B型肝炎病毒(HBV)的疏水性修飾的preS衍生肽及它們作為HBV和HDV進入抑制劑的使用的製作方法

2023-05-26 03:19:56 4

專利名稱：B型肝炎病毒(HBV)的疏水性修飾的preS衍生肽及它們作為HBV和HDV進入抑制劑的使用的製作方法
技術領域：
本發明涉及B型肝炎病毒(HBV)的疏水性修飾的preS衍生肽，該preS衍生肽來 源於HBV preS共有序列並且其N末端優選被醯基化以及其C末端可選地被修飾。這些HBV 的疏水性修飾的PreS衍生肽是非常有效的HBV進入抑制劑以及HDV進入抑制劑，因此適用 於HBV和/或HDV感染的抑制、原發HBV和/或HDV感染的預防以及(慢性)B型肝炎和/ 或丁型肝炎的治療。本發明進一步涉及包含這些HBV的疏水性修飾的preS衍生肽的藥物 和疫苗組合物。
背景技術：
現今，大約20億人攜帶HBV血清標記。他們中的大約4億是被HBV慢性感染的。 根據疾病控制中心(CDC)，如果他們沒有接受適當的治療(1)，15-25%的慢性HBV感染的人 在十年內有發展成肝細胞癌(HCC)的傾向。HBV相關的肝細胞癌(HCC)預測性很差並且因 此HBV被世界衛生與健康組織(WHO)歸類為最重要的天然存在的人致癌因子。儘管有預防 疫苗，在未來的十年中感染的人數仍將上升，這是由於世界人口的增加和在貧窮國家中預 防的限制。在工業國家，HBV基本上是通過腸胃外的途徑傳播。90-95%的被急性感染的、有 免疫能力的個體清除病毒，因此獲得了終生的免疫防護。他們當中大約5-10%的人發展成 乙型慢性肝炎(在德國300，000-500，000人)。相反，在高流行區域，特別是在中非和東亞， 傳播的主要模式是垂直地從母親至兒童。令人遺憾的是，沒有完全免疫能力的兒童的感染 導致了 90-98%的慢性疾病過程。因此B型肝炎相關的肝細胞癌在這些國家中的許多中是 最普通的惡性腫瘤。當前被認可的治療乙型慢性肝炎病毒(HBV)感染的治療方案，或者是針對已經建 立感染後的病毒基因組的複製步驟(Lamivudine，Adefovir, Entecavir)或者是作為免疫 系統的調節劑(幹擾素α)。令人遺憾的是，只有10-25%的病人在這種治療上保留著持久 的病毒反應，尤其反映了核苷酸抗性突變體的快速選擇。儘管預防性疫苗的有效性，但發展 新的以迄今為止不受影響的複製步驟如病毒進入為靶點的治療方法仍是極為重要的。病毒進入的特異性抑制是吸引人的治療概念，以便控制和最終消除急性和慢性感 染。對於HIV，通過由36個胺基酸組成的gp41蛋白衍生肽(Fuzeon )，防止了病毒和細胞 膜的融合(2)，成功地實現對病毒進入的幹擾。儘管預防疫苗和逆轉錄酶(RT)抑制劑的有效性，全世界HBV感染的人數和HBV相 關的死亡人數(當前每年大約500，000人)還在增加。大約三分之二的原發性肝癌可歸因 於持續的HBV感染(3)。目前治療遵循兩個策略⑴幹擾素(IFN α )治療調節針對HBV的免疫反應並顯 示了直接抗病毒效果，這在大約30%的被治療的病人中導致長時間的臨床益處，但沒有根 除病毒；(ii)病毒逆轉錄酶抑制劑的給藥抑制病毒複製並且在一年的治療後伴隨著顯著的生物化學和組織的改進。然而，長時間的治療與抗性病毒株的出現是相關的(4)。HBV是哺乳動物和鳥類的小包膜DNA病毒家族的原型(5)。HBV的包膜包括三種 稱為L(大的)、M(中等的)、以及S(小的)蛋白(參見

圖1A)。它們共有具有四個跨膜區 的C-末端S結構域。M和L蛋白帶有另外的N末端延伸的55個胺基酸(preS2)和取決於 基因型的107或118個胺基酸(preSl)(參見圖1B)。在病毒粒子中，L、M和S的化學計量 比是大約1 1 4，同時非常充足分泌的非傳染性的亞病毒微粒(SVPs)幾乎唯一地包含 S蛋白以及僅僅微量的L蛋白(6)。在合成期間，L的preSl結構域被豆蔻醯基化並且被移 位通過內質網(ER)。該修飾對於HBV的感染性是必需的(7，8)。HBV感染早期情況的研究被限制，因為直到最近既沒有細胞培養系統也沒有小動 物模型(9)。HBV易感染的H印aRG細胞系的發展促進了 HBV進入的系統研究並且導致了包 膜蛋白衍生的進入抑制劑的發現(10)。此外，至今為止還沒有針對HDV感染的有效治療，HDV是一種利用HBV包膜蛋白進 入肝細胞中的衛星擬病毒(satellite virusoid) (15，17，20)。在本領域中需要提供針對 HDV感染的有效治療。因此，本發明的目的是提高方法和手段用於抑制、預防和/或治療HBV感染和現有 技術存在的其他HBV相關的疾病，並且因此本發明的目的是提供改進的方法和手段，允許 有靶點的和有效的抑制、預防和/或治療HBV感染和HBV相關的疾病。本發明的進一步的目標是提供方法和手段用於抑制、預防和/或治療HDV感染和 HDV相關的疾病。

發明內容
根據本發明，通過提供HBV的疏水性修飾的preS衍生肽來實現這個目標。上述疏水性修飾的preS衍生肽的通式如下Hm-P-Rn,P是所述的preS衍生肽並且包含HBV preS共有序列的胺基酸序列或者其變體。H是所述preS衍生肽P的疏水性修飾，其是P的N末端並且選自醯基化和疏水性 部分的添加；其中m至少是1。R是上述preS衍生肽P的可選的C末端修飾(S卩η是0或至少是1)。根據本發明，此外通過提供藥物組合物來實現這個目標，該藥物組合物包含至少 一種此處說明的HBV的疏水性修飾preS衍生肽和可選擇的藥學上可接受的載體和/或賦 形劑。根據本發明，此外通過提供本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽和/或各自 的藥物組合物用於疾病的診斷、預防和/或治療來實現這個目標。根據本發明，此外通過提供本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或藥物組合 物用於抑制HBV和/或HDV感染、用於預防HBV和/或HDV原發感染和/或用於治療乙型 肝炎和/或丁型肝炎來實現這個目標。根據本發明，此外通過使用本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或藥物組合 物用於可抑制HBV和/或HDV感染的藥物的研製、用於預防HBV和/或HDV原發感染和/ 或用於治療(慢性)B型肝炎和/或(慢性)丁型肝炎來實現這個目標。
根據本發明，此外通過抑制HBV和/或HDV感染的方法、預防HBV和/或HDV原發 感染和/或治療(慢性)B型肝炎和/或(慢性)丁型肝炎的方法來實現這個目標，上述 方法通過利用本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或藥物組合物來實現上述功能。根據本發明，此外通過提供疫苗組合物來實現這個目標，該疫苗組合物包含至少 一種此處說明的HBV的疏水性修飾preS衍生肽和可選擇的藥學上可接受的載體和/或賦 形劑。
具體實施例方式在下面對本發明進行更詳細的描述之前，應理解本發明並不限於此處描述的特定 的方法、流程和試劑，因為這些可能會改變。也應理解此處使用的術語只是為了描述特定的 實施方式，並不是想限制本發明的範圍，本發明只是被附後的權利要求限制。除非另外定 義，此處使用的所有技術和科學術語具有的含義應當與本領域中的技術人員通常理解的一 樣。為了本發明，此處引用的所有參考文獻全部併入此處以供參考。HBV的疏水性修飾的preS衍生肽如上所述，本發明提供了B型肝炎病毒(HBV)的疏水性修飾的preS衍生肽。HBV的包膜包括三種稱為L(大的)、M(中等的)、S(小的)的蛋白(參見圖1A)。 它們共有具有四個跨膜區的C-末端S結構域。M和L蛋白帶有另外的N末端延伸的55個 胺基酸和取決於基因型的107或118個胺基酸(preS2和preSl)(參見圖1B)。因此，根據本發明的術語HBV的「preS衍生」肽指的是具有與HBV的L蛋白N末端 延伸段(preSl)相對應的胺基酸序列的肽，優選地，該「preS衍生」肽具有與種類和基因型 A至H以及捲毛猴(WMHBV)、黑猩猩以及大猩猩B型肝炎病毒的共有序列相對應的胺基酸序 列，但是該「preS衍生」肽還包括其變體，優選N末端和/或C末端截斷型變體、胺基酸置換 變體。SEQ ID NO. 1顯示種類和基因型A至H以及捲毛猴(WMHBV)的HBV preS共有氨基 酸序列。參見圖2中排列，顯示HBV preS共有序列(Consensus)和八種HBV基因型(A-H) 以及捲毛猴HBV(WMHBV)PreS序列含有2_48位點胺基酸。注意基因型A、B、C、E、F、G和H 在它們的N-末端具有高達11個另外的胺基酸。本申請中的HBV 「基因型C」的胺基酸序列指的是人工序列，它與HBV基因型C相 對應或與其相等，正如基因庫ABV02850. 1中所示，只是本發明基因型C中的位點46 (根據 下面描述的編號)是賴氨酸(K)，代替了基因庫序列中的穀氨醯胺(Q)；本申請中HBV基因 型C序列可以被稱為「HBV基因型C Q46K」。參見SEQ ID NOs. 4、12、21_27。圖2也顯示了 HBV preS共有序列的胺基酸殘基的編號，將在整個說明書中被參眧.
