一種兩親性γ-聚穀氨酸納米藥物載體的製備方法

2023-05-29 21:44:21 1

專利名稱：一種兩親性γ-聚穀氨酸納米藥物載體的製備方法
技術領域：
本發明涉及高分子與醫用生物材料領域，具體來講是一種具有環境響應特性和疏水核-親水殼結構的Y-聚穀氨酸納米微粒的方法。
背景技術：
目前，基於功能基因組分析的藥物篩選已獲得各種藥物活性物質，如蛋白、多肽、DNA等生物大分子藥物，但這些潛在的候選藥物由於結構複雜，易因環境和載體材料的影響失去藥物活性，而利用兩親性嵌段/接枝聚合物以超分子自組裝的方式實現藥物負載和控緩釋的有效途徑，特別是採用兩親性嵌段/接枝聚合物獲得自組裝載藥納米微粒是目前該領域研究的熱點。從體內安全性考慮，天然高分子材料具有良好的水溶性、生物相容性、生物可降解性和非免疫原性等，用於藥物載體更具優勢。此外，由於天然高分子鏈上通常含有大量游離的功能基團(如羧基和氨基等)，其自身性質(如二級結構、體積、形狀、表面積、力學性能等將)對溫度、離子、pH、酶、電場等環境因子具有一定響應特性。目前，針對多糖及其改性衍生物的聚合物膠束的研究較多，如殼聚糖、支鏈澱粉、透明質酸等。由於高分子多糖水溶性較差，往往還需引入親水基團改善其水溶性，導致改性產物的自組裝性能變差、包封藥物以及控釋藥物的能力減弱，而水溶性小分子多糖藥物負載量不高，應用於藥物載體受到極大限制。聚胺基酸是目前研究較多的另一種重要的功能高分子材料，包括化學法合成的聚胺基酸材料和天然聚胺基酸。目前，基於化學法合成聚胺基酸材料的功能化改性及用於藥物載體的研究較多，如α -聚穀氨酸(穀氨酸單體經α_醯胺鍵結合)(Liang, etal.Biomaterials, 2006，27:2051-2059)、聚天冬氨酸(Yang, etal. BiotechnologyLetter，2005，27，977-982)。作為迄今發現的三種天然聚胺基酸之一，Y-聚穀氨酸(Y -polyglutamic acid,簡稱Y-PGA)是一種由D, L-穀氨酸單體經Y-醯胺鍵結合形成的多聚胺基酸，較化學合成的聚胺基酸具有更好的組織親和性、相容性和可生物降解性能，能被機體吸收、代謝和排洩，不易產生積蓄和毒副作用，初步研究結果已顯示出在藥物傳輸領域的應用潛力(Shih IL, Van YT. Bioresour Technol, 2001，79: 207-225 ;Bajaj I, SinghalR.Bioresour Technol,2011, 102:5551-5561)。微生物發酵法合成的Y-PGA分子量與聞分子多糖相近,分子量在ICTlOOOKDa,但具有更好的水溶性，側鏈修飾後獲得兩親性Y-PGA接枝衍生物，在水介質中可自組裝為穩定的親水殼-疏水核結構，可作為疏水性藥物或活性大分子藥物的理想載體。值得注意的是Y-PGA 二級結構與側鏈羧基的電離度有關，未電離的側鏈羧基對二級結構的分子內氫鍵有穩定作用，當羧基電離時會破壞其氫鍵穩定從而發生結構轉變，具體表現為Y -PGA二級結構對PH非常敏感，在酸性條件下呈平行的β -摺疊片層，在中性條件下呈無規捲曲，而在鹼性條件下是更為收縮的無規捲曲形式(Ashiuchi M, Misono H. Biopolymers[Μ].Weinheimiffiley-VCH, 2002，7:123)，由於人體內各組織的環境pH值各有差別，特別是腫瘤組織的pH值一般低於正常組織，設計針對腫瘤組織或特定器官的pH敏感的給藥系統無疑具有重要的意義和臨床應用價值。除PH敏感特性外，Y-PGA還可被生物體內特異性的Y -醯胺鍵水解酶一穀氨醯轉肽酶(GGT)外切水解為寡聚胺基酸或穀氨酸單體(KimuraK, Tran PL, Uchida I, etal. Microbiology, 2004，150:4115-4123)，而人血清中 GGT 主要來自肝臟，因此，Y-PGA的pH-酶雙重敏感特性使得開發針對特定器官(如肝臟)腫瘤組織的刺激-應答式給藥系統成為可能。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種兩親性Y-PGA納米藥物載體的製備方法。為解決上述技術問題，本發明的思路是以Y-PGA為主鏈，將內源性的疏水基團引入其側鏈游離的羧基上，使獲得的接枝Y -PGA衍生物同時具有優異的生物相容性、生物降 解性和環境響應特性(pH-GGT複合敏感)。將此接枝聚合物溶於水介質中，在超聲條件下，通過分子自組裝原理，可快速形成Y-PGA納米膠束，並可作為蛋白、DNA以及疏水性藥物的良好載體。