具有促進成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽及其篩選方法和應用的製作方法

2023-05-30 01:28:26

專利名稱：：具有促進成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽及其篩選方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種多肽，特別涉及一種具有促進成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽，還涉及該多肽的篩選方法和應用。
背景技術：
：成纖維細胞生長因子受體(fibroblastgrowthfactorreceptors,FGFRs)是一類具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受體，與其相應配體成纖維細胞生長因子(fibroblastgrowthfactors,FGFs)結合，在組織器官發育及損傷修復過程中發揮重要作用。目前已發現4種FGFRs,即FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。其中，FGFR3介導軟骨內骨化的負性調節分子，在骨骼發育中具有重要作用。既往研究顯示，FGFR3功能獲得型基因突變導致骨骺生長板中軟骨細胞的增殖和分化受到抑制，引起多種骨骼發育缺陷性遺傳疾病，如軟骨發育不全(ACH)、季肋發育不全(HCH)和致死性骨發育不全(TD)等；而FGFR3功能缺失型基因突變導致骨骺生長板閉合延遲、肥大軟骨區增寬和長骨過度生長等。近年來研究發現，FGFR3在骨性關節炎、骨質疏鬆、骨折等骨骼疾病的發生、發展中也具有重要作用，促進FGFR3活性可以防治骨性關節炎、骨質疏槓、和骨折等骨骼疾病。目前雖已發現23種FGFs,但至今未見僅與FGFR3特異性結合的FGFs。因多肽具有分子量小、空間結構簡單、免疫原性低等優點，故開發能與FGFR3特異性結合併促進其活性的多肽有著良好的應用前景，有望開發成為抗FGFR3功能低下性疾病的藥物。
發明內容有鑑於此，本發明的目的之一在於提供一種具有促進FGFR3活性的多肽；目的之二在於提供所述具有促進FGFR3活性的多肽的篩選方法；目的之三在於提供所述具有促進FGFR3活性的多肽的應用。為達到上述目的，在本發明的第一方面，提供了一種具有促進FGFR3活性的多肽，由Val-Ser-Pro-Pro-Leu-Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu-Ser所示的胺基酸序列組成。在本發明的第二方面，提供了所述具有促進FGFR3活性的多肽的篩選方法，包括以下步驟a、噬菌體12肽庫的生物淘選將噬菌體12肽庫與包淨皮有FGFR3的酶標^1共孵育，用TBST洗去非特異性結合的噬菌體，再用甘氨酸-鹽酸緩衝液洗脫特異性結合的噬菌體，用Tris-HCl緩沖液中和洗脫液，得特異性結合的噬菌體，測定滴度；在宿主菌ER2738中擴增特異性結合的噬菌體，測定滴度，作為下一輪淘選的投入噬菌體；重複上述步驟共進行三輪淘選，富集能與FGFR3特異性結合的噬菌體；b、噬菌體的DNA提取和測序從第三輪淘選出的噬菌體的滴度測定平板上隨機挑取噬菌體單克隆，在宿主菌ER2738中擴增後，提取DNA進行測序，根據所測得的DNA序列推導出噬菌體上展示的外源多肽的胺基酸序列；c、多肽的合成根據所得外源多肽的氨基^列，人工合成多肽；d、多肽的促FGFR3活性檢測檢測多肽對FGFR3活性的促進作用，即得具有促進FGFR3活性的多肽。進一步，所述步驟a的具體方法為用濃度為20pg/mL的FGFR3溶液包被酶標板，溫度4。C包被過夜，棄去包被液，加入濃度為5mg/mL的BSA溶液，溫度37。