/、、、 ·胺基酸殘基位點1是基因型D (以前被描述為亞型ayw，參見SEQ ID NO. 5)的蛋氨 酸(Metl)，而胺基酸殘基位點(-11)是基因型C (SEQ ID NO. 4)的蛋氨酸(Met (-11))。在 體內，Metl或者Met (-11)分別被細胞的蛋氨醯氨肽酶切斷並且被隨後轉移的來自於豆蔻 醯-CoA的豆蔻醯殘基修飾，該豆蔻醯殘基通過N-豆蔻醯轉移酶分別轉移至胺基酸殘基位 點2甘氨酸(Gly2)或者胺基酸殘基位點(-10)甘氨酸(Gly (-10))。基因型D的N-末端胺基酸殘基是天然胺基酸甘氨酸(Gly2)並且根據由L的基礎開放閱讀框(Underlying Open Reading Frame)的密碼子開始的相應編號被編號為2 (或者基因型C的Gly(-lO))。HBV preS共有序列也包括基因型A、B、C、E、F、G和H的另外的N-末端胺基酸(被 指定在「_」位置)。因此，全部HBV preS共有序列包含位點(-11)至48。因此，上述的編號與SEQ ID NO. 1中胺基酸的實際編號之間存在差異，比如Met (-11)，殘基編號(-11)，在SEQ ID NO. 1中被列為胺基酸殘基1 ；Gly (-10)，殘基編號(-10)，在SEQ ID NO. 1中被列為胺基酸殘基2 ；Metl，殘基編號1，在SEQ ID NO. 1中被列為胺基酸殘基12 ；Gly2，殘基編號2，在SEQ ID NO. 1中被列為胺基酸殘基13 ；Gly48，殘基編號48，在SEQ ID NO. 1中被列為胺基酸殘基58。SEQ ID NO =IHBV preS 共有序列(位點(-11)至 48)(-11)-M GGffSS TPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFRA NSNNP DffDFN PNKDH WPEAN KVG-48SEQ ID N0:2HBV 基因型 A(-11)-M GGffSS KPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DffDFN PVKDD WPAAN QVG-48SEQ ID N0:3HBV 基因型 B(-11)-M GGffSS KPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFKA NSENP DffDLN PHKDN WPDAN KVG-48SEQ ID NO :4人工胺基酸序列，與HBV基因型C相對應，除了 46位點上是賴氨酸 (K)而不是穀氨醯胺(Q)以外；Q46K(-11)-M GGffSS KPRQG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DffDFN PNKDH WPEAN KVG-48SEQ ID N0:5HBV 基因型 DI-MGQNL STSNP LGFFP DHQLD PAFRA NTANP DffDFN PNKDT WPDAN KVG-48SEQ ID NO 6 HBV 基因型 E(-10)-MGLSff TVPLE WGKNI STTNP LGFFP DHQLD PAFRA NTRNP DWDHN PNKDH WTEAN KVG-48SEQ ID N0:7HBV 基因型 F(-11)-M GAPLS TTRRG MGQNL SVPNP LGFFP DHQLD PLFRA NSSSP DffDFN TNKDS WPMAN KVG-48SEQ ID NO :8HBV 基因型 G(-10)-MGLSff TVPLE WGKNL SASNP LGFLP DHQLD PAFRA NTNNP DWDFN PKKDP WPEAN KVG-48SEQ ID NO :9HBV 基因型 H(-11)-M GAPLS TARRG MGQNL SVPNP LGFFP DHQLD PLFRA NSSSP DffDFN TNKDN WPMAN KVG-48SEQ ID NO :10WMHBVI-MGLNQ STFNP LGFFP SHQLD PLFKA NAGSA DffDKN PNKDP WPQAH DTA-48
8
對於SEQ ID NOs. 2-10參見基因庫登錄號HBV 基因型 A 基因庫 AAT28684. 1HBV 基因型 B 基因庫 AAU01950. 1HBV基因型C基因庫ABV02850. 1(其中位點46是賴氨酸(K)(如同在SEQ IDN0. 4 中)而不是穀氨醯胺(Q)(在ABV02850. 1中)。HBV 基因型 D 基因庫 AAR19337. 1HBV 基因型 E 基因庫 ABS31101. 1HBV 基因型 F 基因庫 ABK19774. 1HBV 基因型 G 基因庫 AAF34735. 1/AF160501_3HBV 基因型 H 基因庫 AAM09052. 1WMHBV基因庫 AAC16905. 1根據本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽的通式如下Hm-P-Rn,其中P是所述preS衍生肽；H是P的所述疏水性修飾；R是P的C末端修飾；m至少是1 ；η是0或者至少是1。根據本發明的HBV的preS衍生肽，P，包含-如SEQID NO. 1所示的HBV preS共有序列的胺基酸序列，SEQ ID NO.或者-其變體。「變體」優選是N-末端和/或C-末端截斷型變體、胺基酸置換或缺失變體、或延長 變體。此外，變體還包含胺基酸序列，該胺基酸序列包含被修飾的胺基酸、非天然的胺基酸 或者擬肽類或另外的可以模擬肽主鏈/結構的化合物。優選的，變體選自SEQ ID NO. 1的N-末端和/或C-末端截斷型變體；胺基酸置換 或缺失變體；包含被修飾的胺基酸、非天然的胺基酸或者擬肽類或另外的可以模擬肽主鏈 /結構的化合物的變體。根據本發明，疏水性修飾的preS衍生肽的變體包含SEQ ID NO. 1的至少10或20 個連續的胺基酸，並且可以由 SEQ ID NO. 1 的 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48 個
或更多的胺基酸或它的變體組成。N-末端和/或C-末端截斷型變體優選包含SEQ ID NO. 1的至少48個連續的氨基 酸(優選殘基2至48)，更優選的是SEQ ID NO. 1的至少17個連續的胺基酸(優選殘基5 至21)或SEQ ID NO. 1的至少20個連續的胺基酸(優選殘基2至21)。術語「變體」也指的是在不同病毒種類、菌株或者嗜肝DNA病毒種類的亞型中發現 的同源序列，如HBV菌株α UHBV菌株LSH(黑猩猩分離菌)、捲毛候HBV(WMHBV)或者選自 下組的菌株HBV基因型A至H，以及此處描述的HBV基因型C，Q46K (如SEQ ID N0. 4)。術語「變體」也指的是與SEQ ID NO. 1至少有50%序列同一性的同源序列，或者此
9處公開的任何其他胺基酸序列，優選具有70 %，更優選80 %，更進一步優選90 %或者95 % 的序列同一性。因此，根據本發明的優選的疏水性修飾的preS衍生肽中，P包含SEQ ID NO. 1的 變體，其具有不同病毒種類、菌株或者亞型的胺基酸序列或者其變體，優選具有HBV基因型 或捲毛猴HBV (WMHBV)的胺基酸序列。優選地，P包含選自SEQ ID NOs. 2至10的胺基酸序列或者其變體(參見圖2)。在根據本發明的疏水性修飾的preS衍生肽的優選實施方式中，P包含SEQ ID NO. 1的變體，其具有選自下組的胺基酸序列如SEQ ID NO. 1中顯示的HBV preS共有序列的胺基酸殘基2至21、胺基酸殘基5至21、胺基酸殘基5至15或胺基酸殘基9至15 (參見[SEQ ID NO. 15])。更加優選地，P不包含在SEQ ID NO. 1的殘基9至22上的胺基酸置換和/或缺失， 例如通過刪除殘基17至22。更加優選地，P不包含在SEQ ID NO. 1的殘基9至15上的胺基酸置換和/或缺失。更加優選地，NPLGFFP基序[SEQ ID N0. 15](對應於SEQ ID NO. 1的殘基9至15) 沒有被中斷或者被修飾，例如通過D-胺基酸來取代殘基11-15。更加優選地，根據本發明的疏水性修飾的preS衍生肽中，P包含SEQ ID NO. 1的 變體，其具有選自下組的胺基酸序列共有序列的氨基酉堯殘基2至48[SEQ ID Ν0. 11]；
