCTCCTCCCTGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCTGATGGGCAGGTCATCACCATCGGCAATGAGCGTTTCCGCTGCCCAGAAACCCTCTTCCAGCCTTCCTTCATTGGTATGGAGTCCGCTGGGATCCATGAGACAACTTACAACAGCATCATGAAATGCGACATTGACATCAGGAAGGACCTGTATGCCAACAACGTCATGTCTGGGGGTACCACCATGTACCCANGTATTGCTGACCGCATGCAAAANGAGATCACAGCCCTGGCCCCCANCACAATGAAGATCAAGATCATGGCCCCACCTGAGCGCAAGTACTCTGT。
4.根據權利要求1所述雞骨骼肌表達序列標籤基因晶片的製備方法，其特徵在於複合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGCTCCCCACTTGTCATACGTACCCCAGTGGCAGCATCCCTGGTGCAGGATCGAGGCCGGTTCTGTAGTCAGCAATGGACGGGCAGTGGTGCTCACACTGCGAAGTAAAGCTCCCTGCACTGGGTCTAGCCTCTTTTGTCTTGCCGCAGAGCACGGGTAACACCGTTGCCACTCTAAACGTGGCAGTGGTGGAATCTGAAACTGTCTCGCTGCAGTCTGGCAAAGGAGGGAAGGGAGCGTGGTGTGCTCTGGGGCCCTGGTGCTTTGTTGTTGGGCCGTTGTAAAAMGGGGTACACATGTGTCCACCTTGGCAACTGGGGTGCTCAAGTGCAATAAAGCAAGAAGGACTGGCCTAAAAAAAAAAAAAAAAA。
5.根據權利要求1所述雞骨骼肌表達序列標籤基因晶片的製備方法，其特徵在於複合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGCCCGGCTCCCGTGGTCTACTTCGTGGATTACGCGTCCAACTGCATTTATCTGGAAGATATCGTTGGCGCGATCGCTGTTCAGGATCACATCTACTCCGTGCAGCGGAGCGGCAGCGATGCCAGCAGCCTCCTCGGCTTGGCGGAGAAGATGGGCCAGCTGCTGGCCAGGATGCACGACGAGGACCTCATCCACGGGGACCTCACGACGTCCAACGTGCTGCTGCGGCCGCCCGCGGAGCGGCTGGACTTGGTGCTGATTGACTTTGGGCTCAGCTTTATTTCGGGTCTTCCCGAGGATAAAGGAGTCGATCTGTACGTGCTGGAAAAAGCCTTCCTTAGTACCCATCCCGATACGGAAACTGTGTTTCAGGCTCTGCTGCAGAGCTACGCGGCCGCCTCTAAGAAATCCGGCCCGGTGATCAAACGTCTGGATGAGGTGCGGCTCAGGGGGAGGAAGAGGTCCATGATTGGGTAACAGCAGGCGGTGACGGAGAAATCTGATGGAGAAATTGGTTCTGCCAAAGGGGGTATTTATACTGCCGGTTACTTTGGTTGCACAGATGGCTCTTTTGATAGCAGTGCCTCGTATGAAATAATCGGGATTTTCTAACCGTTAAAAAAAAAAAAAAAAA。
6.根據權利要求1所述雞骨骼肌表達序列標籤基因晶片的製備方法，其特徵在於複合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGGCAGGGCAGGACAGAGGCAGTTCTGGACGTGAACAGAACTGAATGGCAGAGCAACAATAAGGAAACAATTGTCATCGGGTTTGACTTGACAGAAACACTAAACTTAGGAAGTTATCAATCACAACTCTTGTTTTCTAAGGAATATCAAGGCAAAAATTACATTGCTGCTTTAAATTCACTGTAATACGATGAGGCCGTTGTCACATTTAAAAAATTACCTGTTTGATTTTTCTGTTGAATTACGTGTTTCCTTCTGCTCAAGTAAAATAAGTGTTTCATGTGAATGCAACCTTCTGCACTGTGGTCATCATTTCTTACAGGAATGTAGAACTGTGAACCATCTGTACCCTTTTATTACTTTACCAAGGTCAAATAAACTGGTGTGACTTTTGTAAGCGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