本發明採用的技術方案如下一種兩親性Y -PGA納米藥物載體的製備方法，該方法包括以下步驟(I)兩親性Y-聚穀氨酸接枝產物的合成(Ia)將Y-聚穀氨酸溶解於溶劑I中，形成l(T20g/L的Y -聚穀氨酸溶液；(Ib)將催化劑加入步驟(Ia)得到的Y-聚穀氨酸溶液中，催化劑與Y-聚穀氨酸中的穀氨酸單體殘基的摩爾比為(12 2. O) :l，50(Tl000r/min反應活化6 12h，形成反應活化液；(Ic)將疏水性修飾物H溶解於溶劑II中，疏水性修飾物H與Y-聚穀氨酸中穀氨酸單體殘基的摩爾比為(O. 2^1. O) :1 ；(Id)將步驟(Ic)得到的疏水性修飾物H溶液於3(T90min內緩慢滴加到步驟(Ib)得到的反應活化液中，l(T40°C、50(Tl000r/min條件下反應12 24h，形成反應液；(Ie)將步驟(Id)得到的反應液加入溶劑III中使Y _聚穀氨酸接枝產物沉澱，溶劑III的體積用量為步驟(Id)得到的反應液體積的廣2倍，過濾收集沉澱，先用溶劑III清洗，再用乙醚清洗，反覆透析-凍幹後得兩親性Y -聚穀氨酸接枝產物；(2)兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體的製備將步驟(Ie)得到的兩親性Y-聚穀氨酸接枝產物加入到pH4 7.5、0. I飛mol/L的磷酸鹽緩衝液中，兩親性Y-聚穀氨酸接枝產物在磷酸鹽緩衝液中的濃度為f5mg/mL，於25 37°C下震蕩12 36h獲得準備液，隨後利用分子組裝的原理，將準備液採用探針型超聲儀於冰水浴中超聲處理後獲得粒徑為20(Tl000nm、粒徑多分散係數PDI為O. Γθ. 5的納米膠束分散液，再經離心或超濾，冷凍乾燥獲得兩親性Y -聚穀氨酸納米藥物載體。步驟(Ia)中，Y-PGA可採用不同分子量的Y-PGA原料(10KDa 1000KDa)，其分子量分布係數應在l.f 2. O之間。步驟(Ia)中，所述的溶劑I 為 0. 3^1. OmoI/L 的 Na2CO3 水溶液、0. 3^1. OmoI/L 的NaHCO3水溶液、磷酸鹽緩衝液(PBS )、二甲亞碸(DMSO )、吡啶、N，N- 二甲基甲醯胺(DMF )、N, N- 二乙基甲醯胺(DEF)和N，N- 二甲基乙醯胺(DMAC)中的任意一種或幾種的混合物。步驟(Ib)中，所述催化劑為碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)中的任意一種或兩種的混合物。步驟(Ic)中，所述的疏水性修飾物H為帶有非極性或疏水側鏈的胺基酸的酯化衍生物、或固醇類化合物、或烷醇、或油醇、或生育酚、或聚(N-異丙基丙烯醯胺)、或糖皮質激素、或阿黴素、或紫杉醇；其中，所述的帶有非極性或疏水側鏈的胺基酸的酯化衍生物為酪氨酸、或色氨酸、或苯丙氨酸、或纈氨酸、或亮氨酸、或異亮氨酸、或脯氨酸、或丙氨酸的酯化衍生物；所述的固醇類化合物為膽留醇；所述的烷醇為辛醇、十二烷醇、十四烷醇或十六烷醇；所述的糖皮質激素為地塞米松或氫化可的松。優選酪氨酸乙酯、纈氨酸乙酯、異亮氨酸乙酯、苯丙氨酸甲酯、膽甾醇、生育酚、聚(N-異丙基丙烯醯胺)、十六烷醇、油醇、阿黴素、紫杉醇、地塞米松。步驟(Ic)中，所述的溶劑II為二甲亞碸(DMS0)、吡啶、N，N-二甲基甲醯胺(DMF)、 N, N-二乙基甲醯胺(DEF)、N, N-二甲基乙醯胺(DMAC)和氯仿中的任意一種或幾種的混合物。步驟(Ie)中，所述的溶劑III為低級醇或丙酮，所述的低級醇為甲醇或乙醇。步驟(2)中，超聲的功率為40 90W，工作2 5s，停I 3s，總時間3 9min。步驟(2)中，所述的離心為高速離心，離心力在IOOOOg以上。步驟⑵中，獲得的兩親性接枝Y-PGA的自組裝性能(膠束形態、粒徑、粒徑分布、臨界膠束濃度)可通過Y -PGA原料的分子量特性、疏水改性基團的選擇以及接枝產物側鏈取代度來調控。上述方法製備得到的兩親性Y -PGA納米藥物載體。上述兩親性Y -PGA納米藥物載體在負載蛋白、DNA以及疏水性藥物中的應用。所述的疏水性藥物為阿黴素、紫杉醇或糖皮質激素等。兩親性Y -PGA納米藥物載體在負載藥物時，一般將要負載的藥物投加至上述兩親性Y -PGA納米藥物載體分散液中，室溫、避光條件下低速振蕩(5(Tl00r/min) 12 24h，利用藥物與載體間的疏水作用、氫鍵作用、靜電作用等實現自組裝Y-PGA納米藥物載體對藥物的負載，採用超濾或透析的方法除去游離的藥物，或以高速離心(> IOOOOg)的方法收集載藥納米膠束，冷凍乾燥後即獲得載藥Y -PGA納米膠束。