一種用於男性免疫避孕的多肽的製作方法

2023-05-29 19:08:56 2

專利名稱：一種用於男性免疫避孕的多肽的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術，具體涉及免疫避孕技術，尤其是男性免疫避孕技術。
背景技術：
目前，男性避孕可選方法少，不能很好地滿足很多男性願意參與避孕的熱情(參 見Hoesl et al. ， 2005)，免疫避孕由於多方面的優點而被研究者們關注和研究。但總體上 看來，目前還沒有一種理想的免疫避孕製劑，主要包括以下方面不足①避孕藥物不同於疾 病治療藥物，人們對避孕藥物效果的要求是接近100%。而就目前所研究的靶點來看，單獨 針對一種抗原進行免疫避孕，最高有效率(完全不孕或不育)為80%左右，還不夠理想(劉 以訓，2004);②以一些在各組織廣泛表達的抗原為靶點產生的抗體，會產生一些毒副作用。 所以，要研發免疫避孕製劑並被人們所接受，提高免疫避孕的避孕效果並減少其可能的毒 副反應是很有必要的。目前，研究者們主要從兩方面來解決免疫避孕的這些不足從免疫技 術和途徑等方面著手，致力於提高免疫對生殖的幹擾作用並避免或減輕其毒副作用；另一 方面則是尋找避孕效果好而毒副作用小的新靶點。
目前用於免疫避孕研究的靶點主要有三大類
①激素(Delves， 2004)，如P -HCG， LHRH， GnRH等； ②精子特異性抗原(Frayne and Hall， 2004)，如fertilization antigen-1， sperm protein (SP)_10， SP_17， sperm-associated antigen 9， protein A_kinase anchoring protein, testis-specific antigen— l等； ③卵子透明帶抗原(zona pellucida， ZP) (Gupta et al. ， 2004)，該抗原用於免疫
避孕研究較多，目前主要在確定效果更好而副作用小的B細胞表位，提高免疫避孕的效果等。 精子特異性抗原是免疫避孕的一類靶點，尤其是在精子生理功能中起重要作用的 膜蛋白。CatSperl是精子尾部主要鈣離子流IeatSpCT的通道，與精子運動密切相關，是超活化 所必需的，並在受精的多個環節起作用，對該靶點進行免疫避孕，應該有很好的避孕效果； 而且CatSperl僅表達於睪丸和精子，其毒副作用比促性腺激素類及其他廣泛表達的抗原 靶點要小。 儘管目前已經有一些避孕方法可供選用，但世界人口增長的趨勢仍在繼續，現已 經超過65億(World POPClock Projection, online available from URL :http: //www-census, gov/main/www/卿clock. html/),並按10億/10年的速度在增長，其中95%的人 口增長在發展中國家，人口的迅猛增長造成了許多難以克服的生態學、經濟學問題(Naz et al. ，2005)。我國人口約佔世界人口的21%，人口過多仍是首要問題，成為制約國民經濟和 社會發展、安全的關鍵問題(劉以訓，2004)。計劃生育工作艱巨而重要，"控制人口數量，提 高人口素質"是我國的一項基本國策。另外，不管在哪個國家，在當前的避孕方法和條件下， 非意願妊娠對人類健康和經濟的損害仍是不可忽視的問題。全世界每天約有91萬次受孕 發生，其中50%是未計劃的，有15萬例以墮胎而告終，其中有500例墮胎婦女以死亡為代價
3(郭應祿，鍾辛成，2002)。所以，不管是發達國家，還是發展中國家，都需要一種很好有效的 避孕方法。尋找新的避孕途徑及方法，尤其是男性避孕，既是目前國內外避孕研究的關鍵與 發展趨勢，在我國也有很大的社會意義和價值。 免疫避孕是以在精子發生、受精、著床等過程中起重要作用的物質(多為蛋白或 多肽)為抗原，免疫產生相應抗體後通過幹擾生殖過程用於避孕的方法。印度已有避孕疫 苗通過臨床實驗，也表明了免疫避孕用於避孕的實際可行性。而且，免疫避孕除了具備避孕 的基本條件外，如作用可逆，使用方便等，還有著較好的優勢和發展前景①可能是女用，也 可以是男用。現存的男子避孕方法非常有限，目前已有的可行途徑有輸精管結紮術和使用 保險套。