一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙及其製備方法
2023-05-26 05:28:31
專利名稱：一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的試紙及其製備方法，特別涉及一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙，還涉及其研製方法。
背景技術：
鼻疽(Malleus)是由鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei)感染引起的人獸共患病。
鼻疽菌是重要的生物戰劑，已被列入《國際禁止生物武器公約》烈性致病微生物核查清單，「9.11」以後被美國列入可能用於進行生物恐怖活動的烈性細菌。
鼻疽菌的感染途徑主要經鼻、口、結膜的黏膜侵入，肺吸入，擦傷或撕裂傷的皮膚傷口侵入。吸入後潛伏期為10-14天。臨床上可分為急性期和慢性期兩種類型，以前者多見，主要為急性肺部感染，也可表現為淋巴管炎和局部淋巴腺腫等慢性皮膚類型。主要症狀有發熱、寒戰、出汗、肌痛、頭痛、胸痛，如得不到及時治療，可發展為急性敗血症，病死率100％。由於鼻疽沒有典型的臨床症狀，並且急性期死亡率高，慢性症狀如沒有對應的抗菌素治療，很難治癒。因此，快速和特異的診斷試驗尤其必要。
鼻疽一般是根據流行病學資料、臨床表現和實驗室檢測的綜合結果作為診斷依據。在非戰爭和恐怖襲擊的狀態下，一般有動物接觸史，具有典型臨床症狀，皮膚損傷部位的滲出物和淋巴結穿刺液直接染色檢到革蘭氏陰性細菌，鼻疽菌分離鑑定陽性，鼻疽菌抗體檢測試驗陽性，可診斷為鼻疽菌感染。
臨床標本中的鼻疽菌分離和鑑定是鼻疽菌感染重要的診斷方法，一般是從病人的血液、痰、傷口膿液、尿或腦脊髓中分離鼻疽菌，然後進行一系列生化和血清學鑑定。但從臨床標本中分離和培養細菌受到許多限制，如病人是否用藥、實驗室是否具備條件，並且培養和鑑定操作繁鎖，需時長。
血清抗體檢測是一個快速而可靠的鼻疽菌感染診斷方法，患者感染鼻疽菌1周後可出現特異血清抗體，國內外報導常用的鼻疽抗體檢測方法有補體結合試驗、間接血球凝集(IHA)、間接免疫螢光(IFA)和ELISA等，這些試驗的共同缺點是操作繁瑣，試劑和方法不穩定，不易標準化，結果觀察不易客觀等。
免疫膠體金技術近年來發展較快、應用較廣，德國已有利用免疫膠體金技術進行抗鼻疽抗體血清檢測的報導(Andrea J.Cuzzubbo，V.Chenthamarakshan，Jamuna VadiveluEvaluation of a new commercially available immunoglobulin M and Immunoglobulin Gimmunochromatographic test for diagnosis of Melioidosis infection Journal of ClinicalMicrobiology 2000，38(4)1670-1671；Chuah SC，Gilmore G，Norton RE.Rapid serologicaldiagnosis of melioidosisan evaluation of a prototype immunochromatographic test.Pathology.2005 Apr；37(2)169-171)。本發明應用該技術研製了鼻疽抗體快速檢測試劑。
以往研究表明，鼻疽菌具有K抗原、O抗原、M抗原和R抗原，由於鼻疽菌不形成鞭毛，因而不具有H抗原。
光滑型鼻疽菌加熱殺死、超聲波破碎、高速離心後收集上清即為可溶性抗原，補體結合試驗和沉澱試驗中所用的抗原就是可溶性抗原。試驗證明，鼻疽菌某些株的可溶性抗原與類鼻疽菌在血清學試驗中有交叉反應(趙建中等，應用單克隆抗體技術分析鼻疽菌表面抗原的初步研究鼻疽研究專輯，獸醫大學，全國人獸共患病學術討論會，1987)。
鼻疽菌M抗原是菌體胞外的粘液物質，有人認為該胞外粘液為莢膜，與K抗原一起同屬於鼻疽菌多糖抗原(Popov S.et al.Milrobiologi cheskii Zhurnal 1991，53(1)90)。鼻疽菌多糖抗原是其特異性抗原(Popov SF，Tikhonov NG，et al.Immunobiological properties ofBurkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei capsular substances ZhMikrobiol Epidemiol Immunobiol.2002 Nov-Dec；(6)60-64；Anuntagool N，SirisinhaS.Antigenic relatedness between Burkholderia pseudomallei and Burkholderiamallei.Microbiol Immunol.2002；46(3)143-150；Burtnick MN，Brett PJ，Woods DE.Molecular and physical characterization of Burkholderia mallei O antigens.JBacteriol.2002 Feb；184(3)849-852)，IHA、IFA和ELISA等血清學實驗中所用的捕獲抗原均為鼻疽菌多糖抗原，本發明所研製的鼻疽抗體快速檢測試劑(膠體金法)中所用的捕獲抗原也是鼻疽菌多糖抗原。