載藥Y -PGA納米膠束的釋藥行為(環境響應特性)可通過介質pH和是否存在GGT作用來控制。對於阿黴素、紫杉醇或糖皮質激素等疏水性藥物，其本身即可作為疏水接枝基團，可按照本發明所述的兩親性Y-PGA納米藥物載體的製備方法直接製備出兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物從而不再需要利用自組裝原理額外負載藥物的步驟；或者，以阿黴素、紫杉醇或糖皮質激素以外的物質(即帶有非極性或疏水側鏈的胺基酸的酯化衍生物、或固醇類化合物、或烷醇、或油醇、或生育酚、或聚(N-異丙基丙烯醯胺))為疏水性修飾物H，接枝於Y-聚穀氨酸上得到得兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體，再利用自組裝原理負載阿黴素、紫杉醇或糖皮質激素。有益效果本發明與現有技術相比，具有以下優勢
I)本發明所用的Y -PGA可採用微生物發酵法大量合成，所用的側鏈改性基團、催化劑等均可通過市場渠道獲得。2)本發明以醯胺合成與酯化反應中常用的EDC或NHS為催化劑製備兩親性的
Y-PGA接枝衍生物，產量可控，易於放大。3)本發明獲得的兩親性Y -PGA在水介質中的自組裝性能(膠束形態、粒徑、粒徑分布、臨界膠束濃度)可通過Y-PGA原料的分子量特性、疏水改性基團的選擇、接枝產物側鏈的取代度的調控來控制。 4)本發明利用兩親性聚合物自組裝的原理，在超聲條件下製備納米膠束，工藝簡單，易於操作。疏水核-親水殼結構的納米膠束適合於疏水性或生物利用度較差的藥物及生物活性大分子藥物的負載和傳輸，利於保留藥物的活性和提高其生物利用度。5)獲得的Y -PGA納米膠束同時具備環境響應特性(pH-GGT複合敏感)、生物相容性以及可降解性，因而可在藥物控制釋放、生物智能開關等領域具有廣泛的應用。


圖I為本發明方法的Y-PGA接枝改性的化學反應式。圖2為本發明方法的Y -PGA原料(a)及其接枝改性後graft- Y -PGA(b)的紅外譜圖(FTIR)。 圖3為本發明方法的Y -PGA原料(A)及其接枝改性後graft- Y -PGA⑶的1H-NMR譜圖。圖4為實施例2中芘螢光探針表徵Y-PGA接枝改性物兩親性的發射光譜圖。圖5為實施例2中芘螢光探針表徵的特徵峰比值(1372/1385)與Y-PGA接枝改性物濃度的對數圖。圖6為實施例4製備的兩親性Y -PGA納米膠束的投射電鏡照片。圖7為實施例15不同pH的釋藥介質中載藥Y -PGA納米膠束的體外釋藥曲線。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例I :一種兩親性Y -PGA納米藥物載體的製備方法，該方法包括以下步驟。(I)室溫下，將Ig Y -PGA(分子量380KDa，分子量分布係數I. 3)溶解於IOOmL DMSO(溶劑I)中，形成透明的10g/L Y -PGA溶液。(2)按與步驟⑴中所取Y -PGA中穀氨酸單體殘基的物質量之比為I. 2的量稱取EDC加入上述Y -PGA溶液中，並在室溫下於500r/min反應活化12h，形成反應活化液。(3)按與步驟⑴中所取Y -PGA中穀氨酸單體殘基的物質量之比為O. 4的量稱取膽甾醇，溶於IOOmL等比例混合的DMSO-吡啶(溶劑II)中。(4)將步驟(3)得到的含膽甾醇的溶液於30min內緩慢滴加到步驟(2)得到的反應活化液中，30°C下於50(Tl000r/min反應12h，形成反應液。
(5)將步驟⑷得到的反應液加入到I倍體積的丙酮中，使Y -PGA接枝產物沉澱。過濾收集沉澱，先用甲醇(或乙醇)清洗，再用乙醚清洗，反覆透析-凍幹後得合成產物。根據產物1H-NMR圖譜分析，側鏈取代度約為22%。實施例2 溶劑I採用I. OmoI/L磷酸鹽緩衝液(PBS)，催化劑EDC用量與所取Y -PGA中穀氨酸單體殘基的物質量之比為2. 0，膽留醇用量與所取γ-PGA中穀氨酸單體殘基的物質量之比為I. O外，其他條件同實施例I。該條件下製備的Y -PGA接枝產物的FTIR與1H-NMR如圖2(b)和圖3(B)所示。根據1H-NMR圖譜分析，側鏈取代度約為37%。採用芘螢光探針法考察該條件下製備的Y-PGA接枝改性產物的兩親性及臨界膠束濃度(CMC)，其芘發射光譜如圖4所示，芘螢光探針表徵的特徵峰比值(1372/1385 )與
