一種中藥組合物在製備抑制動脈粥樣硬化藥物中的應用的製作方法
2023-05-31 01:29:51
專利名稱：一種中藥組合物在製備抑制動脈粥樣硬化藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥組合物的新用途，具體地，本發明涉及一種中藥組合物在製備抑制動脈粥樣硬化藥物中的應用，屬中藥應用領域。
背景技術：
動脈粥樣硬化(atheroma)是一組動脈硬化的血管病中常見的最重要的一種，其特點是受累動脈病變從內膜開始。一般先有脂質和複合糖類積聚、出血及血栓形成，纖維組織增生及鈣質沉著，並有動脈中層的逐漸蛻變和鈣化，病變常累及彈性及大中等肌性動脈， 一旦發展到足以阻塞動脈腔，則該動脈所供應的組織或器官將缺血或壞死。由於在動脈內膜積聚的脂質外觀呈黃色粥樣，因此稱為動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化是西方發達國家的主要死亡原因。隨著我國人民生活水平提高和飲食習慣改變，該病也成為我國主要死亡原因。動脈粥樣硬化始發兒童時期而持續進展，通常在中年或者中老年出現症狀。由於動脈粥樣硬化斑塊表現為脂質和壞死組織的驟聚，因此往往認為動脈粥樣硬化是退行性病變。現在認為，本病變是多因素共同作用的結果，首先是病變處於平滑肌細胞、巨噬細胞及T淋巴細胞的聚集；其次是包括膠原、彈性纖維及蛋白質多糖等結締組織基質和平滑肌細胞的增生；第三是脂質，其中主要含膽固醇結晶及游離膽固醇和結締組織。粥樣硬化斑塊中脂質及結締組織的含量決定斑塊的穩定性以及是否易導致急性缺血事件發生。動脈粥樣硬化的治療常採用(1) 一般治療合理飲食飲食總熱量不應過高防止超重；堅持適量的體力活動；合理安排工作及生活；提倡不吸菸，可飲少量酒等；(2)控制易患因素如患有糖尿病、應及時控制血糖，包括飲食控制。II型糖尿病的降糖藥物應以不引起高胰島素血症為宜；如有高血壓則應給降壓藥，使血壓降至適當水平，如有血膽固醇增高，則應控制高膽固醇適當給予降脂藥物。(3)降血脂藥物治療1、他汀類2、消膽胺、3、煙酸。4、不飽和脂肪酸。5、藻酸雙酯鈉。(4)抗血小板藥物治療1、阿斯匹林。2、潘生丁等。 西藥治療存在副作用大等缺點，而中醫藥在抑制動脈粥樣硬化進程方面具有獨特的優勢， 值得推廣應用。本發明是在第201010200771. 7號專利申請的基礎上進行的改進發明，在此全文引用該兩專利文件記載的內容。上述專利申請未公開該中藥組合物製備抑制動脈粥樣硬化藥物的應用。本發明在其基礎上進行了相關研究，提供了該中藥組合物在製備抑制動脈粥樣硬化藥物中的應用。
發明內容
本發明目的是提供一種中藥組合物在製備抑制動脈粥樣硬化藥物中的應用，所述中藥組合物由如下重量份的原料藥製成白芍6-20、桂枝 3-10、薤白 5-15、薑黃 3-12、丹參 8-20 ；本發明藥物原料藥的重量比優選為
白芍6-12 桂枝5-7 薤白5-9 薑黃5-8 丹參9-15。本發明中藥組合物中原料藥的重量比更優選為白芍6桂枝10薤白15薑黃3丹參8。本發明中藥組合物中原料藥的重量比還優選為白芍20桂枝3薤白5薑黃12丹參20。本發明中藥組合物中原料藥的重量比還優選為白芍6桂枝3薤白5薑黃12丹參20。本發明中藥組合物中原料藥的重量比還優選為白芍20桂枝10薤白15薑黃3丹參8。本發明中藥組合物中原料藥的重量比還優選為白芍6桂枝7薤白5薑黃8丹參9。本發明中藥組合物中原料藥的重量比還優選為白芍12桂枝5薤白9薑黃5丹參15。本發明中藥組合物中原料藥的重量比還優選為白芍12桂枝6薤白9薑黃6丹參12。本發明藥物由桂枝、白芍、薤白、丹參、薑黃組成，諸藥合用，可調和營衛，試驗研究證實可有效抑制動脈粥樣硬化的進程。