一種克倫特羅檢測試劑盒及其使用方法
2023-06-24 14:44:51
專利名稱：：一種克倫特羅檢測試劑盒及其使用方法
技術領域：
：本發明屬於檢測
技術領域：
，具體地，涉及一種檢測尿液、動物組織(肌肉、心臟、肝臟)、血清、飼料等中的克倫特羅的酶聯免疫試劑盒和其使用方法。
背景技術：
：克倫特羅(Clenbuterol，CLE)，俗稱"瘦肉精"，化學名為"2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽"，藥品名為"克喘素"是一種P-興奮劑。因其能改善脂肪型動物的肉與脂肪的比例，並能加速動物生長，而被廣泛添加於動物飼料中，並且可以殘留在動物的體內。經大量實驗結果證實，克倫特羅的毒性並不很強，但因其半衰期長，在體內代謝慢等原因，人體對其的耐受量非常小，治療用藥時也都十分慎重，用量過大或無病用藥則會導致肌肉震顫、心悸、戰慄、頭痛、噁心、嘔吐等症狀。由於這種藥物對人有嚴重的副作用，輕則導致心跳及心率不正常，重則可引發心臟病。目前，我國已禁止其使用。而在生產上，一些不法生產者在育肥豬(6070Kg以上)飼料中添加，連用至宰前。由於克倫特羅飼用濃度是治療用量的IO倍以上，停藥期短(如果停藥造成受體調節減弱，脂肪在皮下和內臟補償性蓄積，瘦肉率下降)，更重要的是它的化學結構比較穩定，因此在肝、肺等動物內臟器官殘留量很大。另外，克倫特羅能耐受IO(TC高溫，經126t:油煎5min才會破壞減半，常規烹調對肉食品中克倫特羅殘留起不到破壞作用，因而人類食用後會發生中毒。早在上世紀80年代就有學者開始對於克倫特羅的定量檢測和分析研究，上述分析技術發展至今已經20餘年。通常，檢測克倫特羅的主要方法有分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜法(LC-MS)、氣相色譜-質譜(GC-MS)、高效液相色譜_串聯質譜法(HPLC-MS/MS)等。這些方法由於儀器設備複雜、檢測時間長、過程繁瑣、檢測費用昂貴等原因，不適合現場監控和大量樣本篩查。1993年Boyd等人(D.Boyd，P.Shearan.J.P.HopkinsandM.0'Keeffe.Applicationofmatrixsolidphasedispersionforthedeterminationofclenbuterolinliversamples[J]，AnalyticaChimicaActa,1993，27(5):221-226.)應用基質固相分散法與放免法結合對肝臟中克倫特羅殘留作了檢測。檢測中用^標記克倫特羅，檢測限達0.5ng/g，回收率大於70%，上述方法的應用開創了免疫檢測分析克倫特羅殘留的先河。放免法檢測克倫特羅殘留具有很好的特異性和高度靈敏度。但由於對條件要求比較苛刻且放射性同位素對工作人員有一定傷害，因而限制了該法的廣泛應用。隨後發展起來的螢光免疫分析法(FIA)同放免法相比，克服了放免法中的核輻身寸缺點。Bacigalupo等(M.A.Bacigalupo，A丄us，G.MeroniDovisandEPetruzzlli.Comparisonoftime—resolvedfluroimm皿oassayandimmm皿oenzymometricassayforclenbuterol[J].Analyst,1995，120(8):2269-2271.)利用單抗技術與熒免分析技術檢測了克倫特羅在牛尿中的殘留，檢測線性範圍10105pg，檢測限10pg。與色譜法相比，螢光免疫法檢測克倫特羅殘留具有特異性高，穩定性好，對樣品處理要求比較簡單及一次可檢測多個樣品等優點。缺點是對溫度的強烈依賴性和螢光強度取決於激發波長。3標記免疫分析技術是"邁向21世紀的醫學檢驗技術"之一，其發展趨勢是新標記物的發展與聯合應用、單克隆以及基因工程抗體的應用及免疫放大技術，可明顯提高檢測特異性，敏感度可達z印to(10—2°)、yocto(10—24)水平，即可實現分子水平的檢測。目前，檢測克倫特羅較高效的免疫分析技術是ELISA技術。