而避孕是男女雙方共同的責任，男子不僅僅能與配偶分享利益，也應該共同承擔計 劃生育的風險。近來公眾對男子參與避孕的興趣顯著提高，有相當比例的成年男性有參與 避孕的熱情(郭應祿，鍾辛成，2002)。②一次免疫的避孕作用時間比現在常用的避孕藥物 長，所以使用間隔時間較長，不需要很頻繁的使用，更容易被人們所接受。DNA疫苗的成功研 制更是能延長免疫避孕的使用間隔時間。③體內的免疫反應能用簡單可靠的檢測方法來監 測。④免疫避孕不僅可用於人類的計劃生育，還能用於控制動物的數量。如歐洲兔子和澳 大利亞赤狐的數量控制。⑤國內外近期的研究如嵌合肽、DNA疫苗、利用新的分子佐劑(如 C3d)等的研究，成功解決了免疫避孕中的一些缺陷，我國在這些方面都有成功的經驗可以 借鑑。 但是，目前免疫避孕還存在一些不足之處。最受關注的就是免疫避孕的有效率，單 獨針對一種抗原進行免疫避孕，目前最高有效率(完全不孕或不育)為80%左右，還不夠理 想(劉以訓，2004)。而且，目前免疫避孕的靶點，尤其是被證實在體內有較好避孕效果的靶 點很少(劉以訓，2004)。所以，研究新的、效果好而副作用小的免疫避孕靶點是免疫避孕研 究的一大趨勢。 CatSperl與精子運動直接相關，是精子超活化及穿過透明帶所必需的；也是雄性 生育所必需的鈣離子通道，敲除CatSperl的雄性小鼠完全不育(Ren et al. ，2001 ;Calson etal. ，2003)。研究(Kirichok et al. ，2006)表明，CatSperl是精子尾部的主要f丐離子流 的通道，CatSperl基因敲除小鼠精子尾部的主要鈣離子流消失，所以這種鈣離子流被命名 為Lc，這種鈣離子流也是精子超活化運動所必需的。②特異性表達於睪丸組織和成熟精 子尾部主段，在其他器官沒有發現表達。正由於CatSperl這兩大特點，CatSperl在被克隆 時被命名為"cation channel of sperm"，意為"精子特異性陽離子通道"。也是基於這兩大 特點，有關CatSperl的研究幾乎都提出了以下誘人的研究前景是開發副作用小而有效的 避孕藥具的耙點，而且這種避孕藥具可以是男性使用，也可能是女性使用。CatSperl基因敲 除小鼠的研究結果更支持了這一觀點精子尾部的鈣離子流I^^r消失(Kirichok etal.， 2006)，精子活力差，獲能後無"鞭打"樣運動，喪失穿過透明帶的能力，完全不育；且其他系 統未見異常，睪丸組織無病理改變，有精子發生，精子中其他已知鈣離子通道分布也未受影 響。 但如何以CatSperl為靶點進行避孕呢？目前尚未見報導，也沒有特異性的拮抗 劑，近期的研究(Kirichok et al. ， 2006)表明L型鈣離子通道拮抗劑如尼莫地平、硝苯 地平等對CatSperl的功能並無明顯的阻斷作用。作為在精子功能及精卵結合方面起重 要作用，且定位於精子膜上的精子特異性抗原，我們推測免疫避孕可能成為可行有效的途徑。雖然目前還未見以精子離子通道進行免疫避孕的報導(主要有兩個方面原因一方面 是由於精子的形狀和運動性，使常用的研究離子通道的方法不便使用；另一方面則是目前 所發現的離子通道中，被敲除後能致動物完全不育的離子通道罕見)，但離子通道自身免疫 性疾病(Langand Vincent, 2003)卻表明，用針對離子通道的抗體阻斷其功能是有效可行 的。如神經突觸前抗鉀離子通道自身抗體引起神經性肌強直(NMT)，抗鈣離子通道自身抗 體引起朗-愛二氏肌無力綜合症(LEMS)，肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)，心肌病等。基於 CatSperl在精子功能中的特殊作用及其表達的高度特異性，免疫避孕的實際可行性，結合 免疫避孕的發展趨勢，本發明試驗觀察抗CatSperl跨膜區及胞外段的抗體在體外對人精 子功能和小鼠精子體外授精能力的影響，探討CatSperl跨膜區及胞外段用於免疫避孕的 可能性。

發明內容
本發明的任務是提供一種用於男性免疫避孕的多肽。
實現本發明的技術方案是 本發明提供的這種用於男性免疫避孕的多肽，具有序列表中序列1所示的胺基酸