基因型C的氨基酉堯殘基2至48[SEQIDN0.12]
基因型C的氨基酉堯殘基2至21[SEQIDNO.13]
基因型C的氨基酉堯殘基5至21[SEQIDNO.14]
基因型C的氨基酉堯殘基9至15[SEQIDNO.15]
基因型D的氨基酉堯殘基2至48[SEQIDNO.16]
基因型D的氨基酉堯殘基5至48[SEQIDNO.17]
基因型D的氨基酉堯殘基2至33[SEQIDNO.18]
基因型D的氨基酉堯殘基5至33[SEQIDNO.19]
基因型D的氨基酉堯殘基2至21[SEQIDNO.20]
基因型D的氨基酉堯殘基9至15[SEQIDNO.15]。
因此優選地，P包含選自SEQIDNOs. 11 至 20 的氨基變體。對於P的優選的胺基酸序列，參見下述，表1-7，附圖和實施例。SEQ ID NO. 1的「變體」也包括具有胺基酸缺失、胺基酸置換(例如通過其他氨基 酸或通過等構物(具有與蛋白質胺基酸相似的結構和空間相似性的被修飾的胺基酸)的保 守或非保守的替換)、胺基酸添加或等構物添加的變體或者「類似物」，，只要在肽濃度低於 10 μ Μ，和優選低於1 μ M下，序列能引起70%的HBV感染的抑制。保守的胺基酸置換典型地涉及在相同種類的胺基酸中的置換。這些種類包括例 如
_具有不帶電荷的極性側鏈的胺基酸，如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪 氨酸；_具有鹼性側鏈的胺基酸，如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；-具有酸性側鏈的胺基酸，如天冬氨酸和穀氨酸；以及-具有非極性側鏈的胺基酸，如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸和半胱氨酸。本發明的疏水性修飾的preS衍生肽優選可被修飾以便具有增加的免疫原性。例 如，這種增加的免疫原性指的是增加免疫接種後引發的抗體範圍，或者允許產生能夠壓制 不同病毒株感染的抗體。在另一個實施方式中，本發明的疏水性修飾的preS衍生肽優選可被修飾以便降 低它們的免疫原性。這種疏水性修飾的preS衍生肽在治療應用以便抑制體內HBV感染上 特別有用，同時避免或限制了副作用。因此，優選地通過置換和/或缺失修飾的基序是承擔免疫原性的序列，如B細胞表 面抗原和/或T細胞表面抗原以及此外的抗體識別基序。HBV的B細胞表面抗原優選是SEQ ID NO. 1的胺基酸殘基20至23，基序DPAF ；共 有序列(SEQ ID NO. 1)和基因型C(SEQ ID NO. 4)的胺基酸殘基26至32，基序NSNNPDW ；或 者基因型 D (SEQ ID NO. 5)的 NTANPDW。在優選的實施方式中，SEQ ID NO. 1的胺基酸殘基20至23被修飾，優選通過氨基 酸置換，和/或胺基酸殘基26至32被修飾，優選通過胺基酸置換和/或缺失。優選地，SEQ ID NO. 1的胺基酸殘基20至23 (基序DPAF)通過丙氨酸胺基酸置換 被修飾，優選地變成基序APAF。優選地，SEQ ID NO. 1的胺基酸殘基26至32通過丙氨酸胺基酸置換被修飾，優選 地變成基序NANAPDff或者NAAAPDW。在優選的實施方式中，P包含選自SEQ ID NOs. 21至28的胺基酸序列SEQ ID NOs. 或者其變體。參見下述，表2、7和各個附圖和實施例。在更加優選的實施方式中，P包含選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO. 11 (共有序列的殘基2至48)，SEQ ID N0. 12 (基因型 C 的殘基 2 至 48)，SEQ ID N0. 13 (基因型 C 的殘基 2 至 21)，SEQ ID N0. 4 (基因型C的殘基(_11)至48)，以及SEQ ID N0. 20 (基因型 D 的殘基 2 至 21)。PreS衍生肽P的疏水性修飾(H)是P的N-末端。「N-末端」指的是N-末端的疏水性修飾，即各自的第一個胺基酸殘基(如Gly2)， 但是也包括在接近N-末端上的疏水性修飾，如各自的胺基酸殘基(_4)、(-3)、(-2)、(-1)、1、2或3或4。因此，疏水性修飾可以進一步通過在接近P的N-末端的位點 連接疏水性部分來獲得。根據本發明，上述的HBV的preS衍生肽的疏水性修飾是將疏水性部分添加到肽上。
此外，m至少是1，即用至少1個疏水性部分或者基團修飾。在本發明的優選實施方式中，m是1、2、3、4或更多。亦即，P可以用一個以上疏水 性部分或者基團修飾，例如2個。疏水性部分或者基團相互之間可以是相同的或者不同的。根據本發明，上述的HBV的preS衍生肽的疏水性修飾是選自-醯基化；_疏水性部分的添加。醯基化優選選自用羧酸、脂肪酸和具有親脂性側鏈的胺基酸的醯基化。優選脂肪酸是飽和的或者不飽和的脂肪酸，支鏈的或者無支鏈的脂肪性，優選具 有8至22個碳原子(C8至C22)。更加優選的，醯基化的疏水性修飾選自用豆蔻醯(C14)、棕櫚醯(C16)或者硬脂醯 (C18)的醯基化。優選疏水性部分的添加選自膽固醇、膽固醇的衍生物、磷脂、糖脂、甘油酯、類固 醇、神經醯胺、異戊二烯衍生物、金剛烷、法尼醇、脂肪基、多環芳烴化合物的添加。疏水性部分的連接優選通過共價鍵進行，其可以通過氨基甲酸酯、醯胺、醚、二硫 化物或者任何其他的在本領域技術人員能力之內的連接來完成。因此，本發明的疏水性修飾，優選的醯基化的preS衍生肽優選是脂肽類，因為它 們的N-末端的親脂性或者疏水基團/部分。對於優選的疏水性修飾的preS衍生肽，參見表1和2。本發明的更加優選的疏水性修飾的preS衍生肽如下所述-P 包含自 SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 4 禾口 SEQ IDNO. 20的胺基酸序列以及-H是用豆蔻醯(C14)或者硬脂醯(C18)、優選用硬脂醯(C18)醯基化的疏水性修 飾。因此，本發明更加優選的疏水性修飾的preS衍生肽是如下肽的名稱胺基酸序列 疏水性修飾_HBVpreS/'2-_48 ■旨St (共有序列)SEQ ID NO. 11硬脂醯(C18)
HBVpreS/'2-_48as (共有序列)SEQ ID NO. 11豆蔻醯(C14)
HBVpreS/'2-硬脂酸(c)SEQID NO.12硬脂醯(C18)
HBVpreS/'2-豆蔻醯(Q)SEQID NO.12豆蔻醯(C14)
HBVpreS/'2--21硬脂酸(C)SEQID NO.12硬脂醯(C18)
HBVpreS/-11)-48 硬腿(C)SEQID NO.4硬脂醯(C18)
HBVpreS/-11)-48 豆麵(C)SEQID NO.4豆蔻醯(C14)