C封閉1小時，棄去封閉液，用TBST充分洗滌，加入噬菌體12肽庫，室溫下震蕩孵育1小時，棄去非特異性結合的噬菌體，用TBST充分洗滌，加入濃度為0.2M、pH為2.2的甘氨酸-鹽酸緩沖液，室溫下震蕩洗脫8分鐘，吸取洗脫液，加入濃度為1M、pH為9.1的Tris-HCl緩衝液中和，得特異性結合的噬菌體，測定滴度；將ER2738菌接種至LB培養基中，溫度37。C震蕩培養至對數中期，加入特異性結合的噬菌體，溫度37。C震蕩培養，溫度4。C離心，取上清液，再離心，取上清液，加入1/6體積的PEG/NaCl，溫度4。C靜置過夜沉澱噬菌體，溫度4。C離心，棄去上清液，加入TBS重懸沉澱，再離心，取上清液，加入1/6體積的PEG/NaCl,水浴沉澱90分鐘，溫度4。C離心，棄去上清液，加入含有濃度為0.2g/L的疊氮鈉的TBS重懸沉澱，再離心，收集上清液，得擴增的特異性結合的噬菌體，測定滴度，作為下一輪淘選的投入噬菌體；重複上述步驟共進行三輪淘選，富集能與FGFR3特異性結合的噬菌體，其中，第一輪淘選時TBST中Tween-20的濃度為lmL/L，第二輪和第三輪淘選時TBST中Tween-20的濃度才是高至5mL/L;進一步，所述步驟b的具體方法為將ER2738菌接種至LB培養基中，溫度37。C震蕩培養至對數中期，加入從第三輪淘選出的噬菌體的滴度測定平板上隨機挑取的噬菌體單克隆，溫度37。C震蕩培養，離心，取含噬菌體上清液，加入PEG/NaCl，室溫放置，離心，棄上清液，沉澱重懸於^M匕物緩衝液中，加入乙醇，室溫孵育，離心，棄上清液，沉澱用濃度為700mL/L的乙醇洗滌，短暫真空乾燥後重懸於TE中，取該溶液進行DNA序列測定，根據所測得的DNA序列推導出噬菌體上展示的外源多肽的氨基^列。在本發明的第三方面，提供了所述具有促進FGFR3活性的多肽在製備抗FGFR3功能低下性疾病的藥物中的應用。本發明的有益效果在於本發明多肽能與FGFR3特異性結合併促進其活性，且具有分子量小、製備簡單、質量可控、免疫原性低等優點，可以用於製備抗FGFR3功能低下性疾病的藥物，預防或治療FGFR3功能低下性疾病如骨性關節炎、骨質疏;卩>、骨折等，有著良好的潛在應用價值。為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中圖1顯示Westernblot法檢測多肽PI處理ATDC5細胞0.5、1.5、2.5小時後ERK磷酸化水平的變化；圖2顯示Westernblot法檢測多肽P2處理ATDC5細胞0.5、1.5、2.5小時後ERK磷酸化水平的變化；圖3顯示Westernblot法檢測多肽PI處理ATDC5細胞0.5、1.5、2.5小時後P38磷酸化水平的變化；圖4顯示Westernblot法檢測多肽P2處理ATDC5細胞0.5、1.5、2.5小時後P38磷酸化水平的變化；圖5顯示不同濃度的多肽P1處理ATDC5細胞24小時後的細胞增殖情況；圖6顯示不同濃度的多肽P1處理C3H10T1/2細胞24小時後的細胞增殖情況；圖7顯示多肽Pl或P2持續處理ATDC5細胞後的細胞增殖情況。具體實施例方式本發明採用噬菌體展示技術篩選具有促進FGFR3活性的多肽。噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時，外源蛋白或多肽隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術。表達於噬菌體表面的外源蛋白或多肽能與靶分子特異性結合。將靶分子包被於固相載體後進行噬菌體展示肽庫的篩選，就可將表達有相應外源蛋白或多肽的噬菌體從眾多的噬菌體中分離純化出來，而外源蛋白或多肽的胺基酸序列可以通過對噬菌體的DNA測序而獲得。噬菌體展示肽庫的篩選是一個親和純化的生物淘選(biopanning)過程。