本發明藥物劑型為湯劑、膠囊劑、丸劑、片劑、散劑、口服液、顆粒劑中的一種，為使上述劑型能夠實現，需在製備這些劑型時加入藥學可接受的輔料，例如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑等，填充劑包括澱粉、預膠化澱粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等，崩解劑包括澱粉、預膠化澱粉、微晶纖維素、羧甲基澱粉鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉等，潤滑劑包括硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化矽等，助懸劑包括聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等，粘合劑包括，澱粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等，甜味劑包括糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等，矯味劑包括甜味劑及各種香精，防腐劑包括尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯扎溴銨、醋酸氯乙定、 桉葉油等。本發明中藥組合物的用量，按活性組分原料藥總重量計，為10-45克/日，可每日 1次，也可以每日分2-3次服用。為證實本發明藥物抑制動脈粥樣硬化的活性，用按實施例1方法製得的湯劑(以下稱本發明藥物)進行了下列臨床試驗。1資料與方法1. 1 一般資料1. 1. 1實驗動物雄性純種紐西蘭大白兔125隻，體重(2. 5士0. 5)kg,由第二軍醫大學實驗動中心提供。1. 1.2主要試劑戊巴比妥鈉上海國藥集團公司進口分裝，3g戊巴比妥鈉加入IOOml生理鹽水，配成3%戊巴比妥鈉注射液。PBS 0. 01mmol/L,pH7. 4，雙蒸水配製。II型膠原酶購自Sigma公司，IXPBS配置成ang/ml溶液。青黴素鈉針80萬U/支，上海國藥集團公司。高脂飼料配製膽固醇，3%豬油，2%蛋黃粉，餘為基礎飼料，委託上海斯萊克實驗動物有限公司加工。4%多聚甲醛上海化學試劑有限公司。小鼠抗兔巨噬細胞抗體SM-α-actin抗體: Santa Cruz公司。羊抗鼠CB2多克隆抗體Santa Cruz公司。兔白介素_6定量酶聯檢測試劑盒上海鈺森生物技術有限公司。兔腫瘤壞死因子_α定量酶聯檢測試劑盒上海鈺森生物技術有限公司。1. 2試驗方法1. 2. 1實驗動物分組實驗動物單籠常規餵養，自由飲水，活動不受限制。予高脂飼料餵養2周後測血脂 (總膽固醇，低密度脂蛋白，甘油三脂)，剔除血脂不高者。將紐西蘭大白兔隨機分為正常對照組，外膜損傷模型組、本發明藥物+外膜損傷組。1.2.2動物模型建立方法室溫下進行，3%戊巴比妥鈉(lmL/kg)耳緣靜脈推注麻醉。動物仰臥，頭部及四肢固定於手術臺上。頸前脫毛後常規碘酒、70%乙醇消毒鋪孔巾。縱形切開頸前皮膚，逐層鈍性分離頸部筋膜及肌肉，暴露雙側頸動脈鞘，仔細游離出頸動脈，長約3cm，用消化液浸溼的棉紗外敷左側頸動脈(外膜損傷)30min，90%氯化鈉溶液衝洗、中止消化，用眼科鑷鈍性分離外膜白色疏鬆組織，直至白色疏鬆組織消失。對側為假手術對照。術後皮下注射青黴素 40萬U/dX3d。分別於術後lw、2w、#、8w處死動物，取目標頸動脈，鹽水衝洗後4%多聚甲醛固定，每段血管分成3段，生理鹽水衝洗後4%多聚甲醛固定，分別留做石蠟切片及液氮保存。1. 2. 3HE 染色石蠟包埋標本按3-4 μ m的厚度進行切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，高倍顯微鏡下觀察外膜損傷效果及內膜的病理變化；HE染色的步驟1) 二甲苯 I 脫蠟 IOmin ；2) 二甲苯 II 脫蠟 IOmin ；3)無水乙醇洗去二甲苯IminX2次；4) 95%酒精洗lmin，90%酒精洗Imin ；85%酒精洗lmin，自來水洗^iin ；5)蘇木精染色5min，自來水洗Imin ；6) 鹽酸酒精分化20s ；自來水洗Imin ；7)稀氨水(1% )反藍30s,自來水洗Imin ；8)伊紅染色3min，自來水洗30s ；85%酒精脫水20s ；90%酒精脫水30s ；9) 5% 酒精 I Imin ；95% 酒精 II Imin ；無水乙醇 I 2min ；無水乙醇 II 2min ；10) 二甲苯I 2min ；二甲苯II 2min ；二甲苯III 2min ；中性樹膠封片。