7.根據權利要求1所述雞骨骼肌表達序列標籤基因晶片的製備方法，其特徵在於複合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGGTTTCTCCAGGTACTGTGTAGGACATTGTGTCTGTGATTGGTACCATTTCACCGAGTCAAATGGGAGAGGGGGAAAAGTAACTTGAAGCCATGTTCAAGCCATTAGCTTGAACATAACTTATGGCAACTTGCTGATGCTCAGAAGGTAACTAAAAAAGGACTTCAGAGCATGCAAGGAGATGGGGAAGACTAACAGACATGGAGCAATGTGCTACTCCGGTCTCAGTTGGCAGAACAAAGAGATTCCACTCTTGTTCCGCTTCTTTATGTTTTTTCTAGTCTTCTCCAGCCATCAGTGGAGGTAGAAGGAGGTTCTGAAGGCATTAAGCTGATGTTTCTCCAGACAAAAGGGTGTCTGATATGTTTCCTCACCTAAGGGAGCTGCAGGTATGGTGCTACAAAGCACTTCAGAGGGAAAAGGGAGGTGGTGCAGGTCAGACCTGGGGGGCTCTGAGGAGTTCCCACGTGGTGAAGGTCATAGGGATGAGACAGTTAAAAGAAAAAAGGCATGTGAGCACAGCTGGGAGAAATTCCTCCAACACTGCAATGAACAGGAAAAAAAAA。
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10.根據權利要求1所述雞骨骼肌表達序列標籤基因晶片的製備方法，其特徵在於複合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGGTTTTTAGTTTGATATTTTACCATGCTAAAATGGGAGGTCTGCCCAACCGTGTACTGGATTCTTGTTTCCTTTAAAAAGATTGTTTAGTACAGCACTCACTGCATTGTGTACTAGTGCTAAAACTAACACTGTATCTTATGAAATTCTTCAGCTTTAAAAAAAAATTAACCTGATTACTATTACATTTGTTTAGCTGTGCCCGCTGACCTTGTCAGATTCAGTTGGCTATTTGTACAATTTCATTTTCTGTAACTGTTAAGAAACTTGTACAGCTAAAACAAAAACAGAACCTATGGACAACAGCCTCGGAGGTACCAGTTCTGCTTCAGCAATCAAGACGACAGCTAGCTCACCAAGCGACTACATTGCTAAAGAGACTGTAAACCTCTGTTGTGGATTGTCCATAAAATGGCATTCCGACATGTGCCTATTTGCTGGATAGTTGCAGCTTTCCTCTAGTATTCTAGCATTTTAATGCTGTATTAAAATAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
全文摘要
雞骨骼肌表達序列標籤基因晶片的製備方法，涉及生物技術領域。現有的cDNA晶片的製備方法存在成本高、玻璃片修飾基團不穩定等缺點。本發明的製備過程包括初步處理DNA、點樣前處理DNA、點樣、製備等過程，通過上述過程即得本發明所述基因晶片。本發明的製備方法具有以下優點1.規模大可以同時對10000個以上的基因進行檢測；2.速度快晶片的雜交反應可以在幾個小時內完成；3.效率高；4.安全性高避免了同位素等物質的汙染；5.靈敏度高可檢測豐度差幾個數量級的表達情況；6.相對成本低；因此，cDNA晶片技術具有其他方法不可比擬的優勢，能夠勝任蛋雞和肉雞的骨骼肌差異表達基因的大規模分析。
文檔編號C12Q1/68GK1594595SQ20041004366
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月30日 優先權日2004年6月30日
發明者顧雪鋒, 朱大海, 趙心怡 申請人:哈爾濱工業大學