序列，或為與序列表中序列1所示胺基酸序列有79%以上同源性的胺基酸序列。 序列表中序列1所示的胺基酸序列序，或與序列表中序列1所示胺基酸序列有
79%以上同源性的胺基酸序列，配以製藥學上可接受的佐劑，即為用於男性免疫避孕的藥
物製劑.3本發明實驗資料一、材料與方法(一)試劑抗CatSperl多克隆抗體3Santa Cruze (CA， USA)FITC標記羊抗兔IgGSanta Cruze (CA， USA)Ham z s F-10Biosource(CA， USA)SpermRinseVitrolife(AB， Sweden)IVF-30Vitrolife(AB， Sweden)孕馬血清(PMSG)杭州動物藥品廠(杭州，中國)人促絨毛膜性腺激素(HCG)杭州動物藥品廠(杭州，中國)礦物油Sigma (St. Louis， USA)考馬斯亮藍G250Sigma (St. Louis， USA)疊氮鈉Sigma (St. Louis， USA)PBS(O. 01M， pH 7. 4)自備(與抗CatSperl多克隆抗體的儲存液相同pH 7.4，含0. 1%疊氮鈉和0. 1%明膠)0. 22%考馬斯亮藍G250溶液自備稱取0. 22g考馬斯亮蘭G250顆粒，加入100ml 3.5% (V/V)的高氯酸水溶液中，混勻溶解，過濾，備用a :抗體編號為SC-33153,免疫動物所用抗原為人CatSperl的跨膜區及胞外段(481 780aa)，見圖l，抗體能與人和鼠的CatSperl結合
(二)主要儀器低速自動平衡離心機(LDZ5-2型) 北京醫用離心機廠5
5% C02培養箱(MC0-15AC型)日本三洋公司恆溫水浴箱(DK-S22型)上海精宏實驗設備廠操淨工作檯(FLC-3型)哈爾濱市東聯公司計算機輔助精液分析系統北京偉力新世紀科技發展有限公司(JY9000型)電子天平(AE-240型)上海梅特勒_託利多儀器有限公司螢光顯微鏡(BX-41型)日本奧林巴斯倒置顯微鏡(XDS-1B型)重慶光電儀器有限公司解剖顯微鏡(SZll型)日本奧林巴斯解剖顯微鏡(SZ-1145型)日本奧林巴斯(三)實驗對象1.精液標本人精液標本均取自同濟醫學院附屬同濟醫院生殖醫學中心，按世界衛生組織標準(WHO, 1999)選取正常精液標本。
2.實驗動物 本實驗選用10 12周齡的雌雄性BALB/c小鼠，雄鼠體重26士3g，雌鼠體重 21±2g。購自湖北省衛生防疫站動物中心，分籠飼養。動物自由攝食飲水，控制動物房溫度 20 25t:，按白天/黑夜各12h的規律予以日光燈照明。 [OO51](四)實驗方法 1.抗CatSperl多克隆抗體與人、小鼠精子結合特異性觀察 小鼠精子取自12周齡雄性BALB/c小鼠附睪尾部取附睪尾部置生理鹽水中洗滌 後放入lml 37"預熱的SpermRinse中，無菌眼科剪縱向剪2_3下，置37°C ， 5% C02培養箱 中孵育15min使精子遊出。 人精子和小鼠精子4%中性甲醛固定30min後塗片，間接螢光免疫組織化學方法 觀察抗CatSperl多克隆抗體與人、小鼠精子結合的特異性，一抗濃度為1 : 200。
2.人精子優化(上遊法) 精液37t:液化30min後，參照文獻(WHO， 1999)用上遊法優化精子。操作在操淨工 作臺上進行(室溫25 30°C )，主要步驟為 (1)在液化精液中加入等體積37t:預熱的Ham' s F_10，用一次性巴斯德(無菌) 吸管充分混勻； (2)室溫500g離心15min ; (3)棄上清，留約為沉澱3倍液體； (4)用200 iil吸頭反覆吹打，充分混勻沉澱； (5)取300iU已混勻沉澱置一 10ml尖低離心管底部，沿管壁緩慢加入1.5ml 37t:預熱的SpermRinse ; (6)將離心管緩慢斜放於一燒杯內(離心管與水平面成45。角)，小心將燒杯放入 5% C02培養箱內； (7)45-60min後小心拿出燒杯，取交界處雲霧狀部分即為優化精子； (8)用計算機輔助精液分析系統分析(帶37t:保溫臺)優化精子的活力(即WHO定義的a+b級精子)和密度，在本試驗中，要求優化精子活力大於70%，並用37t:預熱的SpermRinse調整密度為5 10個/高倍(目鏡40X)視野。