McCo皿ell等人(McCo皿ellRI，McCormickA，LamontJV，etal.Developmentofanimm皿oaffinitycolumnandanenzymeimmunoassayforthescreeningofclenbuterolinmeatsamplesandthepracticalapplicationofthistestinthescreeningof1005samples[J]FoodAgriImmunol,1994，6:147-153.)在1994年米用ELISA方法對1005份包括肝臟、腎臟、肌肉在內的組織樣品進行了篩選實驗。由於組織試樣的前處理採用了IAC分離技術，因此假陽性率極低。經過覆核測定，僅有4份假陽性，假陽性率為0.4%。其中檢出的陰性樣品有982份，陽性樣品23份。1998年陳繼明等(陳繼明，龔曉明，陸承平.兔異源蛋白與自身蛋白作為載體製備克倫特羅抗血清南京農業大學學報，1998，21(3):81-88.)用ELISA方法檢測了飼料、尿樣與臟器中克倫特羅含量，檢測範圍為15.6iig/mL1.90ng/mL;回收率多在85X。上述檢測結果有較好的穩定性和較高的標準回歸曲線，與用HPLC檢測結果大體一致。目前，作為商品化的檢測試劑盒來講，英國的Randox公司和德國的r-biopharm公司均率先開發出了檢測肉品、飼料中克倫特羅殘留的ELISA試劑盒。中國在應用ELISA檢測克倫特羅方面的研究起步相對國外稍晚些，但近幾年取得了明顯的進展。目前國內企業和研究單位已經開發成功自主智慧財產權的克倫特羅ELISA檢測試劑盒，並在近期通過了農業部獸藥殘留試劑盒的備案審核。早在2002年葉妮等(葉妮，閆小峰.國內外克倫特羅ELISA檢測試劑盒評價中國獸藥雜誌，2002，36(10):25-28.)對中國獸藥監察所研製的試劑盒及國外快速檢測試劑盒進行了測試，結果表明該試劑盒與德國r-biopharm公司生產的CLEELISA檢測試劑盒有相當的可比性，且檢測水平相當。上述多種檢測克倫特羅的方法中，色譜、質譜等方法的檢測過程煩瑣、檢測時間長，需貴重儀器、常常作為高端實驗室確證手段。但是，實驗室確診不能完全取代快速、便捷、高效的現場檢測和大樣本量、高通量的篩選。根據我國目前已經形成了一套獸藥殘留的監控檢測技術，對於克倫特羅的監控過程包括了ELISA篩選，HPLC或GC-MS、HPLC-MS定量，GC-MS或HPLC-MS/MS確證。由此可見，ELISA作為一種準確、靈敏性、高性價比的檢測方法，是食品安全監測、獸藥殘留監測領域對"瘦肉精"進行高通量篩選的理想方法。本發明通過特有的免疫方案免疫動物製備具有高親和力、高特異性的抗體克倫特羅抗體，並採用酶標記抗原，建立一種可以檢測克倫特羅的高特異性、高親和力、靈敏快速的直接競爭ELISA檢測方法。相比其他產品，本方法具有操作更簡便、時間更短、特異性更高等特點。
發明內容針對現有技術中存在的問題，本發明人進行了廣泛深入的研究，並因此完成本發明。本發明主要是利用抗原與抗體的特異性免疫反應的基本原理來進行的。首先在微孔板上包被克倫特羅特異性抗體，然後加入克倫特羅標準品或待檢測樣品，再加入酶標抗原，溫4育後，用洗滌液洗板後分別加入底物液A和底物液B，顯色後，加入反應終止液，用酶標儀選擇450nm波長讀取吸光值，然後通過提供的軟體對結果進行計算分析。在整個反應完成後，樣品中克倫特羅含量越多，反應呈色就越淺；反之，樣品中克倫特羅含量越少，則呈色越深。—方面，本發明提供了一種快速、結構簡單、使用簡便、價格便宜、靈敏度高及便於攜帶的用於檢測克倫特羅的試劑盒。本發明的克倫特羅檢測試劑盒包括以下物質(1)包被了克倫特羅抗體的微量測試孔；(2)克倫特羅標準溶液；(3)清洗緩衝液；(4)濃縮酶標記物；(5)底物溶液A;(6)底物溶液B;(7)反應終止液；(8)酶標稀釋液，其中，將克倫特羅進行重氮化，再與牛血清白蛋白BSA進行偶氮連結，形成克倫特羅-BSA，作為製備多克隆抗體的免疫抗原，並且用該免疫抗原製備的多克隆抗體包被微量測試孔，以及在酶標記物的製備中，將小分子克倫特羅先進行重氮化，再與辣根過氧化物酶HRP進行偶氮連接形成酶標抗原克倫特羅-HRP。本發明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，在包被了克倫特羅抗體的微量測試孔的製備過程中，克倫特羅抗體包被濃度為0.1-1iig/mL，包被體積為100iiL，37t:放置2小時後置於4t:靜置過夜。