HBVpreS/'2-硬脂酸(D)SEQID NO.20硬脂醯(C18)其中(C)指的是HBV基因型C Q46K。基因型C序列的優選實施方式在本發明的非常優選的實施方式中，根據本發明的疏水性修飾的preS肽P包含來 源於基因型C的胺基酸序列。本發明的來源於基因型C的疏水性修飾的preS衍生肽比相應的基因型D更加有效地抑制HBV感染。參見圖3和表3.如上所述，本申請中的HBV 「基因型C」的胺基酸序列指的是人工序列，其與基因庫 ABV02850. 1中所示的HBV基因型C相對應或相同，除了在本發明的基因型C中位點46 (根 據如下所述的編碼)是賴氨酸(K)而不是基因庫序列中的穀氨醯胺(Q)；本申請中的HBV基 因型C序列也可以稱作「HBV基因型C Q46K」。參見SEQ ID NOs. 4、12、21_27。如上所述的用於HBV preS共有序列的相同的編號被用於基因型C序列的胺基酸 殘基的編號(參見圖2)，比如Met (-11)，殘基號碼(-11)，在SEQ ID NO. 4中被列為胺基酸殘基1 ；Gly (-10)，殘基號碼(-10)，在SEQ ID NO. 4中被列為胺基酸殘基2 ；Metl，殘基號碼1，在SEQ ID NO. 4中被列為胺基酸殘基12 ；Gly2，殘基號碼2，在SEQ ID NO. 4中被列為胺基酸殘基13，並且在SEQ ID NO. 12 中被列為胺基酸殘基1 ；Gly48，殘基號碼48，在SEQ ID N0. 4中被列為胺基酸殘基58，並且在SEQ ID N0. 12 中被列為胺基酸殘基47。SEQ ID N0 12胺基酸序列，與HBV基因型C的位點2至48相對應，除了在位點46 上是賴氨酸(K)而不是穀氨醯胺(Q) ；Q46K2-GTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DffDFN PNKDH WPEAN KVG-48P可以優選地選自下組 SEQ ID N0. 12 (基因型C的殘基2至48)，
(基因型C的殘基(-11)至48)， (基因型C的殘基2至21)， (基因型C的殘基5至21)，以及 (基因型C的殘基9至15)。在基因型C序列的優選的實施方式中，B型肝炎病毒(HBV)的疏水性修飾的preS 衍生肽的通式如下Hm-P-Rn，其中優選地P是preS衍生肽或者其衍生物，該preS衍生肽包含SEQ ID N0. 12的胺基酸序列 或者至少10個連續胺基酸的該序列的N-或/和C-末端截斷型變體，其衍生物包含被修飾 的胺基酸、非天然的胺基酸或擬肽類；H是preS衍生肽P的疏水性修飾，其是P的N-末端，並且選自醯基化和疏水性部 分的添加；R是上述preS衍生肽P的C-末端修飾；m至少是1;以及η是0或者至少是1。本發明的優選的肽對於HBV和/或HDV感染的抑制、急性HBV和/或HDV感染的 預防、和/或B型肝炎和/或丁型肝炎的治療是特別有效的。優選地，P包含SEQ ID Ν0. 12 (基因型C的殘基2至48)的胺基酸序列，或由其組 成。同樣優選地，P包含SEQ ID N0. 12的胺基酸序列的變體，其中變體包含SEQ ID

SEQID N0. 4
SEQID NO. 13
SEQID NO. 14
SEQID NO. 15NO. 12的至少10個連續的胺基酸殘基(優選殘基9至18)，更加優選15個或20個，並且可 以由 SEQ ID NO. 12 的 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48 或更多的胺基酸殘基組成。
優選地，包含於P中的SEQ ID NO. 12的連續的胺基酸殘基選自基因型C的氨基酉堯殘基9至15[=SEQIDN0.15]
基因型C的氨基酉堯殘基2至15，
基因型C的氨基酉堯殘基9至18，
基因型C的氨基酉堯殘基2至18，
基因型C的氨基酉堯殘基2至20，
基因型C的氨基酉堯殘基2至21[=SEQIDNO.13]，
基因型C的氨基酉堯殘基5至21[=SEQIDNO.14]，
基因型C的氨基酉堯殘基2至25，
基因型C的氨基酉堯殘基2至30，
基因型C的氨基酉堯殘基2至35，
基因型C的氨基酉堯殘基2至40，
基因型C的氨基酉堯殘基2至45，
基因型C的氨基酉堯殘基2至46，或者
基因型C的氨基酉堯殘基2至48[=SEQIDNO.12]。
在一個實施方式中，P包含SEQ ID NO. 12的各個剩餘的胺基酸殘基，稱作 基因型C的胺基酸殘基16至48， 基因型C的胺基酸殘基19至48， 基因型C的胺基酸殘基21至48， 基因型C的胺基酸殘基22至48， 基因型C的胺基酸殘基26至48， 基因型C的胺基酸殘基31至48， 基因型C的胺基酸殘基36至48， 基因型C的胺基酸殘基41至48， 基因型C的胺基酸殘基46至48，或者 基因型C的胺基酸殘基47至48，
它們或者與SEQ ID NO. 12的各個胺基酸殘基相同，或者是它們的衍生物， 其中衍生物包含至少一種修飾，所述修飾選自下組胺基酸置換、胺基酸缺失、被 修飾的胺基酸、非天然的胺基酸或者擬肽類，
其中至少一種修飾是1、2、3、4、5或更多的修飾。 優選的胺基酸置換如此處所描述。 更優選地，P包含選自下組的胺基酸序列
-包含SEQ ID N0. 12的胺基酸殘基2至15、以及與其相鄰的SEQ ID N0. 12的氨 基酸殘基16至48的衍生物的胺基酸序列；-包含SEQ ID N0. 12的胺基酸殘基2至20和與其相鄰的SEQ ID N0. 12的胺基酸殘基21至48的衍生物的胺基酸序列；-包含SEQID NO. 12的胺基酸殘基2至25和與其相鄰的SEQ ID NO. 12的胺基酸 殘基26至48的衍生物的胺基酸序列；-包含SEQID NO. 12的胺基酸殘基2至30和與其相鄰的SEQ ID NO. 12的胺基酸 殘基31至48的衍生物的胺基酸序列；-包含SEQID NO. 12的胺基酸殘基2至35和與其相鄰的SEQ ID N0. 12的胺基酸 殘基36至48的衍生物的胺基酸序列；-包含SEQID N0. 12的胺基酸殘基2至40和與其相鄰的SEQ ID N0. 12的胺基酸 殘基41至48的衍生物的胺基酸序列；以及-包含SEQID N0. 12的胺基酸序列的胺基酸序列；其中衍生物包含至少一種修飾，所述修飾選自下組胺基酸置換、胺基酸缺失、被 修飾的胺基酸、非天然的胺基酸或者擬肽類，其中至少一種修飾是1、2、3、4、5或更多的修飾。在基因型C序列的優選實施方式中-P包含選自SEQ ID N0. 12的胺基酸序列SEQ ID N0.或者相應的被描述的變體/ 衍生物/修飾，-H是用豆蔻醯(C14)或者硬脂醯(C18)、優選用豆蔻醯(C14)醯基化的疏水性修 飾。豆蔻醯基化的修飾在體內和藥物應用上是優選的，這是由於它的高安全性，如沒 有硬脂醯基團的副作用(固有的免疫反應等等)。因此，本發明的更加優選的疏水性修飾的preS衍生肽是下述HBV preS/(-ll)-48siest (C) [SEQ ID NO. 4]HBV preS/2-48 豆蔑S (C)[SEQ ID NO. 12]HBVpreS/2-21se (C)[SEQ ID NO. 13]HBVpreS/5-21se (C)[SEQ ID NO. 14]HBVpreS/9-15se (C)[SEQ ID NO. 15]最優選HBVpreS/2-48 豆蔑S (C) [SEQ ID NO. 12],上述的preS衍生肽P的C-末端修飾(R)優選是具有能防止降解，如體內降解的 部分的修飾。「C-末端」指的是在C末端的修飾，即相應的最後的胺基酸殘基，但是也包括接近 C-末端的修飾，如倒數第二個胺基酸殘基、倒數第三個胺基酸殘基或更多胺基酸殘基(比 如一種D-胺基酸的引入，防止載體被酶降解，比如通過羧肽酶作用)。本領域的技術人員將能根據各種應用選擇相應的合適的部分。優選的可以防止降解的部分，選自醯胺、D-胺基酸、被修飾的胺基酸、環狀胺基酸； 天然的和合成的聚合物，如PEG、聚糖。在一個實施方式中，P與肽或者蛋白融合，肽或者蛋白優選選自白蛋白和人IgGs 的Fc結構域。融合優選是P的C-末端。