其具體過程是將噬菌體肽庫與靶分子相互作用一段時間後，洗滌除去非特異結合的噬菌體，再將特異性結合的噬菌體洗脫下來進行擴增，然後投入下一輪淘選，重複34輪淘選，即可獲得與靶分子特異性結合的噬菌體。下面將參照附圖，對優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中使用的FGFR3購自美國sigma公司，噬菌體12肽庫篩選試劑盒(包括ER2738菌種)購自美國NewEnglandLab公司。一、從噬菌體12肽庫中篩選能與FGFR3特異性結合的多肽包括以下步驟a、噬菌體12肽庫的生物淘選用濃度為20pg/mL的FGFR3溶液(濃度為O.IM、pH為8.6的碳酸氫鈉為溶劑)150|iL包被96孔滅菌聚苯乙烯酶標板，溫度4。C包被過夜，棄去包被液，滿孔加入濃度為5mg/mL的BSA溶液(濃度為O.IM、pH為8.6的碳酸氫鈉為溶劑)，溫度37。C封閉1小時，棄去封閉液，用TBST(即含有Tween-20的TBS，第一輪淘選時Tween-20的濃度為lmL/L,第二輪和第三輪淘選時Tween-20的濃度提高至5mL/L)洗滌6次，加入2x10upfo的噬菌體(第一輪淘選時加入噬菌體12肽庫原庫10pL與TBSTlmL的混合液，第二秀&和第三輪淘選時加入前一輪擴增的特異性結合的噬菌體)，室溫下溫和震蕩孵育1小時，棄去非特異性結合的噬菌體，用TBST洗滌10次，加入濃度為0.2M、pH為2.2的甘氨酸-鹽酸緩衝液200joL，室溫下溫和震蕩洗脫8分鐘，吸取洗脫液，加入濃度為1M、pH為9.1的Tris-HCl緩衝液150|iL中和，得特異性結合的噬菌體，測定滴度；將ER2738菌接種至LB培養基20mL中，溫度37。C劇烈震蕩培養至對數中期(OD600值約0.5)，加入特異性結合的噬菌體lOOpL,溫度37。C劇烈震蕩培養4.5小時，溫度4。C、轉速10，000rpm離心IO分鐘，取上清液，再離心5分鐘，取約80%的上層清液(下層含沉澱的清液棄去)，加入1/6體積的PEG/NaCl(由濃度為200g/L的PEG8000和濃度為2.5M的NaCl組成)，溫度4。C靜置過夜沉澱噬菌體，溫度4。C、轉速10,000rpm離心15分鐘，棄去上清液，加入TBSlmL重懸沉澱，再離心5分鐘，取上清液，加入l/6體積的PEG/NaCl,冰浴沉澱90分鐘，溫度4。C、轉速10,000rpm離心10分鐘，棄去上清液，加入含有濃度為0.2g/L的疊氮鈉的TBS200^iL重懸沉澱，再離心1分4申，收集上清液，得擴增的特異性結合的噬菌體，測定滴度；重複上述步驟共進行三輪淘選，富集能與FGFR3特異性結合的噬菌體，第三輪淘選出的噬菌體不再擴增；各輪淘選的噬菌體回收率見表1，由表1可知，經過三輪生物淘選後，特異性結合的噬菌體的得率逐漸增大，表明所淘選的噬菌體得到了選擇性的富集。表l、各輪淘選過程中噬菌體的回收率輪次投入噬菌體(TU)回收噬菌體(TU)回收率12x10118.87x1042.24xl(T722.06x10119.60x1064.8xl(T532.1x10119.30x1084.4x10-3b、噬菌體的DNA提取和測序將ER2738菌接種至LB培養基中，溫度37'C劇烈震蕩培養至對數中期，分取lmL置培養管中，加入從第三輪淘選出的噬菌體的滴度測定平板上隨機挑取的噬菌體單克隆，溫度37。C劇烈震蕩培養4.5小時，離心，取含噬菌體上清液500jiL，加入PEG/NaCl200piL，室溫放置10分鐘，離心10分鐘，棄上清液，短暫離心，小心吸出殘餘上清液，沉澱重懸於硤化物緩沖液100pL中，加入乙醇250pL,室溫孵育10分鐘使單鏈噬菌體DNA沉澱而大多數噬菌體蛋白保留在溶液中，離心10分鐘，棄上清液，沉澱用濃度為700mL/L的乙醇洗滌，短暫真空千燥後重懸於TE(由濃度為0.01M、pH值為8.0的Tris-HCl和濃度為lmM的EDTA組成)30pL中，取該溶液5pL,委託上海生工生物工程技術有限公司進行測序；本實施例