本發明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，克倫特羅標準溶液濃度分別為0ng/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.lng/mL。本發明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，清洗緩衝液可為含有吐溫20的PBS，優選為含有千分之五的吐溫20的0.05moL/L的PBS。本發明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，濃縮酶標記物(酶標抗原)的濃度可為0.3lig/mL_l.0lig/mL。本發明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，底物液A液可為用一定濃度的檸檬酸緩衝液，調pH值至4.5-5.O，加入千分之一至千分之五的30%的H202製得。本發明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，底物溶液B可為8mg/mL-16mg/mL的四甲基聯苯胺溶液，該溶液的溶劑為等體積混合的二甲亞碸和水。本發明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，反應終止液可為10%_15%的硫酸溶液。本發明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，酶標稀釋液可為0.05mol/L的PBS溶液。在本發明的一個實施方式中，提供了一種檢測克倫特羅的試劑盒，該試劑盒包括以下各項5tableseeoriginaldocumentpage6另一方面，本發明提供了使用所述試劑盒檢測克倫特羅的方法，該方法包括1、檢測樣品的製備；2、使用本發明的試劑盒檢測克倫特羅；禾口3、分析檢測結果。其中，使用本發明的試劑盒檢測克倫特羅的方法包括向包被了克倫特羅抗體的微量測試孔中加入克倫特羅標準溶液或樣品溶液和酶標克倫特羅溶液，25t:競爭反應20min後，用清洗緩衝液洗板3次後加入等體積混合的底物溶液A和B，25。C下溫育10min顯色，然後加入反應終止液，用酶標儀選擇450nm波長讀數。計算方法(1)計算B/B。值，用樣品或標準液吸光度值(B)除以零標準吸光度值(B。)再乘以100%。(2)以B/B。值為縱坐標，以標樣濃度的對數值為橫坐標，做標準半對數曲線。(3)根據每個樣品的B/B。值就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度。(4)有些樣品經過了預先稀釋，因此根據標準曲線所得出的樣品濃度一定再要乘以其稀釋倍數。本發明的克倫特羅檢測試劑盒，除可用於尿液檢測以外，同時著重於對血清樣本的檢測，使檢驗結果更準確、更穩定；也可以對飼料、肌肉、組織等樣品進行檢測。該試劑盒簡化了樣品處理方式，使用簡便，省時省力省錢，整個操作過程不到40分鐘，回收率為80%120%，靈敏度可達到0.05ppb，是各類飼料企業、屠宰企業及各級政府檢測機構的理想產品。圖1為克倫特羅檢測的標準曲線。具體實施例方式下文中，將通過實施例詳細描述本發明。但是，本發明的範圍不僅僅限於實施例。實施例材料與儀器藥品和耗材藥物名稱生產廠家規格批號NaOH國藥集團化學試劑有限公司ARF20080125HCL國藥集團化學試劑有限公司AR080101NaN02國藥集團化學試劑有限公司AR080103牛血清白蛋白(BSA)SEEBIO公司OG2012A鹽酸克倫特羅Sigma公司HPLC067K0668完全福氏佐劑Sigma公司不完全福氏佐劑Sigma公司H2S04國藥集團化學試劑有限公司ARF20080128NaCL國藥集團化學試劑有限公司ARF20080104KCL國藥集團化學試劑有限公司ARF20080110KH2P04國藥集團化學試劑有限公司ARF20080106Na2HP0412H20國藥集團化學試劑有限公司ARF200711037tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9實施例1主要材料的製備1、克倫特羅標準溶液的製備克倫特羅(以下簡稱CLE)系列標準溶液6瓶，lmL/瓶。