此外，η是0或者至少是1，即C-末端的修飾(R)是可選的。優選地，η是1。在本發明進一步的實施方式中，η是1、2、3、4或更多。亦即，P的C-末端或者其接 近位點可以被一個以上的部分或者基團修飾，例如2個。該部分或者基團相互之間可以是 相同的或者不同的。在本發明的一個實施方式中，H和/或R通過連接物或隔離物與P連接。連接物或間隔物對於本領域的技術人員是已知的，例如聚丙氨酸、聚甘氨酸、碳水 化合物、(CH2)n基團。因此，本領域的技術人員將能根據各種應用選擇相應的合適的連接物或者間隔 物。在優選的實施方式中，根據本發明的疏水性修飾的preS衍生肽帶有標記或者標 籤，其優選地選自螢光染料、放射性同位素和對比劑。優選的放射性同位素是1、，125!，99!!^，1^，6^，11、，』，177!^。優選的螢光染料是Alexa染料、羅丹明和螢光素的衍生物、Cy-染料。優選的對比劑是釓(Gd)複合體、超磁性鐵(supramagnetic Fe)複合體和粒子、包 含高原子序數的原子的化合物，即用於計算機層析成像術(CT)的碘、微泡和載體例如包含 這些對比劑的脂質體。本發明的肽可以通過各種易於為本領域的技術人員所知的步驟來製備，一般是通 過合成化學步驟和/或基因工程步驟製備。合成化學步驟更為特別地包括固相順序(sequential)及分組(block)合成(11)。 固相的順序步驟可以利用已建立的自動化方法比如通過使用自動化肽合成器來實行。在這 個步驟中，α _氨基保護的胺基酸被連接至樹脂支持物上。使用的樹脂支持物可以是常規地 在本領域中使用的用於(多)肽的固相製備的任何合適的樹脂，優選為與聚氧化乙烯共聚 合的聚苯乙烯以便提供位點用於與初始引入的ο-氨基保護的胺基酸形成酯。本發明者運 用的此優選方法已經被清楚地描述(參見比如12)。胺基酸被一個接一個地(逐步的)引 入。與引入一個胺基酸相對應的每次合成循環包括脫保護步驟、連續的洗滌步驟、與活化的 胺基酸的連接步驟和隨後的洗滌步驟。這些步驟的每一步繼之以過濾。用於連接的反應試 劑是經典的用於(多)肽合成的反應試劑，如二環己基碳二亞胺、羥基苯並三唑、苯並三氮 唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鐺六氟磷酸鹽(卡特縮合劑)和疊氮磷酸二苯酯。在樹 脂上合成多肽之後，在苯甲醚、乙二硫醇或者2-甲基吲哚存在的條件下，通過用強酸如三 氟乙酸進行處理，將多肽從樹脂上分離出來。然後通過經典的純化技術，尤其是通過HPLC， 來純化化合物。本發明的肽也可以通過連接被選擇性地保護的(多)肽段來得到，這種連接如在 溶液中被實現。肽還可以通過本領域中的技術人員所熟知的基因工程技術來生產。真核表達系 統，例如杆狀病毒系統，是特別合適的。根據這個步驟，蛋白質在感染了重組體杆狀病毒的 昆蟲細胞中被表達，此重組體杆狀病毒包含編碼異源蛋白質的核酸序列並調節核酸序列， 如啟動子。一些細胞系可用於重組體杆狀病毒感染，例如來自於美式培養物保藏所的細胞 系Sf-9(CRL 1711)。在真核表達系統如大腸桿菌中的表達，也是特別合適的。
肽的疏水性部分的引入可以通過各種易於為本領域的技術人員所知的步驟來完 成，包括合成的和基因工程方法。可供選擇的，肽和/或融合肽(即疏水性修飾的肽)可以通過被穩定轉染的真核 細胞系如CHO和其他細胞系來產生，這些細胞系是本領域中為人所熟知的並且通常被用於 產生疫苗等等。由於N-末端47-preSl胺基酸促進豆蔻醯基化蛋白質/肽的分泌的固有特 性，生物活性的疏水性修飾的肽可以從細胞培養的上清液中提取出來。本發明的疏水性修飾的preS衍生肽的特徵本發明的疏水性修飾的preS衍生肽是多功能的肝炎病毒進入抑制劑並且還呈現 親肝性/肝趨性，即它們以肝為靶點。肝趨性尤其在圖11中被顯示。上述親肝性被進一步的公開在本發明者的相應的美國臨時專利申請中，標題是 「B型肝炎病毒(HBV)的疏水性修飾preS衍生肽和它們作為載體應用於將化合物特定的傳 送給肝」，此專利是在同一天申請的並且被全部併入此處以供參考。本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽是非常合適的和有效的HBV進入抑制 劑，並且是HDV的進入抑制劑，或者在體外(如通過防止HBV顆粒與肝細胞的結合和/或內 化)或者在體內。正如附圖和實施例所顯示的，本發明的疏水性修飾的preS衍生肽有高抑制活性， 即它們以極低的劑量有效地抑制HBV和/或HDV感染。更優選的實施方式的IC5tl值的範圍 是0. 01至500nM，優選0. 025至50nM，更優選0. 05至25nM。參見表1。本發明的來源於基因型C的疏水性修飾的preS衍生肽比相應的基因型D的preS 衍生肽更加有效地抑制HBV感染。此外，本發明的疏水性修飾的preS衍生肽可以被加工成不含有免疫原性的抗原 表位，但是仍然呈現強抑制活性，如在其序列中不包含免疫原性抗原表位、但仍具有約SnM 的IC5tl值的HBVpreS/2-21硬脂氣本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽也可以交叉防止HBV基因型C和D，因 為來源於基因型C的肽(如HBVpreS/2-2(C)或者HBVpreS/2-48(C))可以抑制 HBV基因型D的進入。藥物和疫苗組合物如上所述，本發明提供一種藥物組合物，其包含至少一種此處描述的HBV的疏水 性修飾的preS衍生肽和可選擇的藥學上可接受的載體和/或賦形劑。根據本發明的藥物組合物包含-至少一種此處描述的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽；-此處描述的結合物；以及-可選擇的藥學上可接受的載體和/或賦形劑。根據本發明的藥物組合物非常好的適用於此處描述的所有使用和方法。如上所述，本發明提供一種疫苗組合物，其包含至少一種此處描述的HBV的疏水 性修飾preS衍生肽和可選擇的藥學上可接受的載體和/或賦形劑。根據本發明的疫苗組合物非常好的適用於此處描述的使用和方法。「藥學上可接受的載體或者賦形劑」指的是任何媒介物(vehicle)，在其中或者利 用它們可以配製根據本發明的藥物或者疫苗組合物。它包括鹽溶液如磷酸鹽緩衝鹽水。通常，稀釋劑或者載體是根據給藥的模式和途徑以及標準藥學工作規範來選擇的。醫療應用如上所述，本發明提供了本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽和/或相應的 藥物組合物的首次醫療使用。因此，根據本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物是合適的並 且因此被提供用於診斷、預防和/或治療疾病。如上所述，本發明進一步提供本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽和/或相 應的藥物組合物用於某些疾病的診斷、預防和/或治療。在優選的實施方式中，本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或藥物組合物被 提供用於抑制HBV和/或HDV感染、用於預防HBV和/或HDV原發感染和/或用於治療乙 型肝炎和/或丁型肝炎，優選用於治療乙型慢性肝炎和/或丁型慢性肝炎。在優選的實施方式中，本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或藥物組合物用 於藥物研製，該藥物用於抑制HBV和/或HDV感染、用於預防HBV和/或HDV原發感染和/ 或用於治療B型肝炎和/或丁型肝炎。優選地，本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物被提供用於 HBV和/或HDV感染的抑制。優選地，本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物被提供用於預 防HBV和/或HDV的原發感染。優選地，HBV的任何基因型的HBV感染都被抑制或被預防。