3.人精子體外培養及處理 在兩EP管中加入等體積的優化精子，每管50-100 iU，再分別加入等體積的抗CatSperl多克隆抗體(終濃度為50 y g/ml，濃度由預實驗確定)和0. 01M PBS(與抗CatSperl多克隆抗體的儲存液相同；pH 7. 4，含0. 1 %疊氮鈉和0. 1 %明膠)，分別定為抗CatSperl多克隆抗體處理組和對照組。在EP管蓋上用無菌眼科剪尖扎一小孔，EP管放入37 °C ， 5 % C02培養箱內培養。
4.精子功能檢測 精子凝集抗CatSperl多克隆抗體處理組和對照組精子體外培養2h後，輕輕搖動EP管，取8 ill置載玻片上，蓋上蓋玻片(18mmX 18mm)，在普通光學顯微鏡下觀察有無精子凝集發生。 精子活力抗CatSperl多克隆抗體處理組和對照組精子體外培養lh、2h、4h後，用10 吸頭輕輕吹打混勻精子懸液，取8 置載玻片上(37°C預熱)，蓋上蓋玻片(18mmX 18mm)，用計算機輔助精液分析系統(帶37。C保溫臺)分析精子活力(即WHO定義的a+b級精子)。 精子超活化運動參數抗CatSperl多克隆抗體處理組和對照組精子體外培養5h後，用lOiU吸頭輕輕吹打混勻精子懸液，取5iU置一新的EP管中，用37t:預熱的SpermRinse調整密度為1 2個/高倍(40X)視野。將計算機輔助精液分析系統物鏡調為40X ，隨機選取視野並捕獲單個前向運動精子，分析其超活化運動參數，包括曲線速度(curvilinearvelocity， V(X)，直線速度(straight progressive velocity, VSU禾口平均路徑速度(average path velocity, VAP) ， VSL與VAP的比值即為前向性(straightnessoftrajectory， STR)。每例標本獲取20 30個精子的超活化運動參數，參照文獻(Quillet al. ，2003)比較精子超活化運動參數的變化超活化運動精子的VCL和STR值分別定義為已液化而未進行上遊的精子的第90X和第10X分位數值，這些精子用Ham' s F-IO洗滌後重懸於37t:預熱的SpermRinse中，立即同以上方法檢測精子的超活化運動參數。以VCL為縱作標，以STR為橫作標，將各個精子的超活化運動參數做成散點圖。以所定義的VCL和STR值確定各組超活化運動的精子數。 頂體反應抗CatSperl多克隆抗體處理組和對照組精子體外培養5h後，用10吸頭輕輕吹打混勻精子懸液，取10iU精子懸液滴於載玻片上塗片晾乾，用0. 22%考馬斯亮蘭G250染液浸染至少30min，雙蒸水衝洗，晾乾，高倍鏡(目鏡40X)下完整視野計數至少200個精子。精子頂體反應率計算參照文獻(陸海一，等.，2002 ;Sato et al. ，2003)。
5.抗CatSperl多克隆抗體對小鼠精子體外授精能力的影響 間隔48h分別給雌性小鼠腹腔注射PMSG和HCG各10IU/只，於HCG注射後16h取出雙側輸卵管於Ham' s F-10液滴內。用無菌針頭剌破輸卵管，可見卵丘細胞團流出，將細胞團移入已置37t:和5% C02平衡過夜的IVF-30液滴內，在37。C和5% C02條件下孵育30min以使卵丘細胞團散開。將散開的卵細胞分放於IVF-30液滴內(每液滴體積為40 y 1，放入5-8枚卵)，置37°C 、5% C02繼續培養，備用。 用37"預熱的SpermRinse調整小鼠附睪尾部精子密度為50 100 X 106個/ml。懸液根據精子是否經抗CatSperl多克隆抗體預處理分為兩組(各30 yl):抗CatSperl多克隆抗體處理組的精子加入抗CatSperl多克隆抗體(終濃度50 y g/ml)，對照組的精子加入等體積0.01M PBS (與抗CatSperl多克隆抗體的儲存液相同pH 7.4，含0. 1%疊氮鈉和0. 1 %明膠)，於37°C 、5% C02條件下共孵育90min。從兩組精子懸液中各取5 y 1加入含卵細胞的IVF-30液滴內，繼續置培養箱中培養。24h後分別計數兩組的受精卵數目。
卵細胞受精標準卵內有雙原核；卵周隙有兩個極體；或者見卵裂跡象。
6.統計學分析 活力及頂體反應數據以;ks表示，進行方差齊性檢驗，用配對t檢驗分析；體外受精試驗結果及超活化運動精子數量用x2檢驗比較。所有統計結果以P < 0. 05(雙側)為差異有顯著性。
