一個控制水稻抽穗期基因OsEHD4及其突變體和應用的製作方法

2023-06-24 06:40:31

專利名稱：一個控制水稻抽穗期基因OsEHD4及其突變體和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，涉及一個控制水稻抽穗期基因0sEHD4及其突變體和應用。
背景技術：
開花(水稻表現為抽穗)是高等植物從營養發育向生殖發育階段的重要轉變，主要由自身遺傳機制和環境信號共同影響。植物通過感知隨季節同步變化 的周圍環境(如日照長短和溫度等)來完成有性繁殖。開花時間(水稻中稱為抽穗期)同時也是一個重要的農藝性狀，它決定了作物種植的季節性和地域適應性。水稻(Oryza sativa L.)作為我國乃至世界最重要的糧食作物之一，其產量的提高對解決未來全球糧食問題具有十分重要的戰略意義。長期以來，傳統的雜交育種由於在品種間地域適應性的不同造成了種質資源多樣性局限，從而大大限制了水稻產量和品質等重要農藝性狀的進一步提高。因此研究水稻開花調控的分子遺傳機理對於水稻品種改良及品種推廣具有重要的應用意義。通過植物育種家和植物學家近百年來對開花的研究發現，植物的開花時間受很多因素的影響，主要包括光周期、溫度及雨水等外界因素和植物生理狀況(如年齡和葉片數)等內部因素(Baurle 等，The timing of developmental transitions inplants, Cell, (2006) :655-664)。其中，光周期是影響植物開花最重要的環境信號之一。光周期途徑是指植物具有感知日照長短並且利用它來決定起始開花的合適時間。根據對光周期的感知能力，植物可以分為長日作物、短日作物和中日作物。擬南芥是一種長日模式植物，它在長日條件下開花更早，在短日條件下開花會延遲；而水稻，一種短日模式作物，在短日條件下開花更早，在長日條件下開花延遲，同時，還具有臨界日長響應。過去的幾十年，人們對開花的遺傳機制了解得更加深入。GIGANTEA(GI)-CONSTANT(CO)-FLOWERING LO⑶S T(FT)途徑在控制擬南芥光周期開花中起著核心作用，而這條途徑在水稻中也存在(Yano, M. et al. (2000) Plant Cell 12, 2473 - 2483; Takahashi, Y. , Shomura, A. , Sasaki, T. &Yano, M. (2001)Proc Natl Acad Sci USA 98, 7922 - 7927;Kojima,S,, Takahashi, Y. &Kobayashi, Y. (2002)Plant Cell Physiol 43,1096 - 1105)。然而，水稻和擬南芥對光周期響應不同的生物學現象暗示它們可能受到不同的遺傳機制調控。在水稻中，由Ehdl介導了一條獨特的開花途徑。Ehdl不存在於擬南芥中。藉助於QTL檢測和大量突變體的研究，已經克隆了一些調控水稻開花的基因(Doi，K. et al. (2004)Genes.Dev. 18, 926-936 ;Xue,ff. Y. et al. (2007) Nat. Genet. 40, 761 - 767; Wei, X. J. et al. (2010)Plant. Physiol. 153，1747 - 1758)。它們主要調控Ehdl的表達水平來調節開花時間，暗示在水稻光周期開花的調控上，Ehdl扮演著重要角色。迄今為止,在水稻、小麥、大麥、玉米、大豆、棉花、菸草、玉米、向日葵、番茄、黃瓜、馬鈴薯、桑樹等幾乎所有高等植物中都發現了開花相關的突變體。其突變基因直接或間接影響開花時間，特別是光周期和節律鍾途徑，導致各種生理及發育上的缺陷，從而引起植物開花時間的改變。抽穗期突變體是研究水稻地域適應性利用的理想材料。目前，雖然在水稻中已鑑定出一些抽穗期突變體和QTL位點，但大多數研究僅局限於基因的初步定位。深入研究這些抽穗期突變體的突變基因對於擴大水稻品種間地域適應性利用效率和提高雜交稻遺傳多樣性具有重要的應用價值。本研究通過對一個組織培養變異的水稻抽穗期突變體ehd4基因的圖位克隆和功能分析，從分子水平揭示了控制水稻抽穗期性狀的分子機理，且系統研究了該基因與成花素基因的關係，提出了利用0sEHD4基因進行水稻抽穗期遺傳改良的方法。