本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽可以交叉預防HBV基因型C和D，因為 來源於基因型C的肽(如HBVpreS/2-21 脂s (C)或者HBVpreS/^IS (C))可以抑制HBV 基因型D的進入。在優選的實施方式中，本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物 作為HBV和/或HDV的進入抑制劑被使用/被提供。優選地，本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物被提供用於治 療B型肝炎和/或丁型肝炎，尤其是乙型慢性肝炎和/或丁型慢性肝炎。本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽是非常合適的和有效的HBV進入抑制 劑，並且是HDV的進入抑制劑，或者在體外(如通過防止HBV顆粒與肝細胞的結合和/或內 化)或者在體內。此外，本發明提供了一種體外抑制HBV感染肝細胞的方法，包含使用如上所述的 疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物。合適的肝細胞包括人主要的肝細胞或者稱作H印aRG(22)的肝癌衍生細胞系(在 法國專利申請0109044中被描述的)、來自於Tupaia belangeri (23)的肝細胞，它們也是容 易受到HBV感染的。此外，如上所述，本發明提供通過利用本發明的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽 或藥物組合物，用於抑制HBV和/或HDV感染的方法、預防HBV和/或HDV原發感染和/或 治療(慢性)B型肝炎和/或(慢性)丁型肝炎的方法。給藥途徑優選地，本發明的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物的給藥途徑選自下組皮下的、靜脈的、□服的、鼻的、肌肉的、經皮的、吸入的、通過栓劑的。用於鼻的給藥或應用的優選實施方式是鼻噴入法。有效治療劑量本發明的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物被提供以致於它們包含有效 治療劑量的上述藥物組合物的上述疏水性修飾的PreS衍生肽。本發明的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物的「有效治療劑量」指的是足 以抑制HBV和/或HDV感染、預防HBV和/或HDV原發感染、治療B型肝炎和/或丁型肝炎 和/或疫苗接種和/或體內抑制HBV和/或HDV進入的劑量。優選的有效治療劑量的範圍是每kg體重10 μ g至lmg，優選地是10 μ g至100 μ g。對於本發明的疏水性修飾的preS衍生肽作為疫苗的使用，優選的有效治療劑量 的範圍是每kg體重10 μ g至lmg。如果使用的疏水性preS衍生肽的IC5tl值是約ΙΟηΜ，那麼優選的有效治療劑量是 每kg體重約100 μ g或每個病人1至5mg的範圍。優選的每個病人1至5mg的有效治療劑 量可以一天給藥一次或者在其他實施方式中每2-3天僅給藥一次。優選的有效治療劑量取決於各自的應用和想要的抑制、治療或者疫苗接種的結^ ο本領域的技術人員將能確定合適的有效治療劑量。HBV受體的識別本發明還涉及一種用於體外和/或體內識別肝細胞受體的方法，此方法涉及HBV 的連接和/或穿透，和/或包括使用如上所述的疏水性修飾的PreS衍生肽定量表達上述受 體。上述肝細胞受體可以在哺乳動物或者相應的動物模型中被識別，優選小鼠或人。尤其是，上述方法包括如下步驟-將肝活組織檢查或者肝細胞與本發明的疏水性修飾的preS衍生肽在如下條件 下相接觸一段時間足以允許上述肽與在肝細胞表面表達的受體特異性的結合；-檢測上述肽與受體的結合；以及-識別上述受體。這可以根據本領域的技術人員所熟知的經典步驟來完成。比如，可以包括本發明 的疏水性修飾的PreS衍生肽的放射性的、酶的或者螢光標記和隨後利用合適的方法檢測。 許多螢光物質是已知的並且可以被用作標記物。這些包括，如螢光素、羅丹明、金胺、得克薩 斯紅、Cy3, Cy5, DIGE-標記物。酶標記包括將酶連接至所研究的分子上，如多肽，並且可以 通過任何比色法、分光光度法或者螢光分光光度法來檢測。發明者識別出能有效的阻斷HBV在體外和體內的進入的HBV-preS-表面蛋白 質-衍生脂肽。本發明關於這些抑制肽的生物分布(biodistribution)研究顯示它們有 選擇性的聚集在肝上，在肝上它們結合肝細胞並被推測進入肝細胞。這種親肝性需要肽的 N-末端醯基化並且依賴於在N-末端47preSl胺基酸內的某種HBV preS基序，即在胺基酸 殘基2至21 (或者優選最小序列的殘基9至15)內的某種HBV preS基序。發明者觀察到 此肽序列另外含有膜轉位信號，這可以促進甚至完整的融合蛋白穿過質膜的輸送(未公開 出版的結果)，這開啟了如下可能性將任何種類的藥物特定地運輸至肝細胞的質膜或者甚至有選擇性進入該細胞。本發明者已經顯示HBV preSl衍生脂肽能以極低的劑量完全預防被移植的 uPA-RAG-Ι小鼠模型中的HBV感染。此外關於這些HBVpreS衍生的進入抑制劑的藥物代謝 動力學研究表明了顯著的親肝性和非常高的血清穩定性(t1/2 ca. 60h)和在靶器官中的長 半衰期(t1/2 ca.24h)。肽的N-末端的醯基化以及某些胺基酸序列的完整性都是必須的。 因此，此肽可以被用作用於肝臟的特定藥物靶點的多功能載體來克服肝細胞的感染或者治 療肝細胞癌。(參見本發明者的相應的美國臨時專利申請，標題是「B型肝炎病毒(HBV)的疏 水性修飾的PreS衍生肽和它們作為載體應用於將化合物特定的傳送給肝」，此專利是在同 一天申請的。)此外本發明人證明了這個原理WMHBV感染可以通過體內皮下注射HBV包膜蛋白 衍生肽的應用來有效的被阻斷。這將開啟新的預防急性HBV感染和用於乙型慢性肝炎的治 療選擇的前景。因為用於本發明的uPA/RAG-2/Pfp小鼠缺乏B細胞、T細胞和NK細胞，所以 假定了肽對易感染的肝細胞的直接抑制作用。這可以被醯基化的PreS衍生肽在肝臟上的 有效的聚集、接著可能通過膽汁途徑被緩慢的清除所支持。這兩個特性允許以極低劑量和 低頻率進行皮下注射應用。假設5天內5次0.2mg/kg HBV/preS2-48 的注射導致預防 WMHBV感染的建立，大約30倍更高活性的肽HBV/PreS2-48 KSt以低於7 μ g/kg 13nmol/ kg的劑量每天給藥或者每兩天給藥的連續給藥可能是有效的。考慮到從小鼠中獲得的每體 重的有效藥物學劑量必須用大約10的因子糾正用於人(13)，每個人的有效劑量 被預期是 低於IOOyg/天。用於治療慢性HBV感染的基於核苷酸類似物的方案頻繁地導致抗性突變體的選 擇(4，14)。這需要另一個策略和新的藥物來針對HBV複製循環的不同步驟。HBV脂肽的進 入抑制代表了這種方法。由於作用模式，發明者認為其對任何種類的核苷酸抗性突變體均 是有效的。此外，因為肽的活性需要PreSl結構域(15)中的保守序列，所以肽對任何HBV 基因型均是活性的。與Fuzeon 將HIV gp41蛋白質作為靶點從而允許分子內的代償的突 變的出現相反，以前的研究表明醯基化的HBV脂肽針對細胞組分來防止HBV和它的受體的 相互作用(16，17)。因此，抗性突變體的出現看起來是不可能的。用於HBVpreS衍生的脂肽的臨床應用的明顯的指徵是預防還沒有建立的HBV感染 (如暴露後預防、垂直傳播或者肝移植的再感染的預防)。然而，進入抑制劑在慢性感染的 病人中也是有效的，如與幹擾素α或者病毒RT的抑制劑相結合。因為HBV慢性感染的維 持一方面取決於被免疫系統清除的感染肝細胞的動力學轉換和另一方面取決於被治癒的/ 原初細胞的(再)感染，故在uPA嵌合系統中評估這種醫療方法的有效性從而在抗病毒治 療下(19)抑制感染的傳播和抗性株的出現將是很有意義的。HBVpreS衍生的脂肽也可以抑制體外HDV的感染，HDV是一種利用HBV包膜蛋白進 入肝細胞中的衛星擬病毒(15，17，20)。因為到目前為止還沒有有效的用於HDV的感染的治 療，故preS衍生的脂肽代表第一個有選擇性的療法用於這個經常並發的肝臟疾病。在有免疫能力的病人中HBVpreS-衍生脂肽的應用引發細胞的和體液的免疫反 應。這將有益於治療結果，因為已知識別HBVpreS/2-48的抗原表位的抗體可以壓制體外 HBV感染(21)。此外，可推定天然感染中的病毒的消除需要HBVpreS-特異性免疫的成功建立。因此，除了直接幹擾病毒的進入，通過肽的PreS的特異性免疫應答的刺激有助於通過 細胞溶解型或者非細胞溶解型免疫反應、特別是與IFNα相結合的病毒的消除。表1優選的疏水性修飾的preS衍生肽