製備過程如下參精確稱取CLE標準品10mg，用蒸餾水溶解，定容至lOOmL，得到lOOppmCLE標準溶液；參取1.OmL100卯m標準溶液稀釋定容至lOOmL，得到1.O卯mCLE標準溶液；參用1.O卯mCLE標準溶液準確稀釋成0.lppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7卯b、8.lppb(Ong/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.Ing/mL)的系列標準溶液。2、克倫特羅免疫抗原與酶標抗原的製備參將CLE進行重氮化(段行信.實用精細有機合成手冊[M].北京化學工業出版社，2000)，再與BSA(Bovineserumalbumin,牛血清白蛋白BSA)蛋白進行偶氮連結，形成CLE-BSA，作為製備多抗的免疫抗原；參酶標抗原CLE-HRP:將小分子CLE先進行重氮化，再與辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)進行偶氮連接。3、克倫特羅多抗的製備參CLE-BSA過柱(葡聚糖凝膠G25)純化，其中BSA含量有9mg/mL;參初次免疫用100-500iigCLE-BSA加入lmL福氏完全佐劑(Freund'sCompleteAdjuvant,FCA)，在家兔背部皮下注射10點每點0.lmL;參每隔4-6個星期用100-500iigCLE-BSA於福氏不完全佐劑(Freund'slncompleteAdjuvant,FIA)中，在肌肉皮下靜脈注射和腳趾皮下注射加強免疫5次，每次lmL;參佐劑和CLE-BSA按照1:1的比例混合乳化。每隻兔子每次免疫用lmL乳化完的抗原，CLE-BSA含量100-500iig;分10個點打入，每個點0.lmL。參最後一次免疫直接用lmL生理鹽水稀釋100-500ygCLE-BSA，靜脈注射，10天後頸部靜脈取血，獲得抗血清。4、克倫特羅抗體的檢測9免疫時間免疫次數效價抑制(0.l卯b)抑制(lppb)2007年9月9日1i:io萬5%21%2007年10月1日21:40萬17%58%2007年10月22日3i:ioo萬24%79%2007年11月13日4i:400萬28%87%2007年12月4日5i:800萬32%94%2007年12月25日第五次免疫後測定為合格(用間接法測定效價達到檢測要求且通過直接競爭法測定靈敏度達到0.05ng/mL)可以取血。5、多克隆抗體的純化1)將上述經測定達到要求的兔血經4t:或室溫離心13000r/min(20000Xg)，30min，收集上清；2)取上清約20mL與等體積生理鹽水混合後，於攪拌下緩慢滴加40mL飽和硫酸氨溶液，於4。C沉澱30min以上或過夜，使蛋白充分沉澱；3)13000r/min，4。C離心10min，棄上清；4)用12mL生理鹽水溶解沉澱，同步驟(2)滴加8mL飽和硫酸銨溶液，4"C靜置lh;5)重複步驟3)離心，用13.3mL生理鹽水溶解沉澱；6)滴加6.6mL飽和硫酸氨溶液，4"靜置lh;7)重複步驟4)離心後所得沉澱物用少許鹽水溶解沉澱，並裝入透析袋；8)用大於20倍體積的PBS緩衝液於4。C透析，更換透析液數次，然後加入等體積甘油置-2(TC保存。9)多抗效價的測定採用間接ELISA法(EnzymeImmunoassays:FromConc印ttoProductDevelopment.S.S.DESP應DE.ChapmanandHall，NewYork，1996.)測定多抗血清的效價。實施例2檢測方法的建立1、包板多抗及克倫特羅-HRP最佳濃度的選擇將上述製備的多抗做不同稀釋後，進行方陣滴定(EnzymeImmunoassays:FromConcepttoProductDevelopment.S.S.DESPHANDE.ChapmanandHal1，NewYork,1996.)，在用ELISA法測定一定濃度的克倫特羅中，用酶標儀選擇450nm波長時的吸光值在2.3-2.8時，即為兩個參數的最佳工作濃度。