該技術與其它方法比較，優勢在於試劑保存期長，易規範化，檢測過程中標本處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓，非專業技術人員按照說明書即可操作，並可迅速觀察結果，很適合突發事件現場和基層使用。
目前尚無免疫層析試紙檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌特異抗體的報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙。
本發明所提供的檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙，包括樣品墊、緊密連接於所述樣品墊的含有金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)標記膠體金探針的金標墊、與所述金標墊緊密連接的硝酸纖維膜(NC膜)和緊密連接於所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維膜上包被有相互分離的一條檢測線和一條質控線，所述檢測線為鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原，所述質控線為兔IgG。所述樣品墊、吸水墊、金標墊均由吸水材料製成，如由玻璃纖維膜、吸水紙、樹脂等製成。
檢測樣品時，將檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙的樣品墊直接浸於樣品中；還可將檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙裝入帶有方便添加樣品的樣品孔和便於觀察檢測線和質控線的檢測窗口的盒中，其中樣品孔對準試紙的樣品墊，檢測窗口對準試紙的檢測線和質控線。
本發明的第二個目的是提供一種製備上述檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙的方法。
本發明所提供的製備上述檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)製備鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原；用0.01M pH 7.2的PB緩衝液將鼻疽伯克霍爾德氏菌抗原稀釋為0.5-1mg/ml，包被NC膜的一個區域，得到檢測線；用0.01M pH 7.2的PBS緩衝液將IgG稀釋為2-4mg/ml，包被NC膜的另一區域，得到質控線；37℃乾燥2-4小時，然後將其一端粘貼在吸水紙墊上；2)製備含有金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)標記膠體金探針；取金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)標記膠體金探針5ml加入0.5-0.55g蔗糖，充分溶解後將玻璃纖維膜、樹脂浸入上述探針溶液中，得到金標墊，在-20℃～-50℃乾燥8-12小時後，將其粘貼在步驟1)中得到的硝酸纖維膜(NC膜)的另一端；3)在步驟2)中的金標墊上面再貼樣品墊，得到檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙。
為了使用更加方便，所述吸水墊的下面還粘貼背板。
本發明所提供的檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙及其製備方法中，所述鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原可按下述方法製備經活化的鼻疽伯克霍爾德氏菌(軍事醫學科學院微生物流行病研究所，保藏號為350018)接種4％甘油胰酶大豆瓊脂培養基，37℃培養48-50小時，用無菌生理鹽水洗下菌苔，菌懸液約為比濁濃度(1×108cfu/ml)，流通蒸汽1小時，冷卻至室溫後8000-9000rpm離心15-20分鐘，收集上清即為鼻疽多糖抗原；所述金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)標記膠體金探針可由下述方法製備將HAuCl4配製成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸，攪動下準確加入1.6ml的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，繼續加熱煮沸10-15分鐘，冷卻後用水恢復至原體積，用K2CO3或HCl調pH值為5.9-6.9，按7ug/ml加入金黃色葡萄球菌蛋白A，攪拌15-25分鐘，然後加入2ml 10％聚乙二醇20000，攪拌20-30分鐘，20,000-23,600g離心25-35min，棄上清，收集沉澱即得到金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)標記膠體金探針。