隨機挑取45個噬菌體單克隆進行DNA序列測定，根據所測得的DNA序列推導出噬菌體上展示的外源多肽的胺基酸序列；結果發現，23個噬菌體單克隆所展示的多肽具有同樣的胺基酸序列PI:Val-Ser-Pro-Pro-Leu-Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu-Ser(SEQIDNo.l);其餘22個噬菌體單克隆所展示的多肽序列與PI之間也存在極高的同源性，其中包括P2:Val-Thr-Ser-Pro-Thr-Thr-Leu-Pro-Gin-Leu-Met-Ser(SEQIDNo,2)。二、人工合成多肽根據所得外源多肽的胺基酸序列，委託上海華大天源生物技術公司採用標準Fmoc方案固相合成多肽，所得多肽純度均高於95%，置溫度-70。C保存。三、ELISA法4企測多肽與FGFR3的結合實驗目的驗證篩選出的多肽與FGFR3之間的結合作用以及結合強度。實驗方法採用間接ELISA法，在96孔培養板中，每孔加入濃度為lmmol/nL的多肽Pl或P2溶液20^iL和包被液(取碳酸鈉0.3g、碳酸氫鈉0.58g和疊氮鈉0.04g,加水溶解，調節pH至9.6,加水稀釋至200mL,即得)80jiL，溫度4。C包被過夜，棄去包被液，滿孔加入濃度為50g/L的小牛血清溶液(pH為7.4的PBS為溶劑)，溫度37。C封閉40分鐘，棄去封閉液，用PBST(含有濃度為0.5mL/L的吐溫-20的PBS，pH為7.4)洗滌3次，加入濃度為100^ig/mL的FGFR3溶液30pL和pH為7.4的PBS70pL,溫度37。C孵育1小時，用PBST洗滌3次，加入按l:500稀釋的鼠抗FGFR3抗體(美國Sigma公司，質量百分濃度為1。/。的BSA溶液為稀釋溶劑)IOOjjL，溫度37。C孵育1小時，棄去一抗溶液，用PBST洗滌5次，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG(中杉金橋生物試劑公司)10(HiL，溫度37。C孵育30分鐘，棄去二抗溶液，用PBST洗滌5次，加入四曱基聯苯二胺-過氧化氫尿素溶液lOO(iL，溫度37。C避光顯色10分鐘，加入濃度為2M的石危酸溶液終止反應，在波長450nm處測定OD450值，結果以3個復孔的均值表示；同時設置陰性對照組(加入多肽P1包被酶標板，但後續步驟中所有試劑均用pH為7.4的PBS代替)、Pl空白對照組和P2空白對照組(不加入多肽P1或P2包被酶標板，其餘操作不變)。實驗結果見表2，多肽P1和P2都與FGFR3有較高的結合率。tableseeoriginaldocumentpage11四、Westernblot法檢測多肽對FGFR3主要下遊信號通路MAPK的激活情況目前研究已經明確，促分裂原活化蛋白激酶信號通路MAPK是FGFR3下遊最主要的信號通路之一，MAPK的激活情況直接或間接影響細胞的增殖、分化、轉化及凋亡等。在哺乳類細胞，目前已發現存在著下述三條並行的MAPK信號通路，分別為ERK信號通路、p38MAPK通路和JNK/SAPK通路。同一刺激因素可同時激活多條MAPK通路，如應激刺激可同時激活ERK、p38MAPK和JNK/SAPK三條通路，而EGF可同時激活ERK及JNK/SAPK二條通路。並行的MAPK通路之間通過複雜的機制既可相互區別、又能相互調節。實驗目的檢測篩選出的多肽對FGFR3主要下遊信號通路MAPK通路中信號分子的激活情況，以明確多肽調節細胞功能的機制。