2、競爭ELISA法的建立及標準曲線的建立不同濃度的克倫特羅標準品含量的測定在確定了最優化的多抗包被濃度和CLE-HRP濃度的基礎上，用CLE標準品與CLE-HRP進行競爭ELISA。103、樣品提取方法的研究情況3.l待測物為尿液直接將尿液取50L進行測試，如有混濁請先離心取上清液進行分析。3.2待測物為血清抽取待驗動物血液，離心或靜置取其較透明之上層液(血清層)使用，注意不要有溶血。取0.ImL血清，加入0.4mL樣品稀釋液(0.05moL/L的PBS)，渦旋1分鐘，混勻。離心10分鐘(3000rpm)，取上清液50yL進行分析。3.3待測物為肉類取4g已均質樣品置入離心管中，再加入6mL0.01NHC1，渦旋1分鐘。靜置30分鐘，離心10分鐘(3000rpm)，上清液與樣品稀釋液(0.05moL/L的PBS)進行1:3(4倍)稀釋後，取50iiL進行分析。3.4.待測物為心、肝等器官取4g已均質樣品置入離心管中，再加入6mL0.01NHC1，渦旋1分鐘。以80—10(TC水浴加熱約3分鐘，離心10分鐘(3000rpm)。上清液與樣品稀釋液(0.05moL/L的PBS)進行l:3(4倍)稀釋後，取50iiL進行分析。3.5.待測物為飼料取lg已磨碎的待測飼料加入5mL0.OlNHCl，震蕩混合1分鐘。3000轉離心10分鐘後，取上清液100iiL，用樣品稀釋液(0.05moL/L的PBS)做10倍稀釋。取50yL進行分析。4、理化方法的比較與氣相色譜-質譜法(GC-MS)比對報告。實施例3克倫特羅檢測試劑盒的製備1.微量測試孔的包被將上述經硫酸銨法純化後的抗體用0.05moL/L、pH為9.6的碳酸緩衝液稀釋到濃度為0.1iig/mL-1.0iig/mL，每孔0.lmL加入96孔微孔板，37攝氏度孵育2小時後4攝氏度過夜。2.製備CLE-HRP採用重氮法將克倫特羅與辣根過氧化物酶按10:l摩爾比連接，4攝氏度過夜後對PBS充分透析。根據偶聯物的活性決定酶的工作濃度。實施例4克倫特羅檢測試劑盒的組建組建克倫特羅檢測試劑盒，使其包括以下組分(1)包被了克倫特羅抗體的微量測試孔，每條8孔，每板12條；(2)克倫特羅標準溶液，濃度分別為Ong/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.lng/mL，每個濃度各1瓶；(3)20倍清洗緩衝液，含有千分之五的吐溫20的0.05moL/L的PBS;(4)20倍濃縮酶標記物，濃縮酶標記物(酶標抗原)的濃度為0.3iig/ml-l.0yg/ml;(5)底物溶液A，稱取NaAcH202.825g，檸檬酸1.725g，檸檬酸鈉？H202.95g，加蒸餾水溶解，用濃HAc調pH至4.50後加入0.1-1.OmL30%的H202，最後用250mL的容量11瓶定容即可；(6)底物溶液B，稱取TMB20-200mg，溶解於125mL的二甲亞碸中，再加入蒸餾水定容至250mL;(7)反應終止液，用量筒量取濃硫酸150mL，在玻璃棒攪拌下緩慢加入850mL蒸餾水中；(8)酶標稀釋液，為0.05mol/L的PBS溶液。實施例5檢測樣品的製備(樣品前處理)1.若待測物為尿液，直接將尿液取50L進行測試，如有混濁請先離心取上清液進行分析。2.若待測物為血清，則用以下方法進行處理(5倍稀釋)抽取待驗動物血液，離心或靜置取其較透明之上層液(血清層)使用，注意不要有溶血。取O.lmL血清，加入O.4mL稀釋液，渦旋l分鐘，混勻。離心10分鐘(3000rpm)，取上清液50iiL進行分析。*若需要0.05ppb的靈敏度，則可直接取lmL血清進行管柱純化，詳細方法見下文管柱純化。3.若待測物為肉類，則用以下方法進行處理(10倍稀釋)取4g已均質樣品置入離心管中，再加入6mL0.01NHC1，渦旋1分鐘。靜置30分鐘，離心10分鐘(3000rpm)，上清液與稀釋液進行1:3(4倍)稀釋後，取50yL進行分析。*若需要0.05卯b的靈敏度，則可繼續取稀釋液3mL進行管柱純化，詳細方法見下文管柱純化。4.若待測物為心、肝等器官，則用以下方法進行處理(10倍稀釋、煮沸)取4g已均質樣品置入離心管中，再加入6mL0.01NHC1，渦旋1分鐘。