所述調節pH值的K2CO3的濃度可為0.15-0.25M，優選為0.2M；所述調節pH值HCl的濃度可為0.08-0.12mol/L，優選為0.1mol/L。
在實際應用中，所述纖維膜的厚度可為2.5-3mm；所述金標墊的厚度可為0.3-0.7mm；所述樣品墊的厚度可為0.1-0.2mm。
鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原是鼻疽伯克霍爾德氏菌特異性抗原。本發明的檢測原理是將鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原包被在NC膜上，用於捕捉樣品中鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體，然後用標記了SPA(金黃色葡萄球菌蛋白A)的免疫膠體金探針檢測。陽性樣品中，鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體的Fc端與金顆粒上的SPA結合，Fab端與NC膜上的鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原結合，層析2分鐘後出現肉眼可見的沉澱線。
本發明的檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙可檢測人和動物血清中鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原的抗體，用於鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的診斷。本發明的檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙及其製備方法與現有的其他方法相比，特異性強，更簡便，更快速，檢測過程中標本處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓，非專業技術人員即可操作，並可迅速觀察結果，很適合突發事件現場和基層使用。
圖1為鼻疽伯克霍爾德氏菌感染免疫層析試紙的結構示意圖。免疫層析試紙由吸水墊4、硝酸纖維膜3、金標墊2和玻璃纖維膜樣品墊1四部分組成；硝酸纖維膜3上包被有檢測線5和質控線6。
具體實施例方式
實施例中用到的主要材料氯化金(HAuCl4)購自Sigma公司，1g/瓶包裝。
檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)，分析純，北京化工廠。
碳酸鉀(K2CO3)，分析純，北京化工廠。
SPA(金黃色葡萄球菌蛋白A)購自Amershan Pharmacia Biotech公司。
NC膜購自Millipore公司。
鼻疽伯克霍爾德氏菌(保藏號為350018)，引自農林部中監所，軍事醫學科學院微生物流行病研究所菌種庫保藏，免疫血清以鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原為抗原按常規方法製備。
標準鼻疽陽性血清5份，鼻疽菌免疫家兔獲得，由中國獸醫藥品監察所製備並保存；正常兔血清5份，由中國獸醫藥品監察所提供。
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
實施例1、檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體的免疫層析試紙的製備1、鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原的製備經活化的鼻疽伯克霍爾德氏菌(軍事醫學科學院微生物流行病研究所，保藏號為350018)接種4％甘油胰酶大豆瓊脂培養基，37℃培養48-50小時，用無菌生理鹽水洗下菌苔，菌懸液約為比濁濃度(1×108cfu/ml)，流通蒸汽1小時，冷卻至室溫後8000-9000rpm離心15-20分鐘，收集上清即為鼻疽多糖抗原。
鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原液體為淡黃色透明液體。通過與鼻疽伯克霍爾德氏菌抗血清雙向瓊脂擴散實驗結果表明，該鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原與鼻疽伯克霍爾德氏菌抗血清雙向瓊脂擴散效價為1∶32。其中，鼻疽伯克霍爾德氏菌抗血清是以該鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原為免疫原，按常規方法免疫兔得到的抗血清。
2、金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)膠體金探針的製備用純水溶解氯金酸使其終濃度為0.01％，煮沸後每100ml氯金酸溶液進行以下操作加入1％的檸檬酸三鈉水溶液1.6ml，繼續煮沸10-15分鐘，用純水恢復原體積100ml，冷卻至室溫後用0.2M K2CO3或0.1M HCl調節膠體金溶液pH6.0，磁力攪拌下按7μg/ml加入SPA，15-25分鐘後加入10％的聚乙二醇200002ml，繼續攪拌20-30分鐘，20,000-23,600g離心25-35min，棄上清，沉澱即為SPA標記膠體金探針，用0.35％四硼酸鈉保存液恢復至原體積的1/10，即10ml，即為SPA標記膠體金探針溶液，4C冰箱保存。
3、檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙的製備如圖1所示，檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙由吸水墊4、硝酸纖維膜3、金標墊2和玻璃纖維膜樣品墊1四部分組成；硝酸纖維膜3上包被有檢測線5和質控線6。
用0.01M pH 7.2的PB緩衝液稀釋鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原，濃度為0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml，用於包被檢測線5。用0.01M pH 7.2的PBS緩衝液稀釋兔IgG，濃度為2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml，用於包被質控線6。用BIODOT公司XYZ3000噴膜機分別噴於2.5mm厚的硝酸纖維素膜上，形成相互分離的檢測線和質控線，37℃乾燥2-4小時，然後將其用雙面膠粘貼在吸水紙墊上；取步驟2製備的SPA標記膠體金探針溶液5ml加入0.5-0.55g蔗糖，充分溶解均勻加在玻璃纖維上，-20℃～-50℃放置8-12小時，凍幹機抽乾，得到金標墊2。將該金標墊用雙面膠粘貼在上述具有檢測線和質控線的硝酸纖維膜上，再在該金標墊上面用雙面膠粘貼0.1-0.2mm厚的玻璃纖維膜樣品墊，最後將它們用雙面膠粘貼在塑料背板上，按所需大小切割，即為檢測鼻疽菌感染的免疫層析試紙，加乾燥劑後密封保存。
結果表明檢測線鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原包被濃度選擇1mg/ml，質控線兔IgG包被濃度選擇3mg/ml時，效果最好。
4、鼻疽伯克霍爾德氏菌免疫層析試紙的使用方法和原理測定時將試紙條樣品墊1浸入液體標本中，樣品墊1即吸取液體向上端移動，流經金標墊2時使乾片上的SPA標記膠體金探針復溶，並帶動其向硝酸纖維膜3滲移。若標本中有待測特異抗體，其可與金顆粒上的SPA結合，此抗原抗體複合物流至檢測線5即被固相抗原所獲，在膜上顯出紅色反應線條。過剩的抗原抗體複合物繼續前行，至質控線6與固相兔IgG結合，而顯出紅色質控線條。反之，陰性標本則無反應線條，而僅顯示質控線條。
實施例2、實驗室考核1、實驗方法將標準鼻疽陽性血清分別用生理鹽水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋；將正常兔血清分別用生理鹽水按1∶40稀釋。所有稀釋液作為檢測液備用。
取鼻疽抗體快速檢測試劑，分別吸取上述檢測液，滴加3-4滴(約150μl)於試劑樣品墊上，2分鐘後開始觀察結果，15分鐘終止觀察。
結果判斷於質控線處出現1條沉澱線為陰性，即無鼻疽抗體檢出；分別與檢測線和質控線處出現2條沉澱線為陽性，即有鼻疽抗體檢出。
2、實驗結果表1為鼻疽抗體快速檢測試劑實驗室考核結果。
表1 鼻疽抗體快速檢測試劑(膠體金法)考核試驗結果
從表1可以看出，鼻疽抗體快速檢測試劑檢測標準鼻疽陽性血清，效價最高可達1∶10000，並且不與正常兔血清交叉。
權利要求
1.一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙，包括樣品墊(1)、緊密連接於所述樣品墊一端的含有金黃色葡萄球菌蛋白A標記膠體金探針的金標墊(2)、與所述金標墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜(3)和緊密連接於所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊(4)；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測線(5)和質控線(6)。所述檢測線為鼻疽伯克霍爾德氏菌抗原，所述質控線為兔IgG。