Y-PGA接枝改性物濃度的對數圖如圖5，變化的轉折點(即兩條直線的交點)對應的濃度即為 CMC (O. 027mg/mL)o 實施例3 將實施例I的合成產物，加入到pH4. O的lmol/L PBS緩衝液中，使得合成產物濃度為lmg/mL，於25°C下低速震蕩12h，隨後用探針型超聲儀於冰水浴中超聲處理，工作2s，停2s，超聲時間2min，重複3次，獲兩親性Y -PGA納米膠束的分散液，再通過14000g離心收集沉澱-冷凍乾燥步驟即可獲得兩親性Y-PGA納米膠束。電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態較規則；平均粒徑約為220nm，粒徑多分散係數(PDI)為 O. 35。實施例4 將實施例I的合成產物，加入到pH7. 42mol/L的PBS緩衝液中，其餘同實施例3。該條件下製備的納米膠束的投射電鏡照片如圖6所示，平均粒徑約為350nm、形態規則、粒徑分布較為均一；粒徑分析儀的測定結果與電鏡觀測結果基本一致，其粒徑多分散係數(PDI)為 O. 16。實施例5:除原料Y -PGA的分子量為lOOOKDa，分子量多分散係數I. 4，兩親性Y -PGA接枝產物的製備同實施例1，CMC濃度的測定同實施例2，兩親性Y-PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 014mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y -PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為780nm，粒徑多分散係數(PDI)為O. 42。實施例6 除疏水性修飾物H採用酪氨酸乙酯，兩親性Y -PGA接枝產物的製備和CMC濃度的測定同實施例2，兩親性Y-PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 033mg/mL ;電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y -PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為260nm，粒徑多分散係數(PDI)為O. 19。實施例7 溶劑I採用等比例混合的吡唆、N，N- 二甲基甲醯胺(DMF)的複合溶劑，溶劑II採用等比例混合的N，N- 二甲基乙醯胺(DMAC)和氯仿的複合溶劑，疏水性修飾物H採用十六烷醇，催化劑採用EDC (催化劑與Y-PGA中穀氨酸單體殘基的物質量之比為I. 2)，其餘兩親性Y -PGA接枝產物的製備條件和CMC濃度的測定同實施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 056mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y -PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為210nm，粒徑多分散係數(PDI)為O. 22。實施例8 溶劑I採用N，N-二乙基甲醯胺(DEF)，溶劑II採用等比例混合的N，N-二甲基乙醯胺(DMAC)和氯仿的複合溶劑，疏水性修飾物H採用油醇，催化劑採用EDC (催化劑與Y -PGA中穀氨酸單體殘基的物質量之比為I. 5)，其餘兩親性Y-PGA接枝產物的製備條件和CMC濃度的測定同實施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 008mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為440nm，粒徑多分散係數(PDI)為O. 28。實施例9 溶劑I採用N，N- 二甲基乙醯胺(DMAC)，溶劑II採用N，N- 二甲基甲醯胺(DMF)，疏水性修飾物H採用生育酚，其餘兩親性Y-PGA接枝產物的製備條件和CMC濃度的測定同實施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 013g/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為520nm，粒徑多分散係數(PDI)為O. 20。