以80—10(TC水浴加熱約3分鐘，離心10分鐘(3000rpm)。上清液與稀釋液進行1:3(4倍)稀釋後，取50yL進行分析。*若需要0.05ppb的靈敏度，可繼續取稀釋液3mL進行管柱純化，詳細方法見下文管柱純化。5.若待測物為飼料，則用以下方法進行稀釋(50倍稀釋)取lg已磨碎的待測飼料加入5mL0.OlNHCl，震蕩混合1分鐘。3000轉離心10分鐘後，取上清液100iiL，用稀釋液做10倍稀釋。取50iiL進行分析。管柱純化(C18，500mg3mL)若利用C-18管柱進行樣品純化，可提升敏感度至0.05卯b，方法如下1.以10mL甲醇洗滌管柱，流速3mL/分。2.再以10mL蒸餾水洗滌管柱，流速3mL/分。3.分析樣品進入管柱(血清加入lmL，肉類或內臟均質稀釋後的上清液加入3mL)。(注)4.以10mL蒸餾水洗管柱，流速3mL/分。5.利用減壓真空裝置乾燥管柱10分鐘。6.以2mLCH3CN洗滌管柱，流速3mL/分。7.再利用減壓真空裝置乾燥管柱10分鐘。8.以2mL甲醇流出樣品，流速3mL/分。9.以5(TC氮氣流吹乾樣品後，加入稀釋液溶解樣品。(樣品若是血清，則加入lmL稀釋液，樣品若是肉類或是內臟類，則加入300iiL稀釋液)。10.取100iiL進行分析。注:分析樣品進管柱之前必須先用1NNaOH調整到pH9.0~9.5間！實施例6使用本發明的試劑盒檢測克倫特羅的操作步驟檢測前使用本發明的試劑盒檢測克倫特羅的方法包括1、將標準品6瓶、待測樣品、20倍濃縮清洗緩衝液、酶標記物、微孔測試板，置於室溫下，回溫5分鐘。2、清洗緩衝液的配製用蒸餾水將20倍清洗緩衝液以1:19的比例稀釋(即lmL濃縮液+19mL蒸餾水)，作為微孔板清洗液。3、酶標記物配製利用酶標稀釋液將20倍濃縮酶標記物以1:19的比例稀釋(即0.lmL20倍濃縮酶標記物+1.9mL酶標稀釋液)，即完成原倍酶標記物的配製。稀釋後的酶標記物請儘快使用，若保存於-20°C，保存期可達1個月，若保存於4°C，請勿超過一個星期。5、將剩餘的微孔條放回鋁箔袋中，以膠帶封好儲存於4°C。6、如要提高靈敏度可用酶標稀釋液將標準液稀釋一倍後使用。檢領[J時1、於適當微孔中分別加入50iiL標準溶液(O，O.l，O.3，0.9，2.7和8.l卯b)。2、在另外的微孔中加入50iiL已完成前處理的樣品溶液。3、再於每一微孔中另再加入100iiL已完全回溶的酶標記物。4、輕敲盤子四周，使其充分混合後於室溫下避光靜置溫育30分鐘。5、將微孔中的反應液甩掉，再將洗液加滿每一微孔後甩掉，重複洗3次。6、最後一次甩掉後，在吸水紙上拍幹。7、將底物A和B液等比例稀釋，於每一微孔中加入混合好的底物溶液100iiL後，輕敲盤子四周，使其充分混合。8、於室溫下避光靜置溫育15分鐘。9、於每一微孔中加入50iiL反應終止液。10、用酶標儀于波長450nm下判讀。實施例7判定1.計算B/B。值。用樣品或標準液吸光度值(B)除以零標準吸光度值(B。)再乘以100%。2.以B/B。值為縱坐標，以標樣濃度的對數值為橫坐標，做標準半對數曲線。3.根據每個樣品的B/B。值就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度。4.有些樣品經過了預先稀釋，因此根據標準曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數。標準曲線見圖1。實驗實施例本試劑盒1至6號標準液為無色透明液體；酶標記物為藍色帶有絮狀沉澱物液體；底物(A液)為粉紅色澄清透明液體，無沉澱和絮狀物；顯色劑(B)液為無色澄清透明液體，無沉澱和絮狀物，無藍色趨向性變化；反應終止液為澄清透明液體，無沉澱和絮狀物。實驗實施例l靈敏度向包被了克倫特羅抗體的微量測試孔中加入0ng/mL克倫特羅標準溶液和酶標克倫特羅溶液，25t:競爭反應20min後，用清洗緩衝液洗板3次後加入等體積混合的底物溶液A和B，25t:下溫育lOmin顯色，然後加入反應終止液，用酶標儀選擇450nm波長讀數。上述製備的試劑盒的克倫特羅含量為Ong/mL的標準溶液20次測定OD值為tableseeoriginaldocumentpage14平均值B。