肽的名稱胺基酸序列IC50/IC90HBVpreS/ (-11) -48 (共有序列)共有序列SEQ ID N0.1HBVpreS/2-48m>T (共有序列)SEQID NO. 11IC50 70 pMHBYpreS/2-48stearoyl (共有序列)SEQID NO.l 1IC5o 50 pM基因型C肽* HBVpreS/ (-11) -48myr (C)天然的SEQ ID NO.4IC50 4 nMlitHBVpreS/ (-11) -48stearoyl (C)SEQ ID NO,4IC50 1 nM* HBVpreS/2-48myr (C)SEQID NO. 12IC90 5 nM*HBVpreS/2-48stcaroyl (C)SEQ ID NO.12IC90 1 nMHBVpreS/5-48myr (C)截斷XT iV^= N-木輛HBVpreS/5-48stearoyl (C)型HBVpreS/9-48myr (C)HBVpreS/9-48翁0yl (C)HBVpreS/2-21myr (C)截斷N-和/或C-末SEQ ID型■UJ.J mNO. 13HBVpreS/2-2Istearoyl (C)SEQ ID NO.13HBVpreS/5-21myr (C)SEQID NO. 14HBVpreS/5-2Islearoyl (C)SEQ ID NO. 14HBVpreS/9-21myr (C)HBVpreS/9-2Istearoyl (C)HBVpreS/2-15myr (C)HBVpreS/2-15stearoyl (C)HBVpreS/5-15myr (C)HBVpreS/5-15stearoyl (C)HBVpreS/9-15myr (C) **SEQ ID NO. 15HBVpreS/9-15stearoyl (C」*SEQID NO. 15HBVpreS/ (-2) -20palm (C)IC50 25 nM基因型D肽HBVpreS/l-48myr (D)天然的SEQ ID NO.5HBVpreS/2-48mjT (D)SEQID NO. 1權利要求
一種B型肝炎病毒(HBV)的疏水性修飾的preS衍生肽，其通式如下Hm P Rn，其中，P是所述的preS衍生肽，其包含如SEQ ID NO.1所示的HBV preS共有序列的胺基酸序列或者其變體，其中變體優選選自於SEQ ID NO.1中的至少17個連續的胺基酸的N 末端和/或C 末端截斷型變體；胺基酸置換或者缺失變體；包含被修飾的胺基酸、非天然的胺基酸或者擬肽類的變體；H是preS衍生肽P的所述疏水性修飾，其是P的N末端並且選自於醯基化和疏水性部分的添加，所述醯基化優選用羧酸、脂肪酸、C8 C22脂肪酸、具有親脂性側鏈的胺基酸的醯基化，所述疏水性部分的添加選自於膽固醇、膽固醇衍生物、磷脂、糖脂、甘油酯、甾族化合物、神經醯胺、異戊二烯衍生物、金剛烷、法尼醇、脂肪基、多環芳烴化合物的添加，m至少是1，R是所述preS衍生肽P的C末端修飾，其優選為可以防止降解的選自下組的部分醯胺、D 胺基酸、被修飾的胺基酸、環狀胺基酸；天然的和合成的聚合物比如PEG、聚糖，n是0或者至少是1。
2.如權利要求1所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，H是醯基化的疏水性 修飾，所述醯基化選自於用豆蔻醯(C14)、棕櫚醯(C16)或者硬脂醯(C18)的醯基化。
3.如權利要求1或2所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，H和/或R通過 連接物或隔離物與P連接。
4.如權利要求1至3中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，P包含 SEQ ID NO. 1中的至少20個連續的胺基酸的N-末端和/或C-末端截斷型變體。
5.如權利要求1至4中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，P包含 SEQ ID NO. 1的變體，所述變體具有選自下組的胺基酸序列如SEQ ID NO. 1中顯示的HBV preS共有序列中的胺基酸殘基2至21、殘基5至21、殘基5至15或殘基9至15。
6.如權利要求1至5中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，P不包 含在SEQ ID NO. 1中的殘基9至15上、優選在SEQ ID NO. 1中的殘基9至22上的胺基酸 置換和/或缺失。
7.如權利要求1至6中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，P包含 SEQ ID NO. 1的變體，所述變體具有不同病毒種類、菌株或者亞型的胺基酸序列、優選HBV基 因型或捲毛猴HBV (WMHBV)的胺基酸序列或者其變體。
8.如權利要求7所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，P包含選自SEQ IDNOs. 2至10的胺基酸序列或者其變體。
9.如權利要求1至8中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，P包含 選自SEQ ID NOs. 11至20的胺基酸序列或者其變體。
10.如權利要求1至9中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，SEQID NO. 1中的胺基酸殘基20至23被修飾，優選通過胺基酸置換而被修飾；並且/或者胺基酸 殘基26至32被修飾，優選通過胺基酸置換而被修飾。
11.如權利要求10所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，SEQID NO. 1中的 胺基酸殘基20至23通過丙氨酸胺基酸置換而被修飾，優選被修飾成基序APAF。
12.如權利要求10或11所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，SEQID NO. 1 中的胺基酸殘基26至32通過丙氨酸胺基酸置換而被修飾，優選被修飾成基序NANAPDW或 者 NAAAPDW。
13.如權利要求10至12中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，P包 含選自SEQ ID NOs. 21至28的胺基酸序列或者其變體。
14.如權利要求1至13中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，P包 含選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 20，優選選自 SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ IDN0. 4。