二、結果 —、抗CatSperl多克隆抗體與人、小鼠精子結合特異性 本發明實驗所用的抗CatSperl多克隆抗體(SC-33153,克隆號H300)是以人CatSperl蛋白靠近C端的481 780胺基酸為抗原，見圖l。 Santa Cruze公司提供的說明書介紹該抗體也能與小鼠、大鼠的CatSperl結合。本實驗結果證實了這一點，該抗體與人和小鼠精子均結合於精子尾部主段，未發現非特異性結合，見圖2。
二、抗CatSperl多克隆抗體對人精子功能的影響 精子凝集抗CatSperl多克隆抗體組和對照組精子體外培養2h後，顯微鏡下無精子凝集發生。 精子活力經上遊法優化精子，與50 g/ml抗CatSperl多克隆抗體共孵育，lh後精子活力(即WHO定義的a+b級精子)即有顯著下降，見圖3a，經配對t檢驗統計分析，精子與50 g/ml抗CatSperl多克隆抗體共孵育lh、2h、4h後，活力下降，與對照組相比，差異有顯著性意義(P < 0. 005，見圖3a)，且活力的降低主要表現為a級精子即快速前向運動精子減少，與對照組相比，各時間點的差異均有顯著性意義(P < 0. 01或P < 0. 005，見圖3b)。
精子超活化運動參數圖4顯示50 ii g/ml抗CatSperl多克隆抗體與人精子共孵育對精子超活化運動的影響，孵育5h後，超活化運動精子數很少，在所檢測的來源於9例標本中的203個a級或b級精子中，僅1個精子運動參數達到所劃定的超活化運動標準。對照組共檢測了 181個精子，有11個精子運動參數達到超活化運動標準。50 ii g/ml抗CatSperl多克隆抗體對人精子超活化運動有明顯的抑制作用(x2檢驗，P < 0. 05)。見圖4
頂體反應50 g/ml抗CatSperl多克隆抗體與人精子共孵育5h後，頂體反應率與對照組差別無顯著性意義(11. 7±4. 3vs. 12. 1±4. 0， P = 0. 61)。
三、抗CatSperl多克隆抗體對小鼠精子體外受精能力的影響，見圖5。
圖5顯示兩組受精卵與未受精卵數目的比較。其中，在授精前經50iig/ml抗CatSperl多克隆抗體預處理90min，受精率為45. 8% (77/168)，與對照組相(80.4%，123/153)比較，經x2檢驗，差異有顯著性意義(P < 0. 05)。 由於免疫避孕的主要應用還是致力於人口控制，本發明實驗首先觀察了抗CatSperl抗體體外對人精子功能的影響。CatSperl蛋白在精子中主要位於細胞膜上，其N端和C端被認為是在細胞內的，所以我們選用了針對跨膜區和膜外段的抗體，是活體細胞中抗體所能到達並結合的區域。跨膜區和膜外段是離子通道的重要功能區，根據抗離子通道抗體所引起的自身免疫性疾病患者外周血中抗體所針對的位點研究，針對該區域的抗體能阻斷離子通道的功能。 本發明實驗結果表明，所用的抗CatSperl抗體體外對人精子功能的影響主要是對前向運動和精子超活化運動的顯著性抑制作用，而且這種對精子運動的抑制作用不是由於引起精子凝集而導致的；抗CatSperl抗體體外對人精子頂體反應也沒有影響。所以，抗CatSperl抗體在體外對人精子功能的影響是特異性的，而不是廣泛地抑制精子的功能，與CatSperl敲除小鼠精子功能缺陷的方面是一致的主要表現為前向運動比野生型差，不能發生超活化運動而喪失授精能力(Ren et al. ，2001 ;Calson et al. ， 2003)。本實驗還用螢光免疫組織化學方法觀察了我們所選用的抗體與人和小鼠精子的結合部位，結果表明抗體結合在精子尾部主段，與CatSperl在人(Li et al. ，2006)和小鼠(Ren et al. ，2001)精子中的分布是一致的。所以，綜合本發明實驗所用抗體對人精子功能抑制的表現和抗體與人精子結合的部位，說明本實驗所用抗體能特異性結合CatSperl，並能阻斷該通道的功能。