2.根據權利要求1所述的檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙，其特徵在於所述鼻疽伯克霍爾德氏菌抗原為鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原。
3.根據權利要求1所述的檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙，其特徵在於所述樣品墊、吸水墊、金標墊均由吸水材料製成；所述吸水墊的下面還緊密連接有背板。
4.一種製備檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原按照下述方法製備經活化的鼻疽伯克霍爾德氏菌接種4％甘油胰酶大豆瓊脂培養基，37℃培養48小時，用無菌生理鹽水洗下菌苔，菌懸液約為比濁濃度(1×108cfu/ml)，流通蒸汽1小時，冷卻至室溫後8000-9000rpm離心15-20分鐘，收集上清即為鼻疽多糖抗原。1)用0.01M pH 7.2的PB緩衝液稀釋鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原，濃度為0.5-1mg/ml，用於包被檢測線5。用0.01M pH 7.2的PBS緩衝液稀釋兔IgG，濃度為2-4mg/ml，用於包被質控線6。用BIODOT公司XYZ3000噴膜機分別噴於2.5-3mm厚的硝酸纖維素膜上，形成相互分離的檢測線和質控線，37℃乾燥2-4小時，然後將其用雙面膠粘貼在吸水紙墊上。2)用純水溶解氯金酸使其終濃度為0.01％，煮沸後每100ml氯金酸溶液進行以下操作加入1％的檸檬酸三鈉水溶液1.6ml，繼續煮沸10-15分鐘，用純水恢復原體積100ml，冷卻至室溫後用0.2M K2CO3或0.1M HCl調節膠體金溶液pH值為5.9-6.9，磁力攪拌下按7ug/ml加入SPA，15-25分鐘後加入10％的聚乙二醇200002ml，繼續攪拌20-30分鐘，20,000-23,600g離心25-35分鐘，棄上清，沉澱即為SPA標記膠體金探針，用0.35％四硼酸鈉保存液恢復至原體積的1/10，即10ml，即為SPA標記膠體金探針溶液；所述百分含量均為質量百分含量。3)取步驟2製備的SPA標記膠體金探針溶液5ml加入0.5-0.55g蔗糖，充分溶解均勻加在玻璃纖維上，-20℃～-50℃放置8-12小時，凍幹機抽乾，得到金標墊2。將該金標墊用雙面膠粘貼在上述具有檢測線和質控線的硝酸纖維膜上，再在該金標墊上面用雙面膠粘貼0.1-0.2mm厚的玻璃纖維膜樣品墊，最後將它們用雙面膠粘貼在塑料背板上，按所需大小切割，即為檢測鼻疽菌感染的免疫層析試紙。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述鼻疽伯克霍爾德氏菌抗原的濃度為0.5-1mg/ml；所述IgG的濃度為2-4mg/ml；所述吸水墊的下面還粘貼有背板；所述調節pH值的K2CO3的濃度為0.15-0.25M；所述調節pH值HCl的濃度為0.08-0.12mol/L。
6.含有權利要求1-3中任一所述的檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙的試劑盒。
全文摘要
本發明公開了一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌感染的免疫層析試紙及其製備方法。該免疫層析試紙，包括樣品墊1、緊密連接於所述樣品墊一端的含有金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)標記膠體金探針的金標墊2、與所述金標墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜(NC膜)3和緊密連接於所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊4；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測線5和質控線6，所述檢測線為鼻疽伯克霍爾德氏菌抗原，所述質控線為兔IgG。本發明可檢測人和動物血清中抗鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原的抗體，用於鼻疽伯克霍爾德氏菌感染診斷。
文檔編號G01N33/558GK1834649SQ200610072298
公開日2006年9月20日 申請日期2006年4月18日 優先權日2006年4月18日
發明者端青, 何君, 檀華, 朱虹 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所