實驗方法在12孔培養板中，每孔接種1.2x105個前軟骨細胞ATDC5，用含有濃度為50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培養基在溫度為37°C、C02氣體濃度為50mL/L的條件下培養24小時，待細胞貼壁後，吸除培養基，用無血清DMEM/F12培養基沖洗細胞2次，加入無血清DMEM/F12培養基lmL,培養24小時，吸除培養基，加入含有濃度為50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培養基和濃度為10mM的多肽P1或P2溶液使多肽P1或P2的終濃度為2|iM,同時設置空白對照組(不加入多肽P1或P2),分別處理0.5、1.5、2.5小時，收集細胞，用細胞裂解液吹打裂解細胞，於冰上收集細胞勻漿液，採用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；已測濃度的蛋白樣品加入等體積2x上樣緩沖液，煮沸5分鐘，室溫冷卻後進行SDS-PAGE(採用濃度為50g/L的濃縮膠、濃度為卯g/L的分離膠，電泳參數為80V20分鐘、120V80分鐘)，電泳結束後，將蛋白電轉印(恆流300mA60分鐘)至聚偏二氟乙烯膜上，加入濃度為50g/L的脫脂奶粉溶液(TBST為溶劑)，室溫封閉1小時，分別加入ERK、P-ERK(磷酸化ERK)、P38、P-P38(磷酸化P38)或P-actin的一抗，溫度4。C孵育過夜，用TBST洗膜5次，加入辣根過氧化物酶標記二抗，溫度37。C孵育1小時，用TBST洗膜5次，顯色，曝光，定影，檢測ERK或P38磷酸化水平的變化，並與總ERK或P38分子的量做對比，P-actin為內參照。實驗結果見圖1~4,多肽P1對MAPK信號通路中ERK分子的磷酸化水平有促進作用，而對P38分子的磷酸化水平有抑制作用，多肽P2對ERK分子的磷酸化水平也有促進作用，提示多肽Pl和P2有可能是通過調節ERK分子的活性來調節細胞的生理過程。五、MTT法檢測不同濃度多肽對細胞增殖的影響情況實驗目的檢測FGFR3表達細胞經不同濃度多肽作用後的細胞增殖情況。實-瞼方法在96孔培養板中，每孔接種8000個前軟骨細胞ATDC5或間充質細胞C3H10T1/2,用含有濃度為50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培養基在溫度為37。C、C02氣體濃度為50mL/L的條件下培養24小時，待細胞貼壁後，吸除培養基，用無血清DMEM/F12培養基衝洗細胞2次，加入無血清DMEM/F12培養基lmL，培養24小時，吸除培養基，加入含有濃度為50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培養基和濃度為10mM的多肽Pl或P2溶液使多肽Pl或P2的終濃度分別為1、5、10、50、lOOnM，同時設置空白對照組(不加入多肽P1或P2),處理24小時，加入細胞增殖檢測試劑20pL，在溫度為37°C、(302氣體濃度為50mL/L的條件下避光孵育2~6小時，待孔中液體由紫色變為粉色，在570nm波長處測定OD570值，結果以3個復孔的均值表示。實^r結果見表3~4，多肽Pl在較低濃度下對ATDC3和C3H10T1/2兩種細胞的增殖均有促進作用，在l^高濃度下無明顯作用(見圖5~6);而多肽P2對兩種細胞的增殖也有促進作用，^f旦與多肽濃度無明顯相關性。12表3、MTT法檢測多肽P1對細胞增殖的影響情況多肽濃度ATDC5細胞C3H10T1/2細胞10.11780.085850.17880.0370100.09780,0373500.07120.02231000.0357-0.0070空白對照組0-O細l表4、MTT法檢測多肽P2對細胞增殖的影響情況多肽濃度(fiM)ATDC5細胞C3H10T1/2細胞10.12980.04700.21330馬0100.01930.0498500.09530.02831000.00230.0418空白對照組00六、細胞計數法檢測一定濃度多肽對細胞增殖的持續影響情況實驗目的檢測FGFR3表達細胞經一定濃度多肽持續作用後的細胞增殖情況。