本發明實驗進一步觀察該抗體對小鼠精子授精能力是否有影B向，雖然該抗體所用的抗原是人CatSper 1的跨膜區和膜外段，但小鼠和人CatSper 1在該區域的同源性很高(Ren et al. ，2001):跨膜區有81 %相同，93%相似，孔區有89%相同，100%相似，見圖6，圖7。 SantaCruze公司所提供的說明書也說明該抗體能與小鼠的CatSperl結合。體外受精實驗結果表明，終濃度為50yg/ml的該抗體與小鼠精子體外孵育90min後，能抑制小鼠精子的體外授精能力，抑制率將近35% 。進一步表明針對CatSperl跨膜區和膜外段的抗體可以通過阻斷該通道的功能，影響精子功能而抑制精子的體外授精能力，是用於免疫避孕的可選靶點。本發明實驗所用的抗體是針對人CatSperl的跨膜區S2-S6、孔區及C末端，由於C末端在細胞內，所以，對於活體細胞，抗體所能接觸並起作用的區域是S2-S6和孔區，因此，S2-S6和孔區是免疫避孕的有效部位，本發明實驗說明，精子特異性陽離子通道抗原能用於免疫避孕。


圖1為人CatSperl蛋白的一級結構及跨膜區、孔區的分布.Sl-S6代表六個跨膜區，P代表孔區，下劃線部分(481-780aa)為本實驗所用抗CatSperl多克隆抗體所針對的抗原，包括了跨膜區S2-S6及孔區。 圖2為抗CatSperl多克隆抗體與人(a，b)、小鼠(e，f)精子的結合。結合於精子尾部主段，無非特異性結合.c， d為陰性對照間接螢光免疫組織化學方法X400
圖3為抗CatSperl抗體體外對人精子活力(WHO定義的a+b級，圖a)和快速前向運動(WHO定義的a級，圖b)的影響.與對照組相比，# :P < 0. 005，* :P < 0. 01 (配對t檢驗，n = 9) 圖4為抗CatSperl抗體(50 y g/ml)體外對人精子超活化運動的影響. 一個點代表一個精子.超活化運動精子的VCL和STR值分別定義為已液化而未進行上遊的精子(圖a)的第90%和第10%分位數值，在本實驗中分別為89. 08和81. 02.圖b、c分別為對照組和抗體處理組精子培養5h後精子活化運動情況 圖5為抗CatSperl抗體對小鼠精子體外授精能力的影響.與對照組相比，* :P< 0. 05 (x2檢驗)，圖5顯示兩組受精卵與未受精卵數目的比較。其中，在授精前經50 ii g/
9ml抗CatSperl多克隆抗體預處理90min，受精率為45. 8% (77/168)，與對照組相(80. 4%，123/153)比較，經x2檢驗，差異有顯著性意義(P < 0. 05)。 圖6為人和小鼠CatSperl的跨膜區、膜外段的同源性，有底紋胺基酸為相同的胺基酸。 圖7為製備抗體所用抗原序列人CatSperl第481 670胺基酸與小鼠相應區域序列的同源性，a為人CatSperl第481 670胺基酸；b為小鼠CatSperl第385 576胺基酸，圖中單下劃線為跨膜區，雙下劃線為孔區，字體加粗胺基酸為與人相同的序列，二者的同源性為79. 69%。
具體實施例方式
實施例1 1.目的片段克隆 針對小鼠CatSperl (Genebank accesion number :AF407332)孔區至C末端設計引物，在引物中引入酶切位點。引物序列為 上遊弓l物5，-cgctcaca|tatggctcggtacacctttgga-3，(豎線為Ndel酶切位點)；
下遊弓l物5， _cgcact|cgagtcacttctgttgatgctgttcta-3，(豎線為Xhol酶切位點)。 PCR擴增PCR體系主要組分終濃度為10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50mmol/L KCl，2mmol/L MgC12， 200 ii mol/L dNTPs， 0. 5IU高保真DNA聚合酶(大連寶生物公司)，0. 4iimol/L引物，O. 2ii g小鼠cDNA。 94。C預變性8min後進入循環，前5個循環為98°C變性10sec，53。C退火10sec，72。C延伸80sec ;後30個循環為98。C變性10sec，58。C退火10sec，72t:延伸80sec。產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳鑑定後，用Invitrogen公司凝膠回收試劑盒回收純化產物，目的片段長度為1187bp。 產物經Ndel和Xhol雙酶切後連入pET28a質粒(Novagen公司)中，用氯化f丐法轉化大腸桿菌DH5a ，挑取白色菌落進行鑑定。 挑取白色菌落，用T7通用引物進行PCR鑑定，挑取能擴增出約1250bp的菌落，過夜培養後，以常規快速質粒提取法提取質粒，用Ndel和Xhol (大連寶生物公司)雙酶切鑑定，挑取能酶切出1175bp片段的質粒，命名為pET28aCatl，以T7通用引物進行全自動序列測定，測序結果表明克隆到的CatSperlcDNA序列正確。