實施例10 溶劑I採用I. OmoI/L的NaHCO3水溶液，溶劑II採用N，N- 二乙基甲醯胺(DEF)，疏水性修飾物H採用聚(N-異丙基丙烯醯胺)，催化劑採用NHS (催化劑與Y -PGA中穀氨酸單體殘基的物質量之比為I. 5)，其餘兩親性Y-PGA接枝產物的製備條件和CMC濃度的測定同實施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 011mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為370nm，粒徑多分散係數(PDI)為O. 17。實施例11 溶劑I採用N，N-二乙基甲醯胺(DEF)，溶劑II採用N，N-二乙基甲醯胺(DEF)，疏水性修飾物H採用氫化可的松，催化劑採用EDC (催化劑與Y-PGA中穀氨酸單體殘基的物質量之比為I. 2)，其餘兩親性Y-PGA接枝產物的製備條件和CMC濃度的測定同實施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 041mg/mL ;電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為310nm，粒徑多分散係數(PDI)為 O. 16。實施例12 將實施例4製備的兩親性Y -PGA納米膠束分散於ρΗ7· 4的PBS溶液中(10g/L)。以卵清蛋白(OVA)作為負載的模型蛋白藥物，按終濃度3mg/ml的量投加OVA至上述兩親性
Y-PGA納米藥物載體的分散液中，室溫、避光、100r/min條件下振蕩12h，14000g離心收集沉澱，冷凍乾燥即得負載OVA的Y -PGA納米膠束。並採用Lowry法測定離心上清液游離的OVA或沉澱中包含的OVA (即裝載的0VA)，Y-PGA納米膠束的載藥量=負載藥物量/納米載體質量(μ g/mg)，包封率=(負載藥物量/投加藥物量)X 100%。根據上式計算得Y -PGA納米膠束對OVA的載藥量為145 μ g/mg，包封率為45%。實施例13 以鹽酸阿黴素作為負載藥物，按終濃度5mg/ml的量投加至實施例4製備的兩親性Y-PGA納米膠束的分散液中(10g/L),室溫、避光、50r/min條件下振蕩12h，透析、冷凍乾燥後即得載藥Y-PGA納米膠束。計算得Y-PGA納米膠束對阿黴素的載藥量為K^yg/mg，包封率為79%。實施例14 以地塞米松磷酸鈉作為負載藥物，按終濃度5mg/ml的量投加至實施例4製備的兩親性￥- 64納米膠束的分散液中(1(^/1)，室溫、避光、501'/1^11條件下振蕩12h，透析、冷凍乾燥後即得載藥Y -PGA納米膠束。計算得Y -PGA納米膠束對地塞米松的載藥量為26 μ g/mg，包封率為75%。實施例15 將實施例12製備的Y -PGA載藥(OVA)納米膠束分散於不同pH的PBS緩衝溶液中，考察介質PH對其體外釋藥特性的影響。實驗結果表明兩親性的Y-PGA納米膠束具有PH敏感的特性，具體表現為其釋藥行為對介質pH條件具有響應特性在pH7. 4的PBS溶液中OVA釋放較慢，12h內的釋藥率僅為19. 6 %，84h內的釋藥率為42. I %，無突釋現象；而在PH4. O與pH8. O的PBS溶液中，釋放速率明顯增加(如圖7所示)。實施例16 除原料Y -PGA的分子量為lOKDa，分子量多分散係數I. 1，兩親性Y -PGA接枝產物的製備條件和CMC濃度的測定同實施例2，兩親性Y-PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 010mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y -PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為180nm，粒徑多分散係數(PDI)為O. 17。實施例17 疏水性修飾物H採用十二烷醇，催化劑採用EDC (催化劑與Y -PGA中穀氨酸單體殘基的物質量之比為2. 0)，其餘兩親性Y-PGA接枝產物的製備條件和CMC濃度的測定同實施例7，兩親性Y -PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 019mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為310nm，粒徑多分散係數(PDI)為O. 32。實施例18 除疏水性修飾物H採用十四烷醇，催化劑採用EDC (催化劑與Y -PGA中穀氨酸單體殘基的物質量之比為I. 