染色結果為細胞核呈藍色，細胞漿等呈不同程度紅色。用Image-Pro Plus圖像分析系統計算出血管環管腔橫截面積(LA)、內彈力層圍繞面積(IELA)、外彈力層圍繞面積(EELA)即血管總面積。內膜增生面積(neointima area) = IELA-LA ；中膜面積(media area) = EELA-IELA ；IMR = (neointima area)/(media area)反映內膜增生程度。每個目標血管各取2張切片，每張切片選3個血管環測定各層面積，最後計算6個血管環所得的數據均值作為該標本的最終數值。
1.2.4免疫組化染色石蠟切片方法同前，行SM-α -actin免疫組化染色，了解病變主要細胞成分。免疫組化方法1)載玻片防脫片劑處理選擇多聚賴氨酸，撈片後置烤箱58 60°C 30 60min 以使切片緊密粘附；2)免疫組化技術採用Envision 二步法幻脫蠟石蠟切片置60oC烘片45min，二甲苯脫蠟2次，每次lOmin。梯度乙醇-50%乙醇-水；4)抗原修復切片置切片架上，放入裝有lOmmol/L檸檬酸鹽緩衝液(pH6. 0)的燒杯中，置於微波爐中加熱至沸騰lOmin，取出燒杯，室溫冷卻15min，PBS衝洗5minX3次；5)阻斷內源性過氧化物酶活性0. 3%過氧化氫甲醇溶液室溫下20min，PBS洗 3minX3 次；6)封閉背景抗原加10%正常羊血清室溫下20min，PBS洗1次；7)滴加第1抗體滴加第1抗體後的切片放於溼盒內，37°C孵育1-1. 5h，PBS洗 5minX3 次；8)滴加辣根管過氧化物酶標記的Envision試劑，放於溼盒式內，室溫下30min， PBS 洗 5minX3 次；9)DAB 顯色0. 04% DAB 加 0. 03% H2O2 顯色 15min，充分水洗；10)襯染蘇木精染核lmin，鹽酸乙醇分化數秒，流水衝洗藍化，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；顯微鏡下觀察藍色顆粒為陽性。圖像分析採用Imag印roplus6. 0圖像分析軟體測定斑塊CB2染色陽性區域的平均光密度(MOD)，在每張免疫組化切片隨機選擇3個高倍視野，計算方法為總IOD/(照片面積-空白區域面積)，獲得數據進行統計分析。1.2.5炎性因子含量變化-ELISA法檢測前準備(1)標準品液配製使用前每管中加入蒸餾水200ul溶解。(2)洗滌液用重蒸水1 20稀釋。(3)底物工作液配製顯色前5-10分鐘將OPD片放入底物稀釋液中溶解，每片加液 5ml。(4)組織勻漿實驗前一天將血管組織勻漿，用90%體積RIPA裂解液(PH 8. 0， 50mM Tris HClU% NP-40,,0. 25% sodium deoxycholate、150mMNaCl、ImM EDTA)禾Π 10% 體積的IOmM PMSF進行組織勻漿(10% )，冰上裂解30min，12000X20min後取上清，4°C待用。檢測過程(1)實驗前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫Q0-25°C )。(2)取出所需數量的板條。(3)建立標準曲線設標準孔8孔，每孔中各加入樣品稀釋液lOOul，第一孔加標準品lOOul，混勻後用加樣器吸出lOOul，移至第二孔。如此反覆作對倍稀釋至第七孔，最後， 從第七孔中吸出IOOul棄去，使之體積均為lOOul。第八孔為空白對照。