實驗方法在96孔培養板中，每孔接種3000個前軟骨細胞ATDC5,用含有濃度為50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培養基在溫度為37°C、C02氣體濃度為50mL/L的條件下培養24小時，待細胞貼壁後，吸除培養基，用無血清DMEM/F12培養基衝洗細胞2次，加入無血清DMEM/F12培養基lmL，培養24小時，吸除培養基，加入含有濃度為50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培養基和濃度為10mM的多肽P1或P2溶液使多肽P1或P2的終濃度為2pM，同時設置空白對照組(不加入多肽P1或P2),分別處理l、2、3、4、5天，吸除培養基，加入濃度為2.5g/L的胰酶100^L,消化5分鐘，加入含有濃度為50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培養基200pL終止消化，吹散細胞，取細胞懸液10pL進行細胞計數，結果以3個復孔的均值表示。實驗結果見表5和圖7，多肽P1對前軟骨細胞ATDC5有持續的促增殖作用。表5、細胞計數法檢測多肽Pl和P2對細胞增殖的持續影響情況tableseeoriginaldocumentpage14基於上述實驗結果，可得出如下結論本發明的多肽P1可以與FGFR3特異性結合，並對其活性有明顯的促進作用，可以作為活性成分，單獨-使用或與其它具有藥理活性的化合物和/或提取物組成複方使用，再與藥學上可接受的載體按照藥學領域的常規製劑方法製成各種劑型的抗FGFR3功能低下性疾病的藥物，用於預防和治療FGFR3功能低下性疾病如骨性關節炎、骨質疏鬆、骨折等。最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和範圍。中國人民解放軍第三軍醫大學野戰外科研究所具有促進成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽及其篩選方法和應用21〈211〉12<212〉PRT<213〉人工序列<223〉多肽P11ValSerProProLeuThrLeuGlyGinLeuLeuSer1510<210〉2<211〉12PRT人工序列多肽P2<400〉2ValThrSerProThrThrLeuProGinUuMetSer1510權利要求1、具有促進成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽，其特徵在於由Val-Ser-Pro-Pro-Leu-Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu-Ser所示的胺基酸序列組成。2、權利要求1所述具有促進成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽的篩選方法，其特徵在於包括以下步驟a、噬菌體12肽庫的生物淘選將噬菌體12肽庫與包^皮有成纖維細胞生長因子受體3的酶標板共孵育，用TBST洗去非特異性結合的噬菌體，再用甘氨酸-鹽酸緩衝液洗脫特異性結合的噬菌體，用Tris-HCl緩衝液中和洗脫液，得特異性結合的噬菌體，測定滴度；在宿主菌ER2738中擴增特異性結合的噬菌體，測定滴度，作為下一輪淘選的投入噬菌體；重複上述步驟共進行三輪淘選，富集能與成纖維細胞生長因子受體3特異性結合的噬菌體；b、噬菌體的DNA提耳又和測序從第三輪淘選出的噬菌體的滴度測定平板上隨機挑取噬菌體單克隆，在宿主菌ER2738中擴增後，提取DNA進行測序，根據所測得的DNA序列推導出噬菌體上展示的外源多肽的胺基酸序列；c、多肽的合成衝艮據所得外源多肽的氨基^列，人工合成多肽；d、多肽的促成纖維細胞生長因子受體3活性檢測檢測多肽對成纖維細胞生長因子受體3活性的促進作用，即得具有促進成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽。3、根據權利要求2所述具有促進成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽的篩選方法，其特徵在於所述步驟a的具體方法為用濃度為20pg/mL的FGFR3溶液包被酶標板，溫度4。C包被過夜，棄去包被液，加入濃度為5mg/mL的BSA溶液，溫度37X:封閉1小時，棄去封閉液，用TBST充分洗滌，加入噬菌體12肽庫，室溫下震蕩孵育1小時，棄去非特異性結合的噬菌體，用TBST充分洗滌，加入濃度為0.2M、pH為2.2的甘氨酸-鹽酸緩衝液，室溫下震蕩洗脫8分鐘，吸取洗脫液，加入濃度為1M、pH為9.1的Tris-HCl緩衝液中和，得特異性結合的噬菌體，測定滴度；將ER2738菌接種至LB培養基中，溫度37。C震蕩培養至對數中期，加入特異性結合的噬菌體，溫度37。C震蕩培養，溫度4。C離心，取上清液，再離心，取上清液，加入1/6體積的PEG/NaCl，溫度4'C靜置過夜沉澱噬菌體，溫度4。C離心，棄去上清液，加入TBS重懸沉澱，再離心，取上清液，加入1/6體積的PEG/NaCl，冰浴沉澱90分鐘，溫度4。C離心，棄去上清液，加入含有濃度為0.2g/L的疊氮鈉的TBS重懸沉澱，再離心，收集上清液，得擴增的特異性結合的噬菌體，測定滴度，作為下一輪淘選的投入噬菌體；重複上述步驟共進行三輪淘選，富集能與FGFR3特異性結合的噬菌體，其中，第一輪淘選時TBST中Tween-20的濃度為lmL/L,第二輪和第三輪淘選時TBST中Tween-20的濃度才是高至5mL/L。4、根據權利要求3所述具有促進成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽的篩選方法，其特徵在於所述步驟b的具體方法為將ER2738菌接種至LB培養基中，溫度37。C震蕩培養至對數中期，加入從第三輪淘選出的噬菌體的滴度測定平板上隨機挑取的噬菌體單克隆，溫度37。C震蕩培養，離心，取含噬菌體上清液，加入PEG/NaCl，室溫放置，離心，棄上清液，沉澱重懸於石典化物緩衝液中，加入乙醇，室溫孵育，離心，棄上清液，沉澱用濃度為700mL/L的乙醇洗滌，短暫真空乾燥後重懸於TE中，取該溶液進行DNA序列測定，根據所測得的DNA序列推導出噬菌體上展示的外源多肽的氨基S^列。5、權利要求1所述具有促進成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽在製備抗FGFR3功能〗氐下性疾病的藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種具有促進成纖維細胞生長因子受體3即FGFR3活性的多肽及其篩選方法和應用，該多肽由Val-Ser-Pro-Pro-Leu-Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu-Ser所示的胺基酸序列組成；其篩選方法是將噬菌體12肽庫與包被有FGFR3的酶標板共孵育，洗去非特異性結合的噬菌體，再洗脫特異性結合的噬菌體並擴增，作為下一輪淘選的投入噬菌體，重複上述步驟共進行三輪淘選，提取第三輪淘選出的噬菌體單克隆的DNA進行測序，推導出噬菌體上展示的外源多肽的胺基酸序列，合成多肽，檢測其對FGFR3活性的促進作用，即得具有促進FGFR3活性的多肽；該多肽可用於製備抗FGFR3功能低下性疾病藥物。文檔編號C07K7/00GK101619093SQ200910103959公開日2010年1月6日申請日期2009年5月26日優先權日2009年5月26日發明者何啟芬,瑛餘,戚華兵,杜曉蘭,京楊,楠蘇,謝楊麗,玲趙,旻金,林陳,煒黃申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學野戰外科研究所