5)，兩親性Y -PGA接枝產物的製備和CMC濃度的測定同實施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 027mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為290nm，粒徑多分散係數(PDI)為 O. 26。實施例19 除疏水性修飾物H採用纈氨酸乙酯，兩親性Y -PGA接枝產物的製備和CMC濃度的測定同實施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 039mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為305nm，粒徑多分散係數(PDI)為O. 16。實施例20:除疏水性修飾物H採用苯丙氨酸甲酯，兩親性Y -PGA接枝產物的製備和CMC濃度的測定同實施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 055mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為405nm，粒徑多分散係數(PDI)為O. 29。實施例21 溶劑I採用L OmoI/L的NaHCO3水溶液，溶劑II採用等比例混合的N，N- 二甲基乙醯胺(DMAC)和DMSO溶液，疏水性修飾物H採用阿黴素，催化劑採用NHS (催化劑與Y -PGA中穀氨酸單體殘基的物質量之比為I. 2)，其餘兩親性Y-PGA接枝產物的製備條件和CMC濃度的測定同實施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的製備同實施例4。CMC為O. 044mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態較規則、平均粒徑約為333nm，粒徑多分散係數(PDI)為O. 38。
實施例22 將實施例4製備的兩親性Y-PGA納米膠束分散於pH7. 4的PBS溶液中(IOg/L)。以質粒DNA (pEGFP :其中含有編碼綠色螢光蛋白的報告基因)作為負載模型藥物(50 μ g/100ul)，取載體分散液與質粒DNA溶液等比例混合，其餘同實施例12。測定游離的質粒DNA濃度，計算得包封率為96%。
權利要求
1.一種兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體的製備方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟 (1)兩親性Y-聚穀氨酸接枝產物的合成 (Ia)將Y-聚穀氨酸溶解於溶劑I中，形成l(T20g/L的Y-聚穀氨酸溶液； (Ib)將催化劑加入步驟(Ia)得到的Y-聚穀氨酸溶液中，催化劑與Y-聚穀氨酸中的穀氨酸單體殘基的摩爾比為(12 2. 0) :l，50(Tl000r/min反應活化6 12h，形成反應活化液； (Ic)將疏水性修飾物H溶解於溶劑II中，疏水性修飾物H與Y-聚穀氨酸中穀氨酸單體殘基的摩爾比為(0. 2 I. 0):1 ; (Id)將步驟(Ic)得到的疏水性修飾物H溶液於3(T90min內緩慢滴加到步驟(Ib)得到的反應活化液中，l(T40°C、50(Tl000r/min條件下反應12 24h，形成反應液； (Ie)將步驟(Id)得到的反應液加入溶劑III中使Y-聚穀氨酸接枝產物沉澱，溶劑III的體積用量為步驟(Id)得到的反應液體積的f 2倍，過濾收集沉澱，先用溶劑III清洗，再用乙醚清洗，反覆透析-凍幹後得兩親性Y -聚穀氨酸接枝產物； (2)兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體的製備 將步驟(Ie)得到的兩親性Y-聚穀氨酸接枝產物加入到pH4 7.5、0. f 5mol/L的磷酸鹽緩衝液中，兩親性Y-聚穀氨酸接枝產物在磷酸鹽緩衝液中的濃度為f5mg/mL，於25 37°C下震蕩12 36h獲得準備液，隨後利用分子組裝的原理，將準備液採用探針型超聲儀於冰水浴中超聲處理後獲得粒徑為20(Tl000nm、粒徑多分散係數PDI為0. f 0. 5的納米膠束分散液，再經離心或超濾，冷凍乾燥獲得兩親性Y -聚穀氨酸納米藥物載體。