2.誘導CatSperl表達、鑑定與純化 將為重組質粒pET28aCatl和空質粒pET28a用氯化鈣法分別轉化大腸桿菌BL21。常規培養，用lmM IPTG i秀導CatSperl表達，加入IPTG 3h後，室溫12000g離心菌液lmin，沉澱懸於1 X SDS上樣緩衝液中，沸水浴3min，室溫12000g離心lmin，取上清上樣於10 %聚丙烯醯胺凝膠，電泳後經考馬斯亮藍染色和Western Blot鑑定。 產物純化用Novagen公司的鎳離子螯合層析柱，按說明書操作純化表達產物。
3.免疫動物 經純化蛋白用無菌生理鹽水溶解，配製成50ii g/100iU。將每100iU uPA溶液與等體積Santa Cruz公司的福氏佐劑混勻乳化。首次免疫選用福氏完全佐劑，之後加強免疫用福氏不完全佐劑。
動物分組及免疫清潔級正常成年雄性昆明小鼠，體重25士5g，由湖北省疾病預防控制中心實驗動物中心提供。隨機分兩組，每組12隻對照組，皮下多點注射100 生理鹽水與等量福氏佐劑乳化液；實驗組，皮下多點注射100 純化蛋白與等量福氏佐劑乳化液。注射每兩周一次，共三次，首次免疫使用完全福氏佐劑，後兩次使用不完全福氏佐劑。
小鼠免疫三次後飼養一周，以乙醚麻醉後內眥靜脈取血，用ELISA法進行抗體效價檢測。採用比值法分析小鼠血清抗CatSperl抗體效價。在同一稀釋度下，根據公式(實驗組0D值-對照組0D值)/ (安慰劑對照組OD值-陰性對照組OD值)進行計算，比值>
2. 1判定為陽性，1. 5 <比值< 2. 1判定為可疑，比值< 1. 5判定為陰性。
4.避孕效果觀察 交配實驗於雄鼠免疫三次後開始，每日清晨以少量37t:溫育後生理鹽水對雌鼠進行陰道灌洗細胞塗片，X250倍顯微鏡下觀察，結合外陰外觀，判定雌鼠所處發情周期時程。選取處於發情前期與發情期的雌鼠，於晚上7時開始與相應編號雄鼠按照合籠，次日清晨7時檢查雌鼠陰栓，未見陰栓者以少量37t:溫育後生理鹽水行陰道灌洗塗片顯微鏡下查精子。以雌鼠查見陰栓或鏡下見精子判定為交配成功，記錄後另籠飼養；合籠雌鼠未見陰栓及精子者繼續觀察發情周期安排再次合籠。交配成功的雄鼠休息1 2天再安排下次合籠，交配失敗的雄鼠可以當日繼續安排合籠。合籠四次均失敗的雄鼠判定為不育，放棄交配。
雌鼠交配成功後另籠飼養，於交配成功後第l日開始計算，第14日脫頸椎處死，解
剖查看子宮狀態和胎仔數目。 實驗結果 1.目的片段克隆 重組質粒pET28aCatl，經測序證實克隆到的CatSperlcDNA序列正確。
2. CatSperl表達 重組質粒pET28aCatl轉化大腸桿菌BL21後，經常規培養，加入IPTG 3h後，10%聚丙烯醯胺凝膠電泳後經考馬斯亮藍染色，與對照(空質粒pET28a)比較，出現約41kD蛋白條帶，Western Blot鑑定為CatSperl 。產物純化後，經聚丙烯醯胺凝膠電泳掃描後分析，結果表明，目的產物佔95.7%。
3.抗體效價 共做了 1 : 1280、1 : 2560、1 : 5120、1 : 10240四個稀釋度，實驗組每隻小鼠血清在每個稀釋度，與對照組0D值比值均大於2. l，即抗CatSperl抗體為陽性，可見實驗組每隻小鼠血清抗CatSperl抗體效價均達到1 : 10240以上。
4.避孕效果 實驗組與對照組交配率均為100%，說明注射及其他處理對雄鼠交配能力無影響。對照組致孕率為100%，平均胎仔數為11，而實驗組12隻雄鼠中，僅1隻雄鼠使1隻雌鼠懷孕，胎仔數為13。 以下為人CatSperl第481 670胺基酸序列(序列l)和小鼠CatSperl第385
576胺基酸序列(序列2)的序列表。 序列表 〈110〉華中科技大學 〈120〉精子特異性陽離子通道抗原在免疫避孕中的應用