15.如權利要求14所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，H是用豆蔻醯(C14) 或者硬脂醯(C18)、優選用硬脂醯(C18)進行醯基化的疏水性修飾。
16.如前述權利要求中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，P包含 SEQ ID N0. 12中的至少10個連續的胺基酸殘基，優選包含SEQ ID N0. 12中的至少15或 20個連續的胺基酸殘基，更加優選地，包含於P中的SEQ ID N0. 12中的連續的胺基酸殘基選自下組SEQ IDN0. 12中的胺基酸殘基9至15、胺基酸殘基2至15、胺基酸殘基9至18、胺基酸殘基2至 18、胺基酸殘基2至20、胺基酸殘基2至21、胺基酸殘基5至21、胺基酸殘基2至25、氨基 酸殘基2至30、胺基酸殘基2至35、胺基酸殘基2至40、胺基酸殘基2至45和胺基酸殘基 2 至 46。
17.如前述權利要求中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，P包含選 自下組的胺基酸序列-包含SEQ ID N0. 12中的胺基酸殘基2至15和與其相鄰的SEQ ID N0. 12中的胺基酸 殘基16至48的衍生物的胺基酸序列；-包含SEQ ID N0. 12中的胺基酸殘基2至20和與其相鄰的SEQ ID N0. 12中的胺基酸 殘基21至48的衍生物的胺基酸序列；-包含SEQ ID N0. 12中的胺基酸殘基2至25和與其相鄰的SEQ ID N0. 12中的胺基酸 殘基26至48的衍生物的胺基酸序列；-包含SEQ ID N0. 12中的胺基酸殘基2至30和與其相鄰的SEQ ID N0. 12中的胺基酸 殘基31至48的衍生物的胺基酸序列；-包含SEQ ID N0. 12中的胺基酸殘基2至35和與其相鄰的SEQ ID N0. 12中的胺基酸 殘基36至48的衍生物的胺基酸序列；-包含SEQ ID N0. 12中的胺基酸殘基2至40和與其相鄰的SEQ ID N0. 12中的胺基酸 殘基41至48的衍生物的胺基酸序列；以及-包含SEQ ID N0. 12中的胺基酸序列的胺基酸序列；其中衍生物包含至少一種選自下組的修飾胺基酸置換、胺基酸缺失、被修飾的氨基 酸、非天然的胺基酸或者擬肽類，其中至少一種修飾是1、2、3、4、5種或更多種的修飾。
18.如前述權利要求中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，P包含SEQ ID NO. 12中的胺基酸序列或者有至少10個連續胺基酸的該序列的N-或/和C-末端 截斷型變體，或者包含被修飾的胺基酸、非天然的胺基酸或擬肽類的其衍生物。
19.如權利要求16或19所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，H是用豆蔻醯 (C14)或者硬脂醯(C18)、優選用豆蔻醯(C14)進行醯基化的疏水性修飾。
20.如權利要求1至18中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，所述 preS衍生肽帶有標記物，所述標記物優選選自螢光染料、放射性同位素和對比劑。
21.如權利要求1至19中任一項所述的疏水性修飾的preS衍生肽，其特徵在於，所述 preS衍生肽與一種肽或者蛋白融合，所述肽或者蛋白優選選自白蛋白和人IgG的Fc結構 域。
22.—種藥物組合物，其包含至少一種如權利要求1或21中任一項所述的HBV的疏水 性修飾的preS衍生肽和可選擇的藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
23.如權利要求1或21中任一項所述的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者如權利 要求22所述的藥物組合物用於診斷、預防和/或治療疾病。
24.如權利要求1或21中任一項所述的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者如權利 要求22所述的藥物組合物用於抑制HBV和/或HDV感染。
25.如權利要求1或21中任一項所述的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者如權利 要求22所述的藥物組合物用於預防原發性HBV和/或HDV感染。
26.如權利要求24或25所述的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物，其 特徵在於，HBV的任何基因型的HBV感染都被抑制或被預防。
27.如權利要求24或25所述的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物作為 HBV和/或HDV的進入抑制劑。
28.如權利要求1或21中任一項所述的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者如權利 要求22所述的藥物組合物用於治療B型肝炎和/或丁型肝炎，尤其是乙型慢性肝炎和/或 丁型慢性肝炎。
29.如權利要求24至26中任一項所述的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組 合物，其特徵在於，其包含有效治療量的如權利要求1或20中任一項所述的HBV的疏水性 修飾的preS衍生肽或者如權利要求21所述的藥物組合物。
30.如權利要求29所述的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物，其特徵在 於，所述有效治療量的範圍是每kg體重10 μ g至lmg，優選地是10 μ g至100 μ g。
31.如權利要求29或30所述的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者藥物組合物，其 特徵在於，給藥途徑選自下組皮下的、靜脈內的、口服的、鼻腔的、肌內的、經皮的、吸入式 的、栓劑型的。
32.如權利要求1或21中任一項所述的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽或者如權利 要求22所述的藥物組合物的應用，用於製造抑制HBV和/或HDV感染、預防原發性HBV和 /或HDV感染和/或治療B型肝炎和/或丁型肝炎的藥物。
33.一種疫苗組合物，其包含至少一種如權利要求1或21中任一項所述的HBV的疏水 性修飾的preS衍生肽和可選擇的藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
34.如權利要求33所述的疫苗組合物，其特徵在於，其包含有效治療量的至少一種如 權利要求1或21中任一項所述的HBV的疏水性修飾的preS衍生肽。
全文摘要
本發明涉及B型肝炎病毒(HBV)的疏水性修飾的preS衍生肽，該preS衍生肽來源於HBV preS共有序列並且其N末端優選被醯基化以及C末端可選的被修飾。這些HBV的疏水性修飾的preS衍生肽是非常有效的HBV進入抑制劑以及HDV進入抑制劑，因此適用於HBV和/或HDV感染的抑制、HBV和/或HDV原發感染的預防以及(慢性)B型肝炎和/或丁型肝炎的治療。本發明進一步涉及包含這些HBV的疏水性修飾的preS衍生肽的藥物和疫苗組合物。
文檔編號C07K14/02GK101970464SQ200980103167
公開日2011年2月9日 申請日期2009年1月26日 優先權日2008年1月25日
發明者史蒂芬·厄本, 沃爾特·米爾 申請人:魯普萊希特-卡爾斯-海德堡大學