2.根據權利要求I所述的兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體的製備方法，其特徵在於，步驟(Ia)中，所述Y-聚穀氨酸的分子量為10KDa 1000KDa,其分子量分布係數應在I.1 2. 0之間。
3.根據權利要求I所述的兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體的製備方法，其特徵在於，步驟(Ia)中，所述的溶劑I為0. 3^1. OmoI/L的Na2CO3水溶液、0. 3^1. OmoI/L的NaHCO3水溶液、磷酸鹽緩衝液(PBS )、二甲亞碸(DMSO)、吡啶、N，N- 二甲基甲醯胺(DMF)、N，N- 二乙基甲醯胺(DEF)和N，N- 二甲基乙醯胺(DMAC)中的任意一種或幾種的混合物。
4.根據權利要求I所述的兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體的製備方法，其特徵在於，步驟(Ib)中，所述催化劑為碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)中的任意一種或兩種的混合物。
5.根據權利要求I所述的兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體的製備方法，其特徵在於，步驟(Ic)中，所述的疏水性修飾物H為帶有非極性或疏水側鏈的胺基酸的酯化衍生物、或固醇類化合物、或烷醇、或油醇、或生育酚、或聚(N-異丙基丙烯醯胺)、或糖皮質激素、或阿黴素、或紫杉醇；其中，所述的帶有非極性或疏水側鏈的胺基酸為或酪氨酸、或色氨酸、或苯丙氨酸、或纈氨酸、或亮氨酸、或異亮氨酸、或脯氨酸、或丙氨酸；所述的固醇類化合物為膽甾醇；所述的烷醇為辛醇、十二烷醇、十四烷醇或十六烷醇；所述的糖皮質激素為地塞米松或氫化可的松。
6.根據權利要求I所述的兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體的製備方法，其特徵在於，步驟(Ic)中，所述的溶劑II為二甲亞碸(DMS0)、吡啶、N，N-二甲基甲醯胺(DMF)、N，N-二乙基甲醯胺(DEF)、N，N-二甲基乙醯胺(DMAC)和氯仿中的任意一種或幾種的混合物。
7.根據權利要求I所述的兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體的製備方法，其特徵在於，步驟(Ie)中，所述的溶劑III為低級醇或丙酮。
8.根據權利要求I所述的兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體的製備方法，其特徵在於，步驟(2)中，超聲的功率為40 90W，工作2 5s，停I 3s，總時間3 9min。
9.根據權利要求I所述的兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體的製備方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述的離心為高速離心，離心力在IOOOOg以上。
10.權利要求I所述方法製備得到的兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體。
11.權利要求10所述的兩親性Y-聚穀氨酸納米藥物載體在負載蛋白、DNA以及疏水性藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種兩親性γ-聚穀氨酸納米藥物載體的製備方法，即以γ-聚穀氨酸為主連結枝疏水性基團，從而獲得一種生物相容性好、可降解的兩親性γ-聚穀氨酸衍生物，在水介質中可自組裝形成粒徑為200～1000nm的納米膠束，其疏水核-親水殼結構有利於提高疏水性藥物在水介質中的溶解度，進而有望提高藥物在體內的生物利用度，此外還可以用於蛋白及DNA的負載。本發明所述γ-聚穀氨酸納米微球的製備方法簡單易行，原料均可工業化生產，重現性好，且載藥率高，具有良好的緩釋效果和環境智能響應(pH-酶複合敏感)等相應特性，具有很好的推廣應用價值。
文檔編號A61K47/34GK102698279SQ201210230209
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月3日 優先權日2012年7月3日
發明者姚俊, 曹新, 阮文輝, 陳寬婷, 魏欽俊, 魯雅潔 申請人:南京醫科大學