〈130>1〈160>2〈170>PatentIn version 3.3〈210>1〈211>190〈212>PRT〈213〉人類〈400>1MetAla LeuAspSerliePhePheCyslieTyrValValGluAlaLeu151015LeuLys lielieAlaLeuGlyLeuSerTyrPhePheAspPheTrpAsn202530AsnLeu AspPhePhelieMetAlaMetAlaValLeuAspPheLeuLeu354045MetGin ThrHisSerPheAlalieTyrHisGinSerLeuPheArglie505560LeuLys ValPheLysSerLeuArgAlaLeuArgAlalieArgValLeu65707580ArgArg LeuSerPheLeuThrSerValGinGluValThrGlyThrLeu859095GlyGin SerLeuProSerlieAlaAlalieLeulieLeuMetPheThr100105110CysLeu PheLeuPheSerAlaValLeuArgAlaLeuPheArgLysSer115120125AspPro LysArgPheGinAsnliePheThrThrliePheThrLeuPhe130135140ThrLeu LeuThrLeuAspAspTrpSerLeulieTyrMetAspSerArg145150155160AlaGin GlyAlaTrpTyrlielieProlieLeulielieTyrlielie165170175lieGin TyrPheliePheLeuAsnLeuVallieThrValLeu180185190〈210>2〈211>192〈212>PRT〈213〉鼠〈400>2MetVal LeuAspSerliePheLeuSerlieTyrValLeuGluAlaVal151015LeuLysLeulieAlaLeuGlyLeuGluTyrPheTyrAspProTrpAsn202530AsnLeuAspPhePhelieMetValMetAlaValLeuAspPheValLeu354045LeuGinlieAsnSerLeuSerTyrSerPheTyrAsnHisSerLeuPhe505560ArglieLeuLysValPheLysSerMetArgAlaLeuArgAlalieArg65707580ValLeuArgArgLeuSerlieLeuThrSerLeuHisGluValAlaGly859095ThrLeuSerGlySerLeuProSerlieThrAlalieLeuThrLeuMet100105110PheThrCysLeuPheLeuPheSerValValLeuArgAlaLeuPheGin115120125AspSerAspProLysArgPheGinAsnliePheThrThrLeuPheThr130135140LeuPheThrMetLeuThrLeuAspAspTrpSerLeulieTyrlieAsp145150155160AsnArgAlaGinGlyAlaTrpTyrlielieProlieLeuMetlieTyr165170175lieVallieGinTyrPheliePheLeuAsnLeuVallieAlaValLeu180185190
1權利要求
一種用於男性免疫避孕的多肽，具有序列表中序列1所示的胺基酸序列。
2. —種用於男性免疫避孕的多肽，其特徵在於，該多肽具有與序列表中序列l所示氨 基酸79%以上的同源性。
3. —種用於男性免疫避孕的藥物製劑，由權利要求1或2所述的多肽和製藥學上可接 受的佐劑組成。
全文摘要
本發明提供了一種用於男性免疫避孕的多肽，該多肽具有與人CatSper1第481～670胺基酸序列79％以上的同源性，配以製藥學上可接受的佐劑，即為用於男性免疫避孕的藥物製劑。
文檔編號C07K14/435GK101747424SQ20081023689
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月19日 優先權日2008年12月19日
發明者李紅鋼, 熊承良 申請人:華中科技大學