發明內容
本發明的目的是提供一個控制水稻抽穗期基因0sEHD4。本發明的另一目的是提供控制水稻抽穗期基因0sEHD4的突 變基因。本發明的友誼目的是提供控制水稻抽穗期基因0sEHD4及其突變基因的應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現一個控制水稻抽穗期基因0sEHD4，它來自水稻，長度為8707bp，相應編碼CCCH類鋅指蛋白的832個胺基酸，其全序列為SEQ ID NO. 1，其CDS序列如SEQ ID NO. 2所示。所述的控制水稻抽穗期基因0sEHD4在水稻品種改良中的應用。所述的控制水稻抽穗期基因的突變基因osehd4,它來自水稻(Oryza sativa L.),⑶S序列長度為2499bp，序列見SEQ ID No. 4，相應編碼832個胺基酸，包含水稻鋅指蛋白基因0sEHD4的第22位胺基酸的突變位點由色氨酸Trp (TGG)突變為終止密碼子(TAG)，該基因全序列見SEQ ID NO. 3。所述的控制水稻抽穗期基因的突變基因osehd4在水稻品種改良中的應用。用常規雜交或轉基因的方法將osehcM基因轉移到野生型材料中，可獲得含有0sEHD4/osehd4雜合基因型，抽穗期較野生型稍晚的材料。可以調整水稻品種的地域適應性，為擴大水稻兩系雜交稻制種的遺傳多樣性和可能性提供了技術基礎。有益效果I、本發明公開了一種水稻鋅指蛋白突變基因(osehcM基因)及其應用。該基因來自水稻(Oryza sativa L.),可作為目的基因導入水稻,使抽穗期延遲,或通過雜交選育,獲得生育期適宜不同地區的水稻品種。檢測出連鎖標記Ehd4-MAS(與晚抽穗突變體中的ehd4基因的突變位點共分離)，在水稻雜交育種中，利用Ehd4-MAS (SEQ ID NO. 19，20)分子標記輔助選擇晚抽穗0sehd4基因。2、本發明人提供的osehcM基因功能是參與植物的光周期開花途徑，mRNA表達分析表明osehd4基因在水稻中組成性表達。3、本發明的osehd4基因來自水稻，所編碼的蛋白質具有轉錄激活和核酸結合活性，其僅在稻屬中具有較高的同源性，是水稻特有的開花時間調控基因。其中motif(CCCH)存在於高等動物和植物中。4、利用野生型0sEHD4基因作為目的基因構建植物表達載體，其轉化可使晚抽穗突變體的水稻品種恢復正常。提供了 osehcM基因的轉基因應用方法。5、用轉基因的方法將osehd4基因轉移到野生型材料中，可獲得含有0sEHD4/osehd4雜合基因型，具有較野生型晚抽穗的材料，為用於水稻兩系雜交稻制種的可能性提供了技術基礎。


圖I.本發明的育種應用表型A圖是ehd4突變體，野生型的田間表型圖；B圖表示0sEHD4突變位點，雜合位點及野生型純合位點在Kita_ake和Nipponbare遺傳背景下的表型，其中，WT表示相應材料的野生型，ehd4表示含有突變位點的突變體，HETE表示雜合型；橫坐標ND表示自然條件，SD表示短 日照條件，LD表示長日照條件。圖2. 0sEHD4的精細定位和轉基因互補T2代結果。A圖是0sEHD4初定位位點圖；B圖表示0sEHD4的精細定位區間；C表示0sEHD4的精細定位區間內候選基因；D圖表示0sEHD4基因結構；E圖表示轉基因互補表型,其中，橫坐標Kita-ake表示野生型粳稻Kita_ake,ehd4表示含有突變基因osehd4的水稻，#26、#34、#18、#24分別表示轉基因株系，pEhd4 Ehd4表示自身啟動子驅動0sEHD4全長cDNA，pUbi Ehd4表示Ubi啟動子驅動0sEHD4全長cDNA。圖3.插入目的基因的雙元載體pCUbil390的質粒圖譜，其中pEhd4 Ehd4表示自身啟動子驅動0sEHD4全長cDNA，pUbi Ehd4表示Ubi啟動子驅動0sEHD4全長cDNA。
具體實施例方式實施例I水稻鋅指蛋白突變基因的分子克隆I、突變基因osehd4位點的定位利用水稻晚抽穗突變體ehd4與抽穗正常的野生型水稻品種培矮Kita-ake進行正反雜交，得到的F2群體進行遺傳分析，結果表明ehd4的晚抽穗表型由隱性單基因控制。從ehd4突變體與9311衍生的BC1F2群體(25，000株)中，選取了 871個晚抽穗隱性單株用於該突變體基因精細定位(圖I)。2007年夏在中國農業科學院作物科學研究所網室種植，在抽穗時期鑑定表型，同時取樣提取DNA。從BC1F2群體中隨機挑出12個極端晚抽穗隱性單株和12個正常抽穗單株，用候選標記對這個小群體進行PCR擴增，而後分析候選標記與突變位點的連鎖關係。發現位於第3染色體中部的SSR標記引物RM14282、RM14308 (RM系列引物公知公用，見網站WWW. gramene. org)與突變基因連鎖。進一步利用水稻基因組數據挖掘和設計了 5 對 SSR 和 indel 引物，編號為 RM14286, EJ-4, EJ-5, RM6439，和 RM14302 隨後將目的基因定位到物理距離為103kb的區間內(圖2)。表I用於本發明精細定位及分子標記輔助選擇的引物
權利要求
1.一個控制水稻抽穗期基因0SEHD4，它來自水稻，長度為8707bp，相應編碼CCCH類鋅指蛋白的832個胺基酸，其全序列為SEQ ID NO. 1，其⑶S序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.權利要求I所述的控制水稻抽穗期基因0sEHD4在水稻品種改良中的應用。
3.權利要求I所述的控制水稻抽穗期基因的突變基因osehd4，核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示，其CDS序列如SEQ ID NO. 4所示。
4.權利要求3所述的控制水稻抽穗期基因的突變基因osehcM在水稻品種改良中的應用。
全文摘要
本發明屬於基因工程技術領域，涉及一個控制水稻抽穗期基因OsEHD4及其突變體和應用。該基因編碼一個CCH類鋅指蛋白，野生型基因序列如SEQIDNO.1所示，在長、短日照條件下都促進開花。突變基因基因的DNA序列如SEQIDNO.3所示。通過轉基因實驗證明了該基因具有使水稻抽穗期提前的功能。
文檔編號C12N15/82GK102787122SQ20121020994
公開日2012年11月21日 申請日期2012年6月21日 優先權日2012年6月21日
發明者萬建民, 吳傳銀, 江玲, 費桂林, 鄭曉明, 金明捺, 陳雋, 高赫 申請人:南京農業大學