(4)加樣待測品孔中每孔各加入待測樣品lOOul。(5)將反應板置37°C 120分鐘。(6)洗板用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印幹。(7)每孔中加入第一抗體工作液50ul。(8)將反應板充分混勻後置37°C 60分鐘。(9)洗板用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印幹。(10)每孔加酶標抗體工作液lOOul。(11)將反應板置37°C 60分鐘。(1 洗板同前。(13)每孔加入底物工作液lOOul，置37°C暗處反應5_10分鐘。(14)每孔加入50ul終止液混勻。(15)在492nm處測吸光值。樣本檢測以標準品1000、500、250、125、62. 5,31. 25、15. 62、0pg/ml 之 OD 值在半對數紙上作圖，畫出標準曲線。將濃度作為X軸(對數軸)，0D值作為Y軸(線性軸)。根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應血管組織中IL-6和TNF-α含量。1. 3統計學處理所有圖片在顯微鏡下數碼照相後，用image-pro plus6. 0分析軟體分析。計量資料以Λ±s表示。組間比較採用方差分析；P <0.05為差異具有統計學意義。2 結果2. 1病理檢測結果高脂飲食下給予營衛調節方的紐西蘭兔頸動脈在外膜損傷後1周未見明顯內皮排列紊亂及增生，外膜損傷後2周發生輕度增生性病變，外膜損傷後4-8周，增生性病變逐漸消退。表明本發明藥物可有效抑制外膜損傷致內膜病變，並且可持續(8周)抑制外膜損傷所致內膜病變，結果見圖1。2. 2病變成分SM- α -actin免疫組化染色正常對照組僅有中膜著色，而外膜和內膜並陽性區域不明顯；術後1、2、4、8W外膜損傷組及本發明藥物+外膜損傷組的中膜、內膜均有增生性病變，並且有大量均勻的陽性著色，但是，本發明藥物+外膜損傷組病變均較外膜損傷組明顯減輕，*ρ < 0. 05，結果見圖 2。2. 3血管組織及外周血中炎性因子含量變化IL-6和TNF- α是動脈粥樣硬化病變中重要的炎性因子，兩者在局部血管組織的含量在外膜損傷後第1、2、4、8W均明顯升高(*P<0. 05)，給予本發明藥物幹預後，兩者的水平較外膜損傷組明顯下降(#P< 0.01)，見圖5和圖6。兩者在外周血中的含量與在組織中的變化趨勢相同，見圖7和圖8。表明本發明藥物亦可使IL-6和TNF-α在外周血中的含量降低。3 結論綜上，本發明藥物可以有效抑制外膜損傷致內膜病變，並且可以降低血管組織及外周血中炎性因子，因此，本發明藥物可以有效抑制動脈粥樣硬化的進程，效果顯著，具有較好的應用前景。
圖1本發明藥物對外膜損傷所致動脈粥樣硬化病變的抑制作用與同一時間外膜損傷組比較*P <0. 05,1代表正常對照組，2代表外膜損傷組，3代表本發明藥物+外膜損傷組圖2各組損傷側動脈內SM- α -actin表達與外膜損傷組相比，*P < 0. 05。1代表正常對照組，2代表外膜損傷組，3代表本發明藥物+外膜損傷組圖3血管組織中IL-6含量變化與正常對照組比較，*P < 0. 05 ；與外膜損傷組比較，#ρ<0.01;1代表正常對照組，2代表外膜損傷組，3代表本發明藥物+外膜損傷組圖4血管組織中TNF- α含量變化與正常對照組比較，*Ρ < 0. 05 ；與外膜損傷組比較，#ρ<0.01;1代表正常對照組，2代表外膜損傷組，3代表本發明藥物+外膜損傷組圖5外周血中IL-6含量變化與正常對照組比較，*Ρ < 0. 05 ；與外膜損傷組比較， #Ρ < 0. 01 ； 1代表正常對照組，2代表外膜損傷組，3代表本發明藥物+外膜損傷組圖6外周血中TNF-α含量變化與正常對照組比較，*Ρ < 0. 05 ；與外膜損傷組比較，#ρ<0.01;1代表正常對照組，2代表外膜損傷組，3代表本發明藥物+外膜損傷組