=EXi鰭(i=1n)標準差SD={[n□EX2-(EX)2]轔n□(n_l)]}1/2靈敏度LOD=B。-3SDB。=2.170SD=0.0106LOD=2.136代入曲線計算得靈敏度=0.Olng/mL本試劑盒靈敏度在0.05ng/mL以內IC50=0.57ng/mL平行20孔測定零值標準品的光吸收度值，計算測定結果的平均值(B)與標準差(SD)。靈敏度LOD=(B0-3SD)在標準曲線上所對應的濃度值。本試劑盒靈敏度為0.lppb以內。實驗實施例2特異性上述製備的克倫特羅試劑盒的特異性通過對相應的物質進行交叉反應性分析而得到。抗血清的抑制物分別用萊克多巴胺、沙丁胺醇等類似物，以類似物在標準曲線上的實測濃度的回收率計算交叉反應率。向包被了克倫特羅抗體的微量測試孔中加入不同濃度的克倫特羅標準溶液或者其他相關物質的標準品溶液和酶標克倫特羅溶液，25t:競爭反應20min後，用清洗緩衝液洗板3次後加入等體積混合的底物溶液A和B，25t:下溫育lOmin顯色，然後加入反應終止液，用酶標儀選擇450nm波長讀數。標準及交叉物五次平均OD值實測濃度ng/mL交叉反應率02.23000.lng/mL1.7650.10.3ng/mL1.3840.314tableseeoriginaldocumentpage15結果顯示本試劑盒與克倫特羅類似物的交叉反應tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage16實驗實施例3精密度使用試劑盒批號為20080201，20080202，20080203分別用三個批次的試劑盒，進行相同的質控樣品的檢測。其中質控樣品1為lng/mL，質控樣品2為2ng/mL，質控樣品3為5ng/mL每份樣品做5次重複。tableseeoriginaldocumentpage16tableseeoriginaldocumentpage17結果顯示本試劑盒批內CV<10%，批間CV<20%。體現了良好的精密度。實驗實施例4本發明的試劑盒與氣相色譜_質譜法(GC核S)比對GC-MS法優點是把色譜高效快速的分離效果和質譜高靈敏度的定性分析有機合起來，能在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進行定性、定量分析，而且具更高的檢測極限。應用氣相色譜_串聯質譜法(GC-MS-MS)對牛、羊、豬組織中的CLE含量進行檢測，最低檢測限為O.5ng/g;用GC-MS法(El離子源)檢測豬尿中的CLE,檢測限為0.5ng/mL;本次使用GC-MS法檢測豬尿中的CLE含量與試劑盒經行比對。進行30個豬尿盲樣進行領lj試。tableseeoriginaldocumentpage17tableseeoriginaldocumentpage18tableseeoriginaldocumentpage19從以上數據，可以看出克倫特羅含量在0.5ppb以上本試劑盒所測定的結果與GC-MS所測定的結果基本一致，0.5ppb以下時已經超出了GC-MS的檢測下限，而本試劑盒仍然可以給出準確的結果。因此，本試劑盒完全可以取代GC-MS用於常規克倫特羅的檢測。實驗實施例5回收率在不同樣品中添加不同濃度的CLE標準品溶液，然後採用本試劑盒提供的前處理方法和試劑進行檢測，回收率=實測濃度/添加濃度X100%tableseeoriginaldocumentpage19實驗實施例6產品穩定性試驗1、使用有效期實驗使用本發明的試劑盒進行穩定性試驗，28t:放置，分別於0、l、2、3月，及以後每3個月，測定6個標準點的OD值及計算陰性豬尿中添加lng、5ng克倫特羅的回收率，並計算IC5Q。(IO次重複平均值)tableseeoriginaldocumentpage20tableseeoriginaldocumentpage21B回收率尿樣品中大約90110%BIC50二0.54上述實驗結果說明，該試劑盒在一年內不同月份檢測，標準點OD數值、標準曲線形態、樣品濃度、添加回收率均無顯著性變化。體現了該試劑盒在正確保存條件下，實驗數據良好的再現性。2、室溫放置實驗室溫放置本發明的試劑盒，室溫(25_28°C)放置，分別於15天、1個月、2個月後測定各標準濃度的0D值(10次重複的平均值)tableseeoriginaldocumentpage22結果顯示該試劑盒在室溫(25-28°C)放置2個月內實驗OD值及IC5。