具體實施例方式下述實施例用於舉例說明本發明藥物的應用，但其不能對本發明的範圍構成任何限制。實施例1本發明藥物湯劑的製備處方白芍12克桂枝6克薤白9克薑黃6克丹參12克。製備方法上述藥材，按重量稱取，製成飲片，按照常規湯劑煎制，即得。本發明藥物的用量，上述製成的湯劑為一天服用量，分2次服用。實施例2本發明藥物膠囊劑的製備處方白芍6公斤桂枝10公斤薤白15公斤薑黃3公斤丹參8公斤。製備方法按比例稱取選淨的上述藥材，共同粉碎過80篩，加入1. 8公斤1 %的澱粉糊製成適宜顆粒，18目篩制粒，50°C烘乾，18目篩整粒，裝入膠囊，即得。本發明藥物的用量，為每次2-4粒，每日服用三次。實施例3本發明藥物片劑的製備處方白芍20公斤桂枝3公斤薤白5公斤薑黃12公斤丹參20公斤。製備方法按比例稱取選淨的上述藥材，共同粉碎過80蹄，加入2. 5公斤0.5%的羥丙基甲基纖維素製成適宜顆粒，18目篩制粒，50°C烘乾，18目篩整粒，壓片，即得。
本發明藥物的用量，為每次2-4片，每日服用三次。實施例4本發明藥物丸劑的製備處方白芍6公斤桂枝3公斤薤白5公斤薑黃12公斤丹參20公斤。製備方法按比例稱取選淨的上述藥材，共同粉碎過100蹄，以水泛制為丸，即得。實施例5本發明藥物散劑的製備處方白芍20公斤桂枝10公斤薤白15公斤薑黃3公斤丹參8公斤。製備方法按比例稱取選淨的上述藥材，共同粉碎過100篩，分裝即得。實施例6本發明藥物口服液的製備處方白芍6公斤桂枝7公斤薤白5公斤薑黃8公斤丹參9公斤。製備方法按比例稱取選淨的上述藥材，共同粉碎過20蹄，以100升60%乙醇滲漉的滲漉清膏，濃縮回收乙醇至無醇味，加水調節至相對密度為1. 05,加入0. 01 %的苯甲酸鈉攪拌至溶解，分裝即得。實施例7本發明顆粒劑的製備處方白芍12公斤桂枝5公斤薤白9公斤薑黃5公斤丹參15公斤。製備方法按比例稱取選淨的上述藥材，共同粉碎過20蹄，以100升60%乙醇滲漉的滲漉清膏，濃縮回收乙醇至無醇味，60°C烘乾製成幹膏，粉碎過80目篩，加入入蔗糖5. 5公斤，用適量水製成軟材，16目篩制粒，80°C烘乾，18目篩整粒，分裝即得。
權利要求
1.一種中藥組合物在製備藥物的應用，所述中藥組合物是由如下重量份比例的原料藥製成的白芍6-20、桂枝3-10、薤白5-15、薑黃3-12、丹參8-20 ；其特徵在於該中藥組合物在製備抑制動脈粥樣硬化藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，所述中藥組合物原料藥的重量份比例為白芍6-12桂枝5-7薤白5-9薑黃5-8丹參9-15。
3.根據權利要求1所述的應用，所述中藥組合物原料藥的重量份比例為白芍6桂枝 10薤白15薑黃3丹參8。
4.根據權利要求1所述的應用，所述中藥組合物原料藥的重量份比例為白芍20桂枝 3薤白5薑黃12丹參20。
5.根據權利要求1所述的應用，所述中藥組合物原料藥的重量份比例為白芍6桂枝 3薤白5薑黃12丹參20。
6.根據權利要求1所述的應用，所述中藥組合物原料藥的重量份比例為白芍20桂枝 10薤白15薑黃3丹參8。
7.根據權利要求1所述的應用，所述中藥組合物原料藥的重量份比例為白芍6桂枝 7薤白5薑黃8丹參9。
8.根據權利要求1所述的應用，所述中藥組合物原料藥的重量份比例為白芍12桂枝 5薤白9薑黃5丹參15。
9.根據權利要求1所述的應用，所述中藥組合物原料藥的重量份比例為白芍12桂枝 6薤白9薑黃6丹參12。
10.根據權利要求1-9任一項所述的應用，其特徵在於所述藥物的劑型為湯劑、膠囊劑、丸劑、片劑、散劑、口服液、顆粒劑中的一種。
全文摘要
本發明公開了一種中藥組合物在製備抑制動脈粥樣硬化藥物中的應用。本發明應用所述藥物由傳統中藥桂枝、白芍、薤白、丹參、薑黃製成，具有調和營衛功效。試驗研究證實，可有效抑制動脈粥樣硬化的進展。
文檔編號A61K36/9066GK102309720SQ201010215338
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月2日 優先權日2010年7月2日
發明者吳以嶺 申請人:河北以嶺醫藥研究院有限公司