無顯著性變化。3、凍融實驗使用本發明的試劑盒進行凍融實驗，將試劑盒組份置-181:三天，解凍後測定各標準濃度的0D值(10次平均值)tableseeoriginaldocumentpage22結果顯示該試劑盒組分經凍融後0D值及IC50無顯著性變化。4、37攝氏度加速試驗使用本發明的試劑盒進行加速試驗，37t:放置，分別於1天、2天、3天、4天、5天、6天、9天、12天16天、20天後測定各標準濃度的0D值(10次重複的平均值)tableseeoriginaldocumentpage23結果顯示該試劑盒組分經37攝氏度後0D值及IC50無顯著性變化。本發明的克倫特羅檢測試劑盒靈敏度已達到國外進口產品的水平，且交叉反應低，反應時間短，穩定性好。權利要求一種克倫特羅檢測試劑盒，其包括(1)包被了克倫特羅抗體的微量測試孔；(2)克倫特羅標準溶液；(3)清洗緩衝液；(4)濃縮酶標記物；(5)底物溶液A；(6)底物溶液B；(7)反應終止液；和(8)酶標稀釋液，其中，將克倫特羅進行重氮化，再與牛血清白蛋白BSA進行偶氮連結，形成克倫特羅-BSA，作為製備多克隆抗體的免疫抗原，並且用該免疫抗原製備的多克隆抗體包被微量測試孔，以及在酶標記物的製備中，將小分子克倫特羅先進行重氮化，再與辣根過氧化物酶HRP進行偶氮連接形成酶標抗原克倫特羅-HRP。2.根據權利要求1所述的克倫特羅檢測試劑盒，其中，所述克倫特羅標準溶液濃度分另U為0ng/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.lng/mL。3.根據權利要求1所述的克倫特羅檢測試劑盒，其中，所述濃縮酶標記物的濃度為0.3lig/mL_l.0lig/mL。4.根據權利要求1所述的克倫特羅檢測試劑盒，其中，所述包被了克倫特羅抗體的微量測試孔的製備過程中，克倫特羅抗體包被濃度為0.1-1g/mL，包被體積為100L。5.根據權利要求1所述的克倫特羅檢測試劑盒，其中，所述清洗緩衝液為含有千分之五的吐溫20的0.05moL/L的PBS。6.根據權利要求l所述的克倫特羅檢測試劑盒，其中，所述底物溶液A用一定濃度的檸檬酸緩衝液，調PH值至4.5-5.0，加入千分之一至千分之五的30%的H202製得，而所述底物溶液B為8mg/mL-16mg/mL的四甲基聯苯胺溶液，該溶液的溶劑為等體積混合的二甲亞碸和水。7.根據權利要求l所述的克倫特羅檢測試劑盒，其中，所述反應終止液為10%-15%的硫酸溶液。8.—種檢測樣品中殘留的克倫特羅的方法，該方法包括以下步驟(1)檢測樣品的製備；(2)使用權利要求17中任一項所述的試劑盒檢測克倫特羅；禾口(3)分析檢測結果。9.根據權利要求8所述的方法，其中，向包被了克倫特羅抗體的微量測試孔中加入克倫特羅標準溶液或樣品溶液和酶標克倫特羅溶液，競爭反應後，用清洗緩衝液洗板後加入等體積混合的底物溶液A和B，顯色，然後加入反應終止液終止，用酶標儀測定吸光度值，其中，所述酶標克倫特羅溶液為用所述酶標稀釋液稀釋濃縮酶標記物得到的溶液。10.根據權利要求8所述的方法，其中，所述樣品為尿液、血清、動物組織、器官或飼料。全文摘要本發明提供了一種克倫特羅檢測試劑盒，其包括包被了克倫特羅抗體的微量測試孔、克倫特羅標準溶液、清洗緩衝液、濃縮酶標記物、底物溶液A、底物溶液B、反應終止液和酶標稀釋液。本發明還公開了使用上述試劑盒檢測克倫特羅的方法，其包括以下步驟檢測樣品的製備；使用本發明的試劑盒檢測克倫特羅；和分析檢測結果。本發明的克倫特羅檢測試劑盒，除可用於尿液檢測以外，同時著重於對血清樣本的檢測，使檢驗結果更準確、更穩定；也可以對飼料、肌肉、組織等樣品進行檢測。該試劑盒簡化了樣品處理方式，使用簡便，省時省力省錢，整個操作過程不到40分鐘，回收率為80％～120％，靈敏度可達到0.05ppb。文檔編號G01N33/543GK101776684SQ20101011056公開日2010年7月14日申請日期2010年2月12日優先權日2010年2月12日發明者李康,肖理文,胡佳駿,董國秀,蔡曉帆,